Mikro Termoforesis kullanarak ATP bir aptamer Bağlama Sitesi Haritalama

Özet

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Özet

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

Giriş

moleküller arasındaki etkileşim doğasının temelidir. Bu nedenle, temel ve uygulamalı araştırma birçok alanda bilim farklı moleküler etkileşimlerin temel ilkelerini anlamaya çalışın. Mikro Termoforesis (MST) tamponların bir özgür seçim ile, çözelti içinde moleküler etkileşimlerin hızlı, hassas, düşük maliyetli ve kalite kontrollü karakterizasyonu gerçekleştirmek için bilim adamları sağlar. Birden fazla bağlanma ortakları ^1-8 ile olay doğrulamaları, rekabet deneyleri ve deneyleri bağlayıcı, kütüphane taramaları da dahil olmak üzere analizler farklı türde anlatan, yalnız 2016 den, MST kullanarak 1000'den fazla yayın zaten vardır. Genel olarak, MST, moleküler etkileşimin herhangi bir bağlanma afinitesi (mM'ye pM), stokiyometri ve termodinamik, klasik bağlanma parametreleri, çalışmasına izin verir. MST büyük bir avantajı etkileşimi mümkün boyutundan bağımsız bağlayıcı olayları incelemek için yeteneğidir. hatta çal'ıBu küçük moleküller, ilaçlar, antibiyotikler, veya metabolitler olarak zorlu bir yöntem, küçük nükleik asit aptamerler arasındaki etkileşimler (nt 15-30) ve hedefler belirlenebilir.

Güncel state-of-the-art teknolojileri aptamer hedef etkileşimleri laboratuvar yoğun ve son derece karmaşık ya vardır karakterize ya da aptamer-küçük molekül ^9,10 etkileşimleri ölçmek için başarısız. Plasmon Rezonans (SPR) deneyleri ^11,12 ve İzotermal Titrasyon Kalorimetre (ITC) ^13-15, izokratik elüsyon ^16, denge fi ltration ^17,18 olarak gerçekten etiket içermeyen Kalorimetre yaklaşımları, tabanlı Surface, in-line ¹⁹ Jel- sondalama deneyleri vardiya, Durduğunuz akış fl uorescence spektroskopisi ^20,21, floresan anizotropi (FA) ^22,23, tek-molekül fl uorescence görüntüleme ^24,25 ve Bio-katmanlı enterforemetre (BLI) ²⁶ de aptamer-küçük molekül ile kesin olmayan veya uyumsuz ya vardır etkileşimleri. diğer principaBu yöntemlerin l sorunları düşük duyarlılık, yüksek numune tüketimi, hareketsizlik, yüzeylerde toplu taşıma sınırlamalar ve / veya tampon kısıtlamaları vardır. Bu teknolojilerin sadece birkaç toplama ve adsorpsiyon efektleri için entegre kontroller sağlar.

MST bilim adamları bu tür proteinlerin ^30-33 olarak aptamers ve küçük moleküllerin ^27-29 arasındaki etkileşimleri, yanı sıra diğer hedefleri incelemek için bu sınırlamayı aşmak için için güçlü bir araç temsil eder. Teknoloji sıcaklık değişimleri ile moleküllerin hareketine dayanır. Olarak adlandırılan bu yönlendirilmiş hareket, "Termoforosis," molekülün ^34,35 büyüklüğüne, ücret ve hidrasyon kabuğu bağlıdır. moleküle bir ligand bağlanmasının doğrudan değiştirildi thermophoretic hareket ile sonuçlanan, aşağıdaki parametrelerden en azından birinin değiştirecektir. Küçük boyutları ile ligandlar bağlı duruma bağlanmamış gelen boyut değişim açısından önemli bir etkiye sahip olmayabilir, ama onlar dr olabilir hidrasyon kabuğu ve / veya şarj amatic etkiler. Bağlama ortağı ile etkileşim sonrası moleküllerin thermophoretic hareketinde değişiklik temel bağlanma parametreleri ^2,7,34,36,37 ölçülmesini sağlar.

Şekil 1A 'de gösterildiği gibi, MST cihazı flüoresan tespiti için aynı optik kullanılarak cam kılcal olan numune üzerine odaklanmış bir kızıl ötesi lazer oluşur. Lazer sıcaklık gradyanı (2-6 ° C DT) kurarken tryptophans ⁶ ya da flüoresan bir etkileşim, ortak olarak ^3,8 arasında içsel fl uorescence ile proteinlerin thermophoretic hareketi izlenebilir. Boşluk, DT, içinde sıcaklık farkı Soret ile belirlenebilir yüksek bir sıcaklıkta alanında azalması veya molekül birikmesine yol açar, Katsayı _(St):

g "/>

C _sıcak ısıtılmış bölgede konsantrasyonunu temsil eder, ve _{C, soğuk} ilk olarak soğuk bölge konsantrasyonudur.

Şekil 1B, ilgili zaman dilimlerinde ayrılabilir farklı aşamalarında oluşan MST hareket profilinin (zaman iz), tipik bir MST deney sonuçları gösterildiği gibi. başlangıç ​​floresans kesin bir başlangıç ​​floresans tanımlamak ve ışıkla ağartma ya photoenhancement kontrol etmek için sıcaklık gradyanı yokluğunda yer alan birinci 5 saniye cinsinden ölçülür. Sıcaklık Jump (T-Jump) hangi floresan değişiklikleri thermophoretic hareketinden önce safhasını oluşturuyor. floresanstaki bu ilk azalma kuantum verimi uorophore fl ısıya bağlı değişikliklere bağlıdır. Termoforosis aşaması nedeniyle sabit durum dağılım kadar molekül thermophoretic hareketine flüoresans azalır (veya artar) ulaşıldığında edildiği izler.Lazer kapatıldıktan sonra Şekil 1B gösterildiği gibi ters TJump ve BM uorescent moleküllerin beraberinde geri difüzyon gözlenebilir. Temel bağlanma parametreleri erişmek için, etkileşim ortakları farklı molar oranları incelenmiş ve karşılaştırılmıştır. Optik görebilir molekülü sabit tutulur ve etiketlenmemiş ligandın artan bir miktarı ile temin edilir ise tipik olarak, 16 farklı oranlar bir MST deneyde incelenmiştir. İki bağlanma ortakları arasındaki etkileşim Termoforosis değişiklikleri uyarır ve bu nedenle normalize fl uorescence olarak aşağıdaki şekilde hesaplanır F _norm:

F _sıcak ve F _soğuk MST izleri de fi ned zaman noktalarında fl uorescence yoğunlukları ortalama temsil eder. Bağlanma ilgileri _(Kd ve _EC50 değerleri) Curv hesaplanabilire uydurma (Şekil 1C).

Genel olarak, MST her türlü moleküler etkileşimleri çalışmak için güçlü bir araçtır. ve 25-nt kısa ssDNA aptamer DH25.42 (7.9 kDa); Bu yazının küçük molekül adenozin trifosfat (0.5 kDa ATP) arasındaki zorlu etkileşimi karakterize bir protokol sunar. Yazının boyunca ATP molekülü üzerindeki aptamer bağlanma yeri ATP adenin grubuna aşağı eşleştirilir.

Protokol

Aptamer Çalışma Stok 1. Hazırlık

1. Üreticinin talimatlarını takip ve 100 uM nihai konsantrasyon ulaşan su ⁽¹⁸ referans 5-Cy5 CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, sıra) oligonükleotidi çözülür.
2. Bağlama tamponu ile 200 nM oligonükleotid stokları seyreltilerek aptamer çalışma çözeltisi hazırlayın (20 mM Tris, pH 7.6, 300 mM NaCI, 5 mM _MgCl2,% 0.01 Tween 20).
3. 90 ° C'de 2 dakika süreyle inkübe karışımı Numune hemen buz üzerinde soğuması ve oda sıcaklığında örneğini kullanır.

Ligand seyreltme serisi 2. hazırlanması

1. ) SAM (her ligandın (adenozin trifosfat (ATP), adenosin difosfat (ADP), adenosin monofosfat (AMP), adenin, guanosin trifosfat (GTP), sitosin trifosfat (CTP) deoksiadenosin trifosfat (dATP), ve S-adenosil metiyonin ; 10 mM stok her), bir 16 adım seri diluti hazırlamaküzerinde 200 ul mikro reaksiyon tüpleri.
   NOT: agrega kaldırmak için yardımcı olabilir 14.000 xg'de 5 dakika boyunca ligand stoklarının Santrifüj. Düşük hacimli, düşük bağlanma reaksiyon tüpleri tüp duvarları moleküllerin adsorpsiyonu önlemek için tavsiye edilir.
2. Tahmini yakınlığından daha yüksek, en az 50 kez maksimum konsantrasyonu ile başlar ve her seyreltme basamağında% 50 lıgand konsantrasyonunu azaltır.
   NOT: Kontrol yazılım uygulanan konsantrasyon bulma aracı bağlama verileri taklit ve seyreltme serileri için doğru konsantrasyon aralığı bulma yardımcı olur.
3. 16 mikro tepkime tüpleri içine 2 aptamer bağlanma tamponu 10 ul ekle borunun 1 ligand stok (10 mM) 20 ul doldurun.
4. Transferi 10 tüp 2 tüp 1 ul ve yukarı pipetleme ve birkaç kez aşağı düzgün karıştırın. Bir sonraki tüp 10 uL aktarın ve kalan tüpler için bu seyreltme tekrarlayın.
5. Son tüpten 10 ul fazlalığı atın. Herhangi b önlemekUffer dilüsyon etkisi. tüp 1 ve tüpler 2-16 tampon aynı olmalıdır.

Nihai reaksiyon karışımı 3. hazırlanması

1. Pipetleme hatalarını en aza indirmek için, bireysel bağlama 20 | il hacminde reaksiyonları (aptamer hazır çözelti + ilgili ligand seyreltme 10 ul, 10 ul) hazırlayın. Sadece 4 ul bir hacim kılcal ll fi oluşturulmasına yeterli olduğunu.
2. Her bir bağ seyreltme 10 ul 200 nM aptamer çalışma çözeltisinin 10 ul ilave edin ve pipetleme ve birkaç kez aşağı doğru karıştırılır.
3. numune içine kılcal damarların batırarak standart kılcal damarların içine numunelerin ll oda sıcaklığında ve fi 5 dakika boyunca örnekleri inkübe. Daha uzun inkübasyon süreleri, bazı etkileşimler için gerekli olabilir; Bununla birlikte, 5 dakika için en uygundur. DEĞİL optik ölçüm alınacak orta kısmında, üzerinde, sadece tarafta kılcal dokunun.
4. th üzerine kılcal yerleştirine kılcal tepsisi ve MST cihazı başlatmak.

4. MST Cihazı Başlangıç

NOT: Cihaz iki önceden yüklenmiş yazılım paketlerini, üretilen verilerin yorumlanması için yazılımın ' "' analiz kontrolü deneysel koşullar ve teknik kurulumu için yazılım '" sağlar.

1. MST cihazın içine kılcal tepsisini yerleştirmeden önce, kontrol yazılımını başlatmak ve 'açılır menüden' " 'sıcaklık kontrolü de" el sıcaklık kontrolü sağlamak' seçerek genel istenilen sıcaklığa ayarlayın. Bu şekilde, 25 ° C'ye kadar sıcaklık ayarlayın.
   Not: MST araçlar ısı kontrollü, 45 ° C 22 arasında olabilir.
2. Beklenen seviyeye ulaşmak için sıcaklık bekleyin ve ardından MST cihazın içine kılcal tepsiye yerleştirin.
3. Cy5 boyalar için "kırmızı 'LED kanalı ayarlamak ve bir fl uorescenc kazanmak için LED güç ayarlamakStandart sensör MST cihaz 300 ila 1000 floresans birimleri e sinyali. % 25 LED güç bu çalışmada kullanılmıştır.
   NOT: 6,000 18,000 floresan üniteleri yüksek hassasiyetli sensörü ile MST için tavsiye edilir.

5. Kılcal Tarama

1. "Kontrol" yazılım üzerinde kılcal konumunu seçme ve tıklayarak numunenin farklı kalite yönlerini kontrol etmek için bir kılcal taraması yürütmek "kap tarama başlatmak" MST ölçümü başlamadan önce.
2. floresan geliştirme / söndürme ve yazılım sokma etkileri (zirveleri U-şeklinde veya düzleştirilmiş) için kılcal taraması kontrol edin.
   Not: algılama ve floresan işlenmesi ve yapışma etkileri hakkında daha fazla ayrıntı tartışma bulunabilir.

6. MST Ölçümü

NOT: MST ölçümü başlamadan önce, dışlamak emin olun yapışmasını etkileri, geliştirme / söndürme etkisi, ya dapipetleme hataları ve kılcal tarama fl uorescence sinyali oluşturulmasına yeterli olduğunu gösterir emin olun. Daha fazla bilgi için, tartışma bakın.

1. . '' Kontrolü "yazılım ilgili kılcal konumuna sulandırma dizileri 'nden ligand konsantrasyonları atama aptamer liganda karıştırma seyreltme adım olarak (1: 1).
2. Kılcal # 1 için ligand yüksek konsantrasyon (5 mM) doğru olarak girin seyreltme türünü seçin (burada, 1: 1), maksimum konsantrasyon tıklayın ve otomatik kılcal kalan konsantrasyonlarını # 2- atamak için sürükle işlevini kullanın 16. düşük konsantrasyon 152.6 nM'dir.
3. kontrol yazılımı ilgili bölümündeki fl uorescent aptamer (burada, 100 nM) konsantrasyonunu girin.
4. 5 sn fl uorescence tespit varsayılan ayarları kullanın 30 sn MST kayıt ve lazer t inaktivasyonu sonra başka bir 5 saniye floresan kayıt o moleküllerin geri emilimini izlemek.
5. kontrol yazılımı ilgili bölümündeki% 20 lazer gücünü ayarlayın.
   NOT: sipariş en iyi sinyal-gürültü oranını almak ve belirsiz etkileri önlemek için ise,% 20-40 bir lazer güç tavsiye edilir. Belirli durumlarda, daha yüksek bir lazer gücü bağlanmamış ve bağlanmış moleküller, iyi bir ayırma için gerekli olabilir.
6. Hedef klasörü seçtikten sonra deney kaydedin ve 'Başlat MST ölçümü "düğmesine basarak MST ölçümü başlatmak.
   NOT: .ntp dosyası hedef klasörde oluşturulur. Bu kurulumu kullanarak, bir ölçüm 10-15 dakika sürer.
7. _EC50 değeri daha doğru bir şekilde belirlenmesi için en az iki kez deney prosedürü tekrarlayın.
   Not: Teknik tekrarlanabilirliğini test etmek amacıyla, aynı kılcal taranabilir birkaç kez (Teknik tekrarlar).

7. MST Veri Analizi

nt "> Not: analiz yazılımı ölçüm sırasında fl y ilişkin verilerin analizini sağlayan analiz yazılımı ligand konsantrasyonu ³⁷ karşı MST zaman izleri ve normalize fl uorescence (F _norm) değişiklikleri çizer..

1. MST analiz yazılımı (MO.Affinity Analizi) başlatın ve hedef klasörden .ntp dosyasını yüklemek. veri seçme menüsünde analiz türü olarak "MST" i seçin.
   Not: liganda bağımlı floresans etkileri durumunda, başlangıç ​​floresans analizi için seçilebilir.
2. sürükle-bırak yöntemiyle veya ilgili deneysel çalışma altındaki "+" düğmesine basarak yeni bir analize ilgili teknik veya biyolojik run (ler) ekleyin.
3. Deneyin, MST izleri, kılcal tarama, kılcal şekli, ilk floresan ve ağartma oranı özellikleri hakkında bilgi edinmek için ilgili deneysel çalışma Aşağıdaki bilgiler düğmesine basın.
   NOT: Bu ham veriler can albu yüzden analizin daha sonraki adımlarda kontrol edilmelidir.
4. Görme görünür darbelere ve ani olarak toplama ve yağış etkilerinden MST izleri, kontrol edin.
   NOT: algılama ve toplama etkilerinin aktarılması konusunda daha fazla bilgi için, tartışma okudum.
5. Görme düzleştirilmiş ya da U-şekilli zirveleri olarak görünür kılcal tarama ve adsorpsiyon etkileri kılcal şekil bindirme, kontrol edin. Görme kılcal tarama ve floresan efektleri için ilk floresan inceleyin. Görme etkileri photobleaching için ağartma oranını kontrol edin.
6. doz-yanıt moduna geçin ve ilgili düğmeye basarak kadar "uzman" mod analizi ayarını değiştirin. MST değerlendirme stratejisi olarak "T-Jump" seçeneğini seçin.
7. eğri fi tting için "Tepe" modelini seçin. bağlayıcı parametreleri otomatik olarak hesaplanacaktır. "Sonuçları karşılaştırmak" menüsünden normalleşme ilgili türünü seçerek veri normalleştirmek. ihracatBir .xls veya .pdf gibi ya veri.
   NOT: bağlayıcı grafiğin Aşağıdaki tabloda hesaplanan bağlanma parametreleri özetlemektedir.

Sonuçlar

Bu çalışmada, MST ATP DH25.42 DNA aptamer ¹⁸ bağlanma sitesi karakterize etmek için uygulanmıştır. ATP veya rasgele bir veya daha fazla fluorophores ^38-40 ile etiketlenmiş proteinler ile küçük moleküller ATP'ye taklit etkileşimlerini karakterize eden başka çalışmalardan farklı olarak, bu çalışma 5'ucundaki bir Cy5 molekülü ile 7.9 kDa ssDNA aptamer etiketlenmiş bir versiyonunu içerir . Farklı ATP türevlerinin ve ilgili moleküller...

Tartışmalar

Kalite kontrolleri:

Spesifik olmayan yapışma / yüzeylere örnek malzeme, hem de çekiş etkileri adsorpsiyon, afinite verinin kalitesi üzerinde önemli bir etkisi vardır. Ancak, sadece bir kaç state-of-the-art teknolojileri izlemek ve bu etkilerden kaçınmak için doğru ve hızlı seçenekler sunuyoruz. MST algılar ve teknik kurulum adım adım optimizasyonu sağlayan, bu sorunların üstesinden gelmek için yardımcı entegre kalite kontrolleri sunmaktadır. toplama / yağış etkiler...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aptamer binding buffer			20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer	IDT, Leuven, Belgium		sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich, Germany	A2383	10 mM stock solutions stored at - 20 °C
ADP	Sigma Aldrich, Germany	A2754	10 mM stock solutions stored at - 20 °C
AMP	Sigma Aldrich, Germany	A2252	10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Adenine	Sigma Aldrich, Germany	A8626	10 mM stock solutions stored at - 20 °C
SAM	Sigma Aldrich, Germany	A7007	10 mM stock solutions stored at - 20 °C
dATP	Sigma Aldrich, Germany	11934511001	10 mM stock solutions stored at - 20 °C
CTP	Sigma Aldrich, Germany	C1506	10 mM stock solutions stored at - 20 °C
GTP	Sigma Aldrich, Germany	G8877	10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies, Munich, Germany	MO-G008	Blue/Red Channel MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector
Monolith NT.115 capillaries Standard	NanoTemper Technologies, Munich, Germany	MO-K002
Eppendorf PCR tubes	Eppendorf, Germany	30124537
Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device	NanoTemper Technologies, Munich, Germany
MO.affinity analysis v2.1.1	NanoTemper Technologies, Munich, Germany
Kaleidagraph 4.5.2	Synergy Software