Egzersiz Koşullandırılmış Serum İle Ligament Yapılarının Tedavisi: Bir Translasyonel Doku Mühendisliği Modeli

Özet

Üç boyutlu yapıların insan egzersize şartlandırılmış serum ile muamele edildiği ve kollajen içeriği, fonksiyonu ve hücre biyokimyası için analiz edildiği bir ligament doku modeli sunuyoruz.

Özet

Biyolojik mekanizmaları anlamak için in vitro deneyler gereklidir; Bununla birlikte, tek katmanlı doku kültürü ve insan fizyolojisi arasındaki boşluk büyüktür ve bulguların çevirisi genellikle zayıftır. Böylece, alternatif deneysel yaklaşımlar için geniş bir fırsat var. Burada insan hücrelerinin insan ön çapraz bağ dokusu kalıntılarından izole edildiği, kültürde genişlediği ve mühendisliğe tabi tutulmuş bağlar oluşturduğu bir yaklaşım sunuyoruz. Egzersiz, birçok dokunun, organların ve vücut süreçlerinin işlevinin geliştirilmesi için kandaki biyokimyasal ortamı değiştirir. Bu deneyde, bağ yapılandırma kültürü ortamı, egzersiz yoluyla 'şartlandırılmış' deneysel insan serumu ile takviye edilmiştir. Dolayısıyla, deneysel bir doku, bağlanma proteinleri ve ek aktiviteleri ile birlikte değiştirilebilen ek bileşikler de dahil olmak üzere, tam endojen biyokimyasal çevrenin etkisine maruz kaldığından, müdahale daha biyolojik olarak ilgilidir.Bilinmeyen temsilci. Tedaviden sonra mühendisli ligamanlar mekanik fonksiyon, kollajen içeriği, morfoloji ve hücresel biyokimya için analiz edilebilir. Genel olarak, burada sunulan ligament dokusunun fizyolojik modelinin geleneksel tek tabaka kültürü ve hayvan modellerine göre dört ana avantajı vardır. Birincisi, ligaman yapıları üç boyutludur ve nihai çekme gerilmesi, maksimum gerilme yükü ve modül gibi sayısallaştırılacak mekanik özelliklere ( yani , fonksiyona) izin verir. İkincisi, boney ve sinüse unsurları arasındaki arayüz olan entez, ayrıntılı ve fonksiyonel bağlamda incelenebilir. Üçüncü olarak, medyayı egzersiz sonrası serum ile hazırlamak, egzersizin sağlığa etkilerinin geniş bir yelpazesinden sorumlu olan egzersize bağlı biyokimyasal çevrenin etkisini tarafsız bir şekilde araştırmaya olanak tanır. Son olarak, bu deneysel model, bilimsel araştırmaları insani ve ahlaki bir yaklaşımla,Hayvanlar, Ulusal Sağlık Enstitüsünün temel yetkisi, Hastalık Kontrol Merkezi ve Gıda ve İlaç İdaresi.

Giriş

Tendon ve bağ yaralanmaları yaygındır ve normal hareketlilik ve yaşam kalitesi üzerinde zayıflatıcı sonuçlar doğurabilir. Cerrahi müdahale genellikle gereklidir ancak sınırlı ve çeşitli başarılara sahip olabilir ^{4 , 5} . Tendonların ve bağların nasıl geliştiğini, olgunlaştığını ve hasara yanıt vermenin nasıl olduğu konusunda mevcut anlayış eksiktir ve bu nedenle daha etkili tedavilerin geliştirilmesine ilişkin fikir edinmek için etkili araştırma modellerine ihtiyaç vardır ⁵ . Bu bilgi boşluğuna değinmek için hayvan modelleri kullanılabilir, ancak in vivo çalışmalar doğal olarak çevreyi kontrol etme ve hedeflenen dokuya doğrudan müdahale etme zorluğu ile karmaşıktır. Buna karşılık, deney ortamı , geleneksel tek tabaka hücre kültürü ile in vitro olarak kolayca kontrol edilebilir ve izlenebilir. Bununla birlikte, bu teknik, kimyasal ve mekanik çevreyi basitleştirmeyebilir ve bu nedenle tekrarlayıcı olmayabilirGeç hücrelerin in vivo davranış. Doku mühendisliği, in vitro ortamın kontrolü ile hayvan modellerinde kompleks in vivo ortamın avantajlarıyla evlenebilir ve fizyolojiyi incelemek için ek bir araç sağlar. İlave olarak, bağ gelişimi hakkında daha iyi bir anlayışa sahip olan silahlı doku mühendisliği, cerrahi rekonstrüksiyon gerektiğinde greft dokusu sağlayabilir ⁶ . Bu nedenle, burada açıklanan yöntem, ligaman işlevini ve morfolojisini incelemek için kullanılabilen bir in vitro 3D mühendislik dokusunu doğrular.

Fibrin esaslı tendon veya ligaman yapıları, kollajen fibrilogenezisi ⁷ ve tendon gelişimi ⁸ gibi fizyolojik işlemleri incelemek için bir in vitro model olarak kullanılmış ve aynı zamanda, greft dokusu olarak yararlanılmasının, ön kuzu koyun modelinde değerlendirildiği translasyon uygulamalarıCiate ligaman (ACL) rekonstrüksiyonu ⁹ . Laboratuvarımız daha önce iki fırçayla, kalsiyum fosfat kemik ikame edici malzeme, çimento çapa üzerinde uzanan üç boyutlu bir bağ modeli kurdu. Bu model, kültür ortamını biyolojik faktörler ¹⁰ ile takviye ederek veya mekanik stimülasyon ¹¹ uygulayarak kolaylıkla farklı deney koşullarına tabi tutulabilir. Önemlisi, bu kemikten kemik bağ modeli, yaralanmaya duyarlı olan boney ve sinir elemanları arasındaki arayüzün sentezinin derinlemesine analizine olanak tanır.

Çalışmada burada bu metodolojiyi sunmak için 1 vurgulandı, biyokimyasal çevredeki egzersiz kaynaklı değişikliklerin ligaman fonksiyonu üzerine olan ilgisi üzerinde durduk. Egzersiz vücudun her yerinde çeşitli dokulardaki hücresel ve organ fonksiyonlarını geliştirir ^{2 , 3 , 12} , çeşitli bilinen (örneğin IL-6 ¹³ , IL-15 ¹⁴ , Meteorin benzeri ¹⁵ , eksosomlar ^{16 , 17} ) salınımına atfedilebilecek bir etki ve sistemik dolaşıma salınan diğer bilinmeyen biyokimyasal faktörler . Ayrıca, egzersiz sonrası biyokimyasal ortam salınım bezlerinin sempatik sinir sistemi uyarımı ( örneğin , adrenal bezin 18'inden kortizol ve katekolaminler ve ön pitüiter ^19'un büyüme hormonu) tarafından uyarılan egzersiz yanıtlı hormonlarla zenginleştirilmiştir ). Bununla birlikte, n vivo olarak , egzersizin mekanik uyarımının egzersize bağlı biyokimyasal değişikliklerden etkilenme ayrımını yapmak imkansızdır. Bazı çalışmalar, egzersize yanıt olarak bazı dolaşımdaki hormonların ve sitokinlerin beklenen yükselişini karakterize ederkenE yukarıda belirtildiği gibi, in vitro olarak sadakatle tekrarlanan çok sayıda faktör bilinmektedir ve bilinmemektedir . Yani, bir in vitro çalışma için birkaç faktörün izole edilmesi, biyokimyasal tepkinin karmaşıklığına yetersiz şekilde hitap etmektedir. Bu çalışmada, egzersizle tetiklenen serum biyokimyasal ortamdaki değişikliklerin mühendisli ligament fonksiyonunu nasıl etkilediğini araştırdık. Biyokimyasal değişikliklerin etkilerini izole etmek için, bir direnç egzersizinden önce ve sonra insan katılımcıdan serum elde ettik ve insan ön çapraz bağ (ACL) fibroblastları kullanılarak oluşturulan 3D mühendislik yapıları tedavi ettik. Bu modeli kullanarak, mekanik özellikler ve kollajen içeriği üzerindeki etkileri içeren fonksiyonel veriler elde edebiliriz ve moleküler sinyalleme üzerindeki etkileri nicel olarak değerlendirebiliriz.

Protokol

Aşağıdaki prosedürler, University of California, Davis'in Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanan bir protokole uyarlar; Araştırmaya başlamadan önce yerel etik kuruluna danışın.

1. Primer Fibroblastları İnsan ACL Remnantlarından İzole Edin

NOT: Sterilizasyonu muhafaza edin ve tüm basamakları biyolojik güvenlik kabininde (BSC) yapın.

1. Aşağıda açıklandığı gibi insan dokularının toplanması ve kullanılması için uygun etik değerlendirme kurulundan onay alın.
2. 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 100x antibiyotik / antimikotik çözelti seyrelterek 5x antibiyotik / antimikotik (ABAM)
3. 50 mL'lik konik tüpteki 5X ABAM solüsyonunda ACL doku parçaları toplamak, sindirim basamağına kadar 4 ° C'de saklayın. Mümkün olan en fazla 1 x 1 x 1 cm ³ ebadında tıraşı bıçağı ile dokuları daha küçük parçalara kesin.
   DİKKAT: Yerel biyolojik tehlike yönetmeliklerineBiyolojik tehlike unsurlarının uygun şekilde kullanılması ve biyolojik tehlikeli atıkların dekontaminasyonu ve bertarafı.
4. Doku parçalarını batırmak için yeterli miktarda kollajenaz çözeltisi hazırlayın. 1x penisilin / streptomisin ve% 20 fetal sığır serumu (FBS) içeren yüksek glikoz Dulbecco modifiye Kartal ortamında (DMEM) kollajenaz tip II'yi (1 mg / mL) eritin ve 0.22 μm'de filtre edin.
5. PBS'de ACL dokusu 3 kez durulayın.
6. Sindirim dokusu. ACL dokusunu yeni bir 50 mL konik tüb haline getirin ve dokuyu batırmak için yeterli miktarda kollajenaz çözeltisi ekleyin. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin (~ 17 saat).
7. Sindirim süresi tamamlanmadan önce,% 10 FBS ve 100 U / mL penisilin ile DMEM yüksek glikoz medya ekleyerek büyüme ortamı (GM) hazırlayın.
8. Sindirim süresi tamamlanmadan 15 dakika önce, doku içeren 50 mL tüpü her 5 dakikada bir 3 kez vorteksleyin.
9. 25 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, sindirilmiş dokuyu güçlü bir şekilde tritüre ederek tiDaha ileri gider ve hücreleri yerinden çıkarın.
10. 5 dakika 1,500 xg'de santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve 10 mL GM'de peleti tekrar süspanse edin.
11. 1.8-1.9 arasındaki adımları üç kez daha tekrarlayın.
12. Son santrifüje edildikten sonra, 5-10 mL GM'de peleti tekrar süspanse edin. Hemasitometre ile hücre sayımı yapmak için hücre süspansiyonundan küçük bir numune kullanın ve Tripan Mavisi kullanarak hücre yaşayabilirliğini değerlendirin.
13. Hücre süspansiyonunu plaka başına 3-4 x 10 ⁵ hücre yoğunluğunda 15 cm doku kültürü plakalarına yerleştirin.
14. 37 ° C'de ve% 5 C02'de muhafaza edilen steril inkübatörde% 70 birleşim olan kültür, her üç günde bir GM'yi değiştirir. 5 pasajda hücreleri kullanın veya saklayın (aşağıya bakın).
15. Gelecekteki kullanım için hücreleri dondurun.
    1. % 70 birleşme noktasındaki hücreleri aşağıdaki gibi deneyin. Ortamı aspire edin ve hücreleri PBS ile yıkayın. Doku kültürü plakalarının altını kaplayacak kadar önceden önceden ısıtılmış (37 ° C)% 0.05 tripsin ekleyin. Plakları kültür inkübatörüne yerleştirinHücreler ayrılıncaya kadar ~ 5 dakika bekletilir (doğrulanmış hücreler hafif bir mikroskop kullanılarak kayar). Hücreleri toplamak ve bir Şahin tüpüne dağıtmak için bir pipet kullanın.
    2. Hücrelere pelet santrifüjleyin ve% 20 FBS ve% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren DMEM yüksek glikoz ortamında hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Cryovials içine alikot hücre süspansiyonu ve en az 24 saat boyunca -1 ° C / dak'da soğutun. Dondurulmuş kriyovyalleri sıvı nitrojende depolayın.

2. Silikon Kaplı Tabakların Hazırlanması

1. 35 mm doku kültürü plakaları hazırlayın: Kapakları çıkarın ve açık plakaları düz bir yüzeye yerleştirin.
2. Üreticinin talimatlarına göre silikon elastomer kiti karıştırın.
3. 35 mm'lik plaka başına yaklaşık 2 mL boşaltmak için 10 mL'lik bir şırınga kullanın.
4. Silikonun oda sıcaklığında 2-3 gün boyunca iyileşmesine izin verin.

3. Fırça Çimento Çapaları Hazırlayın

1. Önceden, silikon içeren silikon ters kalıplar hazırlarız.Çapa oluşumu için. Geriye doğru kalıplar arzu edilen çapa şekli ve ebadına göre yapılabilir.
   1. Son çapanın istenen yüksekliğini ve çapını belirleyin. Bu protokol, 35 mm'lik bir doku kültürü çanağında, yaklaşık 3.25 mm çapında plastik silindirlerin yerleştirildiği, yaklaşık 6,5 mm'lik bir nihai kalıp yüksekliğine izin vererek, zanaat silikonundan oluşturulmuş ısmarlama bir kalıp kullanmaktadır. Son çapa boyutları yaklaşık 3-3.5 mm yüksekliğindedir ve yaklaşık 3.4 mm çapında ve çapağın tabanından 1.5 mm'lik bir çıkıntı çıkıntılıdır.
   2. Kalıp yapılacak 35 mm'lik bir çanağa sertleştirilmiş silikon ilave edin. Buna göre plastik silindirleri yerleştirin.
      NOT: Plastik silindirlerin boyutu, son çapaların çapını belirleyecektir. Plastik silindirlerin yerleştirilmesi ve kullanılan silikon miktarı, farklı yükseklikteki çapa üretmek üzere modifiye edilebilir. Kalıptaki kuyuların alt kısmı ile kalıpın alt kısmı arasındaki kalınlık dİğnenin çıpanın alttan çıkıp çıpanın daha sonra silikon kaplı çanak içinde sıkıca sabitlenmesine izin verebileceğini söyler.
   3. Silikonun sertleşmesine izin verdikten sonra plastik silindirleri çıkarın ve kalıbı 35 mm'lik çanaktan çıkarın.
2. 3.5 M ortofosforik / 100 mM sitrik asit çözeltisi hazırlayın. 0.961 g sitrik asidi 11.5 mL ortofosforik asitle çözün. MilliQ su ile çözeltinin hacmini 50 mL'ye getirin. Çözeltiyi oda sıcaklığında saklayın ve ışığa karşı koruyun.
3. Kalıpları hazırlayın: Bir minutien pini her silindirik kuyunun ortasına kalıplara yerleştirin.
4. Buz üzerinde plastik tartım teknesinde β-trikalsiyum fosfat ve ortofosforik / sitrik asit çözeltisini 1 g / mL konsantrasyonda birleştirin.
5. Çimentoyu, plastik bir hücre kazıyıcı kullanarak kuvvetli bir şekilde karıştırın.
6. Karıştırmaya devam etmek için çimentoyu öğütmek ve pipet karışımını kalıba
7. Dolgulu kalıbı 1 dakika boyunca 2,250 x g'de santrifüjleyin.
8. Fırçasız çimento ankrajlarının gece boyunca oda sıcaklığında tutulmasına izin verin.
9. Ankrajları kalıptan çıkarın ve her silikon kaplı plakada 12 mm'lik iki çapa tutturun.
10. İğnelenmiş plakaları% 70 etanol püskürterek sterilize edin, hem tabakları hem de kapakları doldurun ve bir BSC'ye yerleştirin. En az 30 dakika sonra plakaları aspire edin ve kapakları değiştirin, gerekirse BSC'de saklayın.

4. İnsan Serumu Alınması

1. Bu protokol için uygun etik gözden geçirme kurulunun onayının alınmasını sağlayın.
2. Serumda istenen değişiklikleri etkileyecek belirli bir müdahaleye ( örn. , Egzersiz, gıda veya uyuşturucu müdahalesi) katılmak üzere insan deneklerinden yazılı bilgilendirilmiş onam alındığından emin olun. Burada, istirahatte ve direnç egzersinden 15 dakika sonra koleksiyonu açıklıyoruz.
3. Eğitimli bir phlebotomist kullanarak, venipunktür ile uygun bir boşaltma kabına bir katılımcının dinlendirici bir kan örneği alın.
4. Katılımcıların istenen egzersiz protokolüne girdikten sonra 15 dakika sonra bir egzersiz sonrası kan örneği toplayın. Daha önce tarif edildiği gibi ¹ , endogen biyokimyasal tepkiyi uyarmak için bu deneydeki direnç egzersiz protokolünü kullanın.
   1. Katılımcılar, setler arasında bir dakika dinlenme ile beş takım bacak basıncını gerçekleştirmelerini isteyin. Sonra, katılımcılara diz uzantıları seti ve arka arkaya egzersizleri setler arasında 1 dakika dinlendirerek arka arkaya egzersizleri tekrarlayarak ardışık olarak bir dizi hamstring kovası hazırlayın.
5. 1,500 xg'de 10 dakika santrifüj işleminden önce kan pıhtılaşmasına izin verin. Steril koşullar altında, gelecekteki medya takviyesi için (4 ° C'de saklanan serum) steril tüplere serum aktarın ve biyokimyasal analiz (-20 ° C'de saklanan küçük bir serum alikuotu).

5. Formlu Mühendislik Yapılı Ligaments

NOT: Önceden birincil fi'yi genişletBroblastlar ve silikon kaplı plakalar pinched brushite ankrajlarla hazırlanır.

1. Reaktifleri hazırlayın:
   1. Trombin hazırlayın. Sığır trombinini DMEM yüksek glikoz ortamında 200 U / mL'de çözün. 0.22 μm'de filtre edin, bölümler ve -20 ° C'de saklayın.
   2. Fibrinojeni hazırlayın. Sığır fibrinojenini DMEM yüksek glikoz ortamında 20 mg / mL'de çözün. Çözülmeye yardımcı olması için her 30 dakikada bir dönen 37 ° C'lik bir su banyosunda 3-4 saat inkübe edin. 0.22 μm'de filtre (çoklu filtrelere ihtiyaç duyulabilir), kısımlar ve -20 ° C'de saklayın.
   3. Aprotinin hazırlayın. Aprotinin 10 mg / mL su içinde eritilir. 0.22 μm'de filtre edin, bölümler ve -20 ° C'de saklayın.
   4. Aminoheksanoik asit hazırlayın. Suda 0.1 g / mL'de aminoheksanoik asit çözülür. 0.22 μm'de filtre edin, bölümler halinde ve 4 ° C'de saklayın.
   5. Askorbik asit hazırlayın. Askorbik asidi 50 mM'lik bir konsantrasyonda DMEM yüksek glikoz medyumunda eritin. 0.22 μm'de filtre edin ve 4 ° C'de saklayın.
   6. L-prolin hazırlayın. L-prolin 50 mM'lik bir konsantrasyonda PBS'de eritilir. 0.22 μm'de filtre edin ve 4 ° C'de saklayın.
   7. Transformasyon büyüme faktörü-β1 (TGF-β1) hazırlayın. TGF-β1'i üreticinin talimatlarına göre 10 μg / mL konsantrasyonda yeniden yapılandırın. -20 ° C'de birikip saklayın.
2. Deney için gerekli yapıların sayısını belirleyin ve yeterli sayıda tutturulmuş plakanın hazırlandığından emin olun. Hem biyolojik hem de teknik çoğaltılmalar önerilir. Burada vurgulanan çalışmada ¹ , yinelenen teknik çoğaltmaları ve 12 biyolojik çoğaltmayı (dinlenme ve egzersiz sonrası 12 kişiden oluşan serum) kullanın.
   NOT: BSC'deki steril koşullar altında aşağıdaki adımları uygulayın.
3. 15 cm plakalarda 70% konfluansa kültürle hücreleri genişletin. Yapı başına 2.5 x 105 hücre gereklidir.
4. 3.67 x 10 konsantrasyonda hücrelere Trypsinize ve GM'de tekrar süspansiyon haline getirin⁵ hücre / mL.
5. Gerekli yapıların sayısı için bir ana karışım oluşturun: 1 yapı için, ana karışım, 681 μL hücre süspansiyonu (2.5 x 105 hücre içeren), 29 uL trombin, 2 uL aprotinin ve 2 μL aminoheksanoik asit içerir.
6. Ana karıştırma maddesini iyice karıştırdıktan sonra, fırçalanmış çimento çapa etrafında 'şekil 8' paterninde her sabitlenmiş plakaya 714 μL ekleyin. Ana karışımın direklerin kenarlarıyla doğrudan temas ettiğinden emin olun.
7. Ana karışımı plaka boyunca eşit bir şekilde dağıtmak için her plakaya hafifçe dokunun.
8. Bir seferde tek bir tabağa 286 uL fibrinojeni bir damla şekli ile eşit bir şekilde bir tabak üzerine ilave edin ve plakayı hemen arkaya kaydırarak BSC'nin yüzeyi üzerine sallayın ve böylece fibrinojeni hücre gömülü fibrin jelleri oluşturmak üzere dağıtın. . Bir sonraki tabakaya geçin.
9. 37 ° C'de ve% 5 C02'de muhafaza edilen steril inkübatör içine yapıları yerleştirin ve inkübe edinFibrinojenin polimerizasyonuna izin vermek için en az 15 dakika süreyle.
10. Yapı başına 2 mL için yeterli besleme ortamı (FM) hazırlayın. GM'yi 200 μM askorbik asit, 50 μM prolin ve 5 ng / mL TGF-β1 ile tamamlayın.
11. Her bir yapıyı örtmek için 2 mL FM ekleyin. İnşaatı 37 ° C'de ve% 5 C02'de muhafaza edilen steril inkübatöre toplam 14 gün boyunca veya istenen bitiş noktasına kadar kültürleyerek, ortamı her saniye 2 mL FM ile yenileyerek kültürleyin

6. Çekme Testi Mühendislik Yapılı Ligaments

NOT: Çekme testi, PBS banyosunda özel yapılı bir çekme test cihazı kullanılarak gerçekleştirildi; Kuvvet çevirici ile birleştirilmiş ters kalıp tutmaçlar, fırçasız çimento çapalarını test sırasında yerinde tutar.

1. Ligamat yapılarının uzunluğunu ve genişliğini dijital kaliperleri kullanarak belirleyin; Dokunun kesit alanını hesaplar.
2. Bağ yapısını plakadan çözdükten sonra bağlayıcılarıTers kalıp kulplar, yapının PBS içine batırılmasını sağlar.
3. Yapı uzunluğunu başlangıç ​​uzunluğuna ayarlayarak, kavramalar arasındaki mesafeyi ayarlayın.
4. Teste başlayın: Yapıyı 0,4 mm / s (veya ~% 3 ​​/ s) gerilme hızında arızaya maruz bırakın.
5. Testin tamamlanmasından sonra, doku kalıntılarını kollajen içeriği için işleyin (bkz. Bölüm 7).
6. Ortaya çıkan yük-deformasyon verilerinden, gerilme-gerinim verilerini hesaplayın ve ilgilenilen mekanik özellikleri nicelleştirin; Örneğin maksimum gerilme yükü, nihai gerilme mukavemeti ve modülü ( yani , gerilme-gerinim eğrisinin doğrusal bir bölgesi üzerindeki elastik özellik).

7. Mühendislik Yapılı Ligamentlerin Kollajen İçeriğinin Tayini

1. Mühendislik yapmış bağları brushite çimento çapalarından çıkarın ve 120 ° C'de 25 dakika boyunca kurutun.
2. Yapıların kuru kütlesini belirleyin ve bireysel 1,5 mL tüplere yerleştirin. Kuru yapılar oda sıcaklığında saklanabilirDaha sonraki işleme kadar.
3. Her yapı için, 200 uL 6 M HC1 ekleyin. 120 ° C'de bir ısıtma bloğu içinde 2 saat kaynatın.
   DİKKAT: HC1 çok aşındırıcı ve asidiktir, kaynama önleyici / emniyet kilitli tüplerin kullanılması veya boruların sabitlenmesi için başka bir yöntem önerilir.
4. Sıvıyı toplamak için tüpleri kısa bir süre santrifüjleyin ve bir duman kabini içinde bir ısıtma bloğunda 120 ° C'de 1.5 saat boyunca buharlaşacak şekilde boşaltı bırakın.
5. Elde edilen peleti 200 μL hidroksiprolin tamponuna tekrar süspanse edin. Gerekirse -20 ° C'de saklayın.
   1. Hidroksiprolin tamponu hazırlayın. 300 mL su içinde, 16.6 g sitrik asit, 4 mL asetik asit, 11.4 g NaOH ilave edin ve çözünene kadar karıştırın. PH 6-6.5'e getirin ve hacim 500 mL'ye kadar getirin. Koruyucu olarak 250 μL toluen ekleyin ve ışığa karşı korunan 4 ° C'de saklayın.
6. Reaktifleri hazırlayın.
   1. Trans-4-Hidroksi-L-prolin hazırlayın. 4 mg / mL solüsyon yapmak için suda eritin.
   2. Kloramin-T'yi hazırlayın. 14.1 mg / mL solüsyon yapmak için suda eritin.
   3. Aldehit-perklorat hazırlayın. 6 mL 1-propanol, 2.6 mL perklorik asit (DİKKAT: korozif, güçlü oksitleyici, uygun tedbirleri kullanın) ve 0.5 mL su içinde 1.5 g 4-dimetilaminobenzaldehit eritilir.
7. Yeni 1.5 mL'lik tüpler setinde, hidroksiprolin tamponundaki her bir süspansiyon haline getirilmiş peletten bir numuneyi 200 uL'lik bir hacme kadar sulandırın.
   NOT: Seyreltme örneklemin beklenen kollajen içeriğine bağlı olarak örnek: tamponun 1: 4 ila 1: 50 arasında değişebilir; Bu nedenle, verilen örnek kümesi için uygun bir seyreltme faktörünü belirlemek için bazı deneme yanılma testleri gerekebilir (örn., Numuneleri standart eğrisinin ortasına doğru yerleştirin).
8. Hidroksiprolin standartları hazırlayın. Hidroksiprolin tamponu (bkz. Bölüm 7.5.1) içinde hidroksiprolini 80 ug / mL'ye seyreltin. 6-8 200 μL standartlarını 0-20 μg / mL arasında yapmak için seri dilüsyonlar uygulayın.
9. 150 uL 14.1 mg /ML Her standart ve seyreltilmiş numune için Chloramine T çözeltisi. Vorteksleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
10. Her bir numune ve seyreltilmiş numune için 150 uL aldehid-perklorat solüsyonu ekleyin. Vorteksleyin ve 15 dakika boyunca 60 ° C'de bir ısıtma bloğu içinde inkübe edin. Aşırı aldehid-perklorat solüsyonunu yerel yönetmeliklere (perklorik asit içerir) göre tehlikeli atık olarak imha edin.
11. Standartların ve numunelerin soğumasını bekleyin, her birinden 200 μL ayrı ayrı 96-kuyucuklu plakalara tekrarlayın.
12. Bir spektrofotometre ile 550 nm'de plak oku. Plakayı ve geri kalan hacmi, yerel yönetmeliklere (perklorik asit içerir) göre 1,5 mL tüplerde tehlikeli atık olarak imha edin.
13. Toplam kollajen ve kollajen fraksiyonunun hesaplanması.
    1. Her bir numune için absorbans değerini hidroksiprolin standart eğrisi kullanarak hidroksiprolin mikrogramına dönüştürün.
    2. Içinde her bir kuyuyu 2.5 ile çarpın, içindeki hidroksiprolin miktarını hesaplayın.Seyreltilmiş numune. Her bir numuneye 500 μL toplam karışımdan sadece 200'ünün (200 μL seyreltilmiş numune + 150 μL kloramin T + 150 μL AP solüsyonu) eklendiğini hatırlayın.
    3. Orjinal numunedeki hidroksiprolinin miktarını hesaplamak için seyreltme faktörü ile çarpın (Bölüm 7.7).
    4. Kollajen miktarını hesaplamak için 0.137 bölün (kolajenin% 13.7 hidroksiprolin ²⁰ içerdiğini varsayar).
       NOT: Kollajen içerisindeki memeli hidroksiprolin bolluğu, dokularda ve memeli türlerinde hafif farklılık gösterir; Örneğin domuz ve koyun Aşil tendonu sırasıyla 13.5 ve 13.7% (hidroksiprolin kütlesi / kuru doku kütlesi) içerir ²¹ . Burada, aşağıdaki denklemi kullanarak bir doku örneğinin kollajen içeriğini hesaplamak için kullanılan kolajendeki hidroksiprolini hesaplamak için% 13.7 kullanın:
       
    5. Kolajen frajı hesaplamak için kuru kitle bölün.Ction ve yüzdeye dönüştürün.
       

8. Molekül Son Nokta Tayini

NOT: Çekme testi ve kollajen içeriğinin birincil sonuçlarına ek olarak, moleküler uç noktalar mekanik bakış açısı sağlamak için 2D veya 3D dokuda da ölçülebilmektedir. Biyolojik tahliller, moleküler uç noktaları belirlemek için kullanılabilir (bağlam için aşağıdaki bölüme bakınız . In vitro bağ fonksiyonu üzerine egzersiz sonrası serum ortamının etkisi).

1. 3D doku için:
   1. Yapıları yukarıdaki 5. adıma göre hazırlayın.
   2. Tedavi / müdahale yapıldıktan sonra, snap-freeze, sıvı nitrojende oluşturulur.
   3. Kuru buz üzerine soğutulmuş bir havan ve havan kullanarak, öğütülerek bir toz haline getirin. 8.4 / 5. adımda devam edin.
2. 2D doku için:
   1. Kültür insan ACL fibroblastları bir arada kavuşmayaOlayer için DMEM içeren altı oyuklu plakalarda.
   2. DMEM'i aspire edin ve deney stratejinize ( örn. , Süre veya doz yanıt deneyleri) göre tedavi medyasını uygulayın.
   3. Tedavi medyasını aspire edin ve hücreleri PBS ile yıkayın.
   4. Hücreleri, uygun bir ekstraksiyon tamponu / reaktif kullanarak toplamak için sıyırın (bir sonraki sayfaya bakın).
3. Protein ekspresyon analizi: Protein lizatları elde etmek için bir sitozolik ekstraksiyon tamponu ( örn. , 250 mM sükroz, 50 mM Tris pH 7.4, 5 mM MgCl2 ve proteaz / fosfataz inhibitör kokteyli) kullanın. Protein konsantrasyon testi uygulayın ve standart western blot prosedürlerine göre analiz yapmaya devam edin.
4. Gen ekspresyon analizi: Yüksek kaliteli RNA elde etmek için üreticinin talimatlarına göre total RNA'yı 500 μL RNA izolasyon reaktifini kullanarak ayırın. Standart prosedürlere göre ters transkripsiyon ve gerçek zamanlı kantitatif PCR analizi yapın.
5. DNA izolasyonu: g izole edin ve nicelleştirinEnomic DNA, üreticinin talimatlarına göre DNA izolasyon reaktifini kullanarak. 260 nm'de örnek emilimini ölçmek için bir spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu hesaplayın.

Sonuçlar

Yapay ligament oluşumu ve deneysel müdahaleye genel bakış

Şekil 1 , yapay bağların oluşumuna genel bir bakış sunmaktadır. Bir kemik yerine kullanılan malzeme ²² olan brusit çimentosu, bir ortofosforik asit / sitrik asit solüsyonunu, silikon kuyularda β-trikalsiyum fosfat ile birleştirerek hazırlanır. Alternatif olarak, dokuların mekanik fonksiyonlarını doğrudan ölçmüyorsa, bir doku oluşumunda demir olarak 3-0 ipek dikiş kullanılabilir. Bunlar silikon kaplı 35 mm tabaklarda 12 mm aralıklarla sabitlenir ve% 70 etanol içinde ıslatılarak sterilize edilir. Fibroblastlar, ÇB rekonstrüksiyon cerrahisi sırasında elde edilen ön çapraz bağ kalıntılarından izole edilmiştir. Genişletildikten sonra, 2.5 x 105 hücre, brushite çimento çapa tutturulmuş tabağında oluşturulan bir fibrin jelinde kapsüllenir. Oluşumdan sonra, ligament constrMekanik özellikler, kollajen içeriği, hücre proliferasyonu, gen ifadesi, protein seviyeleri ve doku morfolojisi değişiklikleri için incelenebilir.

Kültür boyunca, hücreler fibrin jelini küçültür ve iki çapa arasında doğrusal bir doku oluşturur ( Şekil 2A ). Kültürde 1-2 gün sonra, hücreler fibrin jeline yapıştı, hücre proseslerini uzattı ve çekiş kuvvetleri uygulamaya başladı ( Şekil 2B ). Fibrin jel çekiş kuvvetleri ile kontrendikçe ve hücresel enzimlerle parçalandığında, iki bağlama noktası arasında gerginlik oluşur ve hücrelerimiz bu eksene paralel olarak hizalanır ( Şekil 2B ) ve kollajen yatırmaya başlarlar. 4-5 gün sonra, yapılar doğrusal bir silindirik doku oluşturan çapalar etrafında daralmıştır ( Şekil 2A ; bu noktada dış uyaranlar sisteme uygulanabilir (intervEntion, bu sefer doğrusal doku oluşum sürecinin bozulmasını önlemektedir). Müdahaleler, belirli bir müdahalenin ardından kültür ortamını insan veya hayvan serumuyla, ekzojen sitokinler ve büyüme faktörleri, mekanik stimülasyon kullanarak veya oksijen gerilimi gibi diğer çevresel faktörlerin değiştirilmesinden oluşabilir. 200 uM askorbik asit, 50 uM L-prolin ve 5 ng / mL TGF-β1 ile takviye edilmiş büyüme ortamı (% 10 FBS ve 100 U / mL penisilin ile DMEM) kullanılarak, hücre çoğalmasının 2 haftalık bir kültür boyunca devam ettiğini tespit ettik ( Şekil 2C ) ve gerçekten, ışık mikroskopisi, 14 günlük kültürde yüksek hizalanmış hücreleri içeren yoğun bir dokuyu ortaya çıkarmaktadır ( Şekil 2B ).

Mühendislik yapıtaşlarının değerlendirilmesi

Kültür periyodunun sonunda, mühendislik yapmış bağlar bir çeşitte değerlendirilebilirY yoldan. Bu sistemin en büyük avantajı, doğal bağın mekanik rolü göz önüne alındığında hayati bir değerlendirmeyle mekanik test yoluyla dokuda fonksiyonel değişiklikleri belirleme becerisidir. Tek eksenli gerilme testi, yüke karşı hata, en büyük gerilme mukavemeti ve Young modülünü içeren mekanik özellikleri ölçmek için kullanılabilir. Viskoelastik özellikler stres gevşetme ve sünme testleri ile de ölçülebilir. Şekil 3A , özel yapılmış bir tek eksenli çekme test cihazında ters kalıp tutma yerlerinde tutulmuş olan mühendisliğe tabi tutulmuş bir bağ tasvir etmektedir. Sağ tutamak, doku hasarına bağlı olarak bağ boyunca yükü ölçmek için bir güç çeviricisine bağlanır. Şekil 3B , başarısızlığa karşı bir test için temsili bir gerilme-gerinim çizimini göstermektedir. Mekanik testlerden geçtikten sonra, aynı yapılar kurutulabilir ve bir hidroksiprolin analizi ²³ için işlenebilir ve toplam kollajen içeriğini ve diğer biyokheyi değerlendirir.Mical deneyleri. Her bir koşul için yeterli miktarda ilave numune ile hücre proliferasyonu, gen ve protein ekspresyonu ve histolojik morfoloji üzerindeki etkileri dahil olmak üzere deneysel bir müdahalenin kapsamlı bir incelemesi yapılabilir. Çalışmalarımız için 14 gün tipik bir son nokta iken, mühendislik yapılan bağlar Şekil 3C'de gösterildiği gibi 28 günlük kültür boyunca mekanik özelliklerini ve kollajen içeriğini geliştirmeye devam etmektedir ve kültürde en az 3 ay hayatta kalabilmektedir24.

Donör değişkenliği, deneysel tekrarlanabilirlik için önemli bir husustur. Şekil 4 , Lee ve diğ. Tarafından rapor edilen temsili bir deney göstermektedir . ^{25 daha} önce tarif edilen 2 haftalık bir kültürden sonra tipik gerilme özelliklerini ve kolajen içeriğini gösteren 7 farklı ACL verici (n = 3 erkek ve n = 4 kadın) Ilave büyüme ortamı. Benzer ACL koleksiyonlarından, donörün yaşı, yaralanmadan sonraki süre, cinsiyet vb.'den gelen hücreleri kullanarak, donatılar arasındaki düşük değişkenlik ve mühendislik bağları, kollajen fraksiyonundaki fark hariç, erkek ve kadın donörler arasında benzer özellikler göstermektedir. Daha önce bahsedilen çalışmada, mühendislik yapmış bağlar, kadınların erkeklere göre ACL yaralanma riskini neden daha fazla araştırdıklarını araştırmak için in vitro bir model olarak kullanıldı ve kadın donörlerden izole edilen ACL fibroblastların doğal olarak zayıf ve daha az kolajen mühendislik yapısına sahip bağları oluşturmadığını gösterdi ²⁵ .

Egzersiz sonrası serum ortamının in vitro ligament fonksiyonu üzerine etkisi

Daha önce, fizyolojik süreçleri sondalama için kullanılacak mühendisli ligamentlerin yeteneğini göstermiştik ^{1 ,}Ss = "xref"> 25. West ve ark. Tarafından bildirilen aşağıdaki temsilci deneyde; ¹ , egzersizin bağ fonksiyonu üzerindeki biyokimyasal etkilerini belirledik ve burada metodoloji ve bulguları vurguladık. İnsan ACL hücrelerini kullanarak mühendislik yapıları kurduk ve egzersiz öncesi veya sonrasında toplanan insan serumuyla kondisyonlanan kültür ortamından oluşan 7. günde bir müdahale uyguladık. Kısacası, sağlıklı genç erkek katılımcıları işe aldık ve dolaşımdaki hormonları ve insan büyüme hormonu (GH) dahil sitokinleri artıran akut bir direnç egzersizi öncesi ve sonrasında kan örnekleri topladık. Egzersiz öncesi ve sonrasındaki kan numunelerinden insan serumu izole edildi ve işlenmiş ligament kültürünün ikinci haftası için kültür ortamında fetal sığır serumu yerine kullanıldı ( Şekil 5A ). Egzersiz öncesi ve sonras> serum örnekleri, GH ve insülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1) de¤ifliklikleri için ELISA kullan> larak analiz edildi;Konsantrasyonları egzersizle değiştirilebilir ( Şekil 5B ). Bu bilgiler, mühendisliğe tabi tutulmuş bağlarda serum etkilerini egzersize yanıt olarak serumdaki değişikliklerle ilişkilendirmek için kullanılmıştır. 14 günlük bir kültür periyodundan sonra bağ yapısı, mekanik test ve kolajen içeriğinin hidroksiprolin tayini ile değerlendirildi ve egzersiz sonrası seruma cevap olarak maksimal gerilme yükü ve kollajen içeriğinde belirgin bir artış gösterdi. Bu etkinin, egzersize bağlı GH veya IGF-1 salımları ile ilişkili olup olmadığını değerlendirmeyi amaçlamada, mühendislik yapmış bağlar ayrı bir deneyde oluşturuldu ve insan rekombinant GH veya IGF-1'in bir doz yanıtıyla tedavi edildi. İlginçtir ki, serum GH kan içinde yükselirken ( Şekil 5B -i), kültür ortamındaki artan şekilde rekombinant GH konsantrasyonu artışı kollajen içeriğini ( Şekil 5D -i) veya mekanik artışı sağlamazYapay bağlarda özellikleri (verileri gösterilmemiştir). Bunun aksine, egzersiz sonrası serum IGF-1 seviyeleri artmadı, ancak bir doz yanıt deneyinde, kültür ortamında artan düzeylerin ligaman yapılarının kollajen içeriğini geliştirdiği ortaya çıktı ( Şekil 4D -ii). Dolayısıyla, egzersiz, egzersiz sonrası GH'da sağlam artışlara neden olurken, rhGH'yi kullanan doz yanıtı deneyinde, GH'nin, mühendislik yapmış bağların fenotipik zenginleşmesinden doğrudan sorumlu olup olmadığı sorgulanmaktadır (en azından tek başına 22 kDa izoformu Sorumlu olduğu görülmektedir). Aksine, serum IGF-1 egzersizden 15 dakika sonra değiştirilmemesine rağmen, rhIGF-1'i geniş bir konsantrasyon konsantrasyonunda test etmek, IGF-1'in kollajen içeriğini iyileştirme kabiliyetine sahip olduğunu ortaya koymuştur; Bununla birlikte, fizyolojik seviyeleri tahmin eden bir aralıkta rhIGF-1 konsantrasyonlarının artmasının, kollajen içeriğini önemli ölçüde arttırmadığına dikkat edilmelidir. Böylece, eşsiz egzersiz sonrası serum enviroMühendislik yapmış bağların mekaniği ve kolajenini geliştirmede önem taşıyordu.

Burada vurgulanan çalışmada ¹ , deneysel serumun hacmi etik hususlar nedeniyle sınırlıydı; Bu nedenle, düşük serum talepleri olan kısa vadeli 2D biyolojik tahliller, gözlemlenen kollajenin artmasından sorumlu olan moleküler mekanizmaları ileri araştırmak için kullanılmıştır. ACL fibroblastları 6 oyuklu plakalarda konfüzyona kadar kültürlendi ve dinlenme veya egzersiz sonrası serum ile 1 saat süreyle muamele edildi ve rekombinant GH, IGF-1, TGF-β1'in doz yanıtları ve PI3K / mTORC1'de hedeflerin aktivasyonu ile karşılaştırıldı , ERK1 / 2 ve Smad sinyal yolakları belirlendi. Egzersiz sonrası serum varlığında PI3K / mTORC1 ve ERK1 / 2 yolu, sırasıyla S6K'nın ( Şekil 5D -i) ve ERKl / 2'nin ( Şekil 5D -ii) fosforilasyonu ile değerlendirildiğinde daha fazla aktivasyon gösterdi.Hormon ve sitokin doz tepkileri ile karşılaştırıldığında, GH'nin mTOR sinyallemesi üzerinde küçük bir pozitif etki ( Şekil 5D -i) ve IGF-1'in en düşük dozda pozitif bir etki gösterdiği halde GH, IGF-1 ve TGF'nin üç tedavisi -β1, PI3K / mTORC1 ve ERK1 / 2 sinyalizasyonundaki artıştan sorumlu değildi. Birlikte ele alındığında, 3D mühendislik bağ modeli ve 2D biyolojik tahlil verileri, egzersiz sonrası serum ortamının, PI3K / mTORC1 ve ERK1 / 2 yolaklarının aktivasyonu yoluyla mühendislik bağ fonksiyonunu ve kollajen içeriğini iyileştirebildiğini düşündürmektedir.

Özetle, egzersiz klimalı serum ile kombine edilmiş bir mühendislik bağ modeli kullanarak, i) egzersiz sonrası serum ortamının mühendisli bağ fonksiyonu ve kollajen üzerine etkisini araştırmayı, ii) bağ fenotipindeki değişiklikleri serum hormonu konsantrasyonundaki değişikliklerle ilişkilendirmeyi, Hangi değişikliklerin serumda meydana geldiğini belirlemek amacıylaVe iii) ligaman işlevinde gelişmelere yol açan egzersiz sonrası serum ile aktive edilen moleküler mekanizmaları belirlemek için serum biyokimyasal çevrenin moleküler hedeflerini araştırmak için 2D biyolojik tahliller kullanarak çalışmanın kapsamını genişletmek.

Şekil 1: Yapay bağların oluşumuna ve kullanımına genel bakış. Fırçalık çimento çapaları imal edilir ve silikon kaplı plakalar halinde sabitlenir. Primer fibroblastlar, ACL kalıntılarından izole edilir ve genişletilir. Mühendislik yapıları, fibroblastları iki brushite çimento çapa etrafında bir fibrin jelinde kapsülleyerek oluşturulur. İşlenmiş bağlar, istenen hangisi istenen kimyasal veya mekanik ( örn. Bir biyoreaktör yoluyla) istenen uyaranlarla kültürlenir ve işlenir. Arzulanan bitim noktasında mühendislik yapılan bağlar mekanik için toplanabilir ve değerlendirilebilirL özellikleri, gen ifadesi, kollajen içeriği, protein ekspresyonu ve histoloji. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 2. Primer ligaman fibroblastları, iki fırçak çimento çapasına dayanan fibrin esaslı kemikten kemik yapımı ligament oluştururlar. ( A ) Zamanla, fibroblastlar fibrin jelini fırça çimento çapaları etrafında doğrusal bir doku oluşturarak kasılmaktadır. ( B ) İlk üç günde, hücreler fibrin jeline yapışır ve çekme kuvvetleri uygulayarak hücreleri yapının uzun ekseni ile hizalaştırır. Hücreler, 14 günden uzun sürede hizalanmış bir doku oluşturur. Ölçek çubuğu = 160 μm. ( C ) Yapay bağların DNA içeriği artmaya devam ediyor oHücreler çoğaldığında kültürde 14 gün. Veriler grup başına n = 3-4 yapıları ile ortalama ± SD olarak sunulmuştur. grupları. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3: Yapay bağ mekanik özellikleri ve kollajen içeriği zamanla gelişir. ( A ) Ligament yapıları, belirli bir müdahalenin bağ fonksiyonu üzerindeki etkisini belirlemek için tek eksenli olarak çekme testine tabi tutulmuştur. Gösterildiği gibi, iki adet ters kalıplanmış, 3D baskılı tutma yeri, mühendislik şeridi ile köprülenen karşılıklı olarak şekillendirilmiş çapaları tutar. Çapalar, test edilen dokunun stres / şekil değiştirme eğrileri oluşturmak için bir kademeli motora ve kuvvet transdüserine bağlanır ve mekanik özelliklerin belirlenmesine izin verir. ( B </ Strong>) Başarısızlığa maruz kalmış mühendislik yapmış bir bağın temsil ettiği stres-gerinim eğrisi. 28 gün boyunca, ( C ) nihai gerilme mukavemeti (UTS), ( D ) maksimum çekme yükü (MTL), ( E ) Young modülü ve ( F ) kollajen fraksiyonu iyileşmeye devam etmektedir. Veriler grup başına n = 5 yapı ile ortalama ± SD olarak sunulmuştur. * Diğer tüm gruplardan önemli farklılık göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4: Mühendisli bağlar işlevsellik ve biyokimyasal içerik açısından düşük donör değişkenliği göstererek değerlendirilebilir. Mühendislik yapmış bağlarda 7 farklı donör (n = 3 erkek, n ​​= 4 kadın) oluşturuldu. 2 hafta sonra oF kültürü için, ( A ) maksimum gerilme yükü, ( B ) nihai gerilme mukavemeti ( U ), ( C ) Young modülü, ( D ) kesit alanı (CSA), ( E ) toplam kollajen içeriği Ve ( F ) kuru kütlenin bir fraksiyonu olarak kollajen. Veriler ortalama ± SD, istatistiksel anlamlılık Student's t-testi ile gösterildi. * Diğer gruplara göre anlamlı farklılık gösterir (p <0.05). Şekil Lee ve diğ. ²⁵ Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 5. Mühendislik yapıları biyolojiye yanıt olarak mekanik ve biyokimyasal değişiklikler gösterirMüdahaleler. ( A ) Serum, pre- (RestTx) ve egzersiz sonrası (ExTx) deneklerden toplanan kan çekimlerinden izole edildi ve kültürlenen ikinci hafta boyunca mühendisli ligamanları tedavi etmek için kullanıldı. ( B ) (i) Dinlenme ve egzersiz serumundaki insan büyüme hormonu (GH) ve (ii) insülin benzeri büyüme faktörü (IGF) -1 seviyeleri ELISA ile nicelleştirildi. ( C ) ExTx ile işlenmiş mühendislik yapıları iyileştirilmiş (i) kollajen içeriği ve (ii) maksimal gerilme yükü göstermiştir. Eşleştirilmiş karşılaştırmaların (RestTx ve ExTx) istatistiksel önemi, anlamlılık düzeyi p <0.05 olarak belirlenmiş bir t-testi ile analiz edildi. ( D ) ExTx'e bağlı kollajen içeriğindeki değişikliklere bu faktörlerin olası katkısını belirlemek için (i) GH ve (ii) IGF-1'in bir doz-tepkisi kullanıldı. E) 2D biyolojik tahliller, (i) S6K ^{Thr38'in fosforilasyonu} gibi moleküler sinyal hedefleri üzerindeki artan dozlarda GH, RestTx ve ExTx'in etkilerini karşılaştırmak için kullanıldı.9 ve (ii) ERK1 / 2 ^{Thr202 / Tyr204} . İki den fazla deney grubunun istatistiksel karşılaştırması ANOVA ve Tukey's HSD kullanılarak yapıldı. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. * Kontrol ile anlamlı bir fark (p <0.05) ve § 150 ng / mL ve 300 ng / mL IGF-1'den anlamlı fark olduğunu gösterir. Şekil, West ve diğ. ¹ Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Tartışmalar

Bu yazıda doku gelişiminden translasyonel / klinik sorulara kadar geniş bir araştırma yelpazesine sahip araştırmacılar için faydalı bir deney platformu olan bir ligament dokusu modeli tanımlanmaktadır. Burada açıklanan mühendislik bağ modeli, iş akışı boyunca çeşitli noktalarda uyarlanabilen çok yönlü bir protokole dayanmaktadır ( Şekil 1 ve Tartışma Bölümü ). Dahası, in vitro ortamın doğal olarak indirgeyici doğası, beslenen ortamı şartlandırılmış insan veya hayvan serumu ile takviye ederek fizyolojik bölgeye daha yakın hale getirebilir.

Yapılar, çeşitli kaynaklardan gelen fibroblastlar kullanılarak oluşturulabilir
Burada gösterilen metodoloji ve temsili sonuçlar birincil ACL fibroblastlarının kullanımına dayanmasına rağmen, hücre izolasyon protokolü, diğer primer fibroblast türlerini toplamak için ayarlanabilir. Tarif edildiği gibiŞekil 4'te , genç insan donörlerinden izole edilen primer hücrelerle oluşturulan mühendislik yapıları, verici değişkenliği düşüktür. Birincil hücreler ilk yalıtım ve geçit sınırlaması ile sınırlanır; Hücre hatlarının kullanımı deneylerin tekrarlanabilirliğini artırabilir. Diğer hücre tiplerinin kullanımı, hücre kültürü ortamında ve fibrin jel formülasyonunda değişiklikler gerektirebilir. Örneğin, insan mezenşimal kök hücrelerinin (MSC'ler) fırça çimento çapaları arasında 2 hafta boyunca doğrusal dokular oluşturamayacağını gözlemişken, at üstün dijital fleksör tendon fibroblastları, at kemik iliği stromal hücreleri, piliç embriyonik tendon fibroblastları Ve sıçangil C3H10T1 / 2 MSC'ler hızla kasılmakta ve doğrusal bir doku oluşturmak için fibrin jelini sindirmektedirler (yayınlanmamış gözlemler). Bu kontrast, hücre kontraktilitesi, proliferasyon ve fibrinolitik enzim üretimindeki farklılıkların bir sonucu olabilir.

Kimyasal uygulamaVe mekanik stimülasyon
Burada tarif edilen yöntemde fibrin esaslı doku, fırlık çimento çapa etrafında oluşur ve bir gerilme biyoreaktörü ¹¹ aracılığıyla mekanik uyarının uygulanmasına ve son nokta gerilimi testine izin verir. Fırçasit çimento-yumuşak doku arayüzünün (entez) varlığı, daha ileri araştırmalar ve iyileştirme fırsatı sunmaktadır 22,26 (bkz. Aşağıdaki Klinik uygulamalar bölümü). Bu in vitro ortamda, kimyasal ve mekanik faktörlerin katkısı daha kolay belirlenebilir; Bunun bir örneği, Şekil 5'de gösterilmiştir, böylece egzersiz sonrası serum ortamının etkisi, egzersizin mekanik uyarımından ayrılmıştır. Gözlemlenebilir bir değişim beklemek için deneysel müdahalelerin zaman çizelgesini, tedavi bileşimini ve uygun son noktaları belirlemek için pilot çalışmalara ihtiyaç duyulabilir. foR örnekte, egzersiz sonrası serum çalışmasında ¹ , deneysel tedavi uzunluğu, yapıların her iki günde bir beslendiği ek besiyeri için kullanılan serum temini ile sınırlandırılmıştır. Ayrıca, kültürün ikinci haftasında, kültür ortamı, TGF-β1 çıkarıldığında askorbik asit ve L-prolin ile dinlenme veya egzersiz sonrası serum takviye edildi. TGF-β1, egzersiz ²⁷ sonrası serumda artan bilinen bir pro-fibrotik büyüme faktörüdür. Dolayısıyla, egzersiz sonrası serumun TGF-β1 ile ilgili etkilerini örtmekten kaçınmak için, bu sitokin kültür ortamında muhafaza edilmedi.

Bu mühendisli bağ modeli mekanik gerilmenin etkisini test etmek için de kullanılabilir. Ters modellenmiş kulpları, fırçasız çimento çapa uçlarını ( Şekil 1'de tasvir edilen tek eksenli çekme test cihazına benzer şekilde) tutmak üzere mühendislik yaparak, esneme biyoreaktörleri, eng Ineered ligamentler. Laboratuvarımız daha önce bu modeli , in vitro bir gerilme paradigmasının veya hatta potansiyel olarak in vivo rasyonel tasarım için daha iyi bir anlayış sağlayacak, ısmarlama biyoreaktör 11'de tek eksenli gerilme gerilmesine yönelik mühendislik yapmış bağların moleküler sinyal tepkisini araştırmak için kullandı. Streç / etkinlik / terapötik uygulamalar.

Mühendislik yapıtaşlarının değerlendirilmesi
Geleneksel tek katmanlı kültürde olduğu gibi, 3D yapılar, gen / protein ekspresyonu için denenebilir; Buna ek olarak, onların 3B morfolojisi de işlevsel ve morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için fırsat sağlar ve yapılar uzun vadeli çalışmalar için kültürde muhafaza edilebilir ( Şekil 3 ). Yapay bağlar doğal, olgun bağlara eşdeğer olmamakla birlikte, gelişmekte olan tendon / bağlara benzerlik taşırlar ve besin maddeleri karşısında doğal dokuya benzer şekilde davranırlar"26, büyüme faktörleri 10, hormonlar ²⁵ ve egzersiz ^{11 , 28.} Dolayısıyla, herhangi bir in vitro modelden geniş çaplı genellemeler yapmadan önce ihtiyati tedbir alınması gerekmesine rağmen, ligament yapı testinden elde edilen sonuçlar, aksi halde olabilecek başka bir fizyolojik mekanizmayı In vivo araştırılmaları imkansız .

Geniş uygulamalara sahip esnek ve dinamik bir model için kıvamlandırılmış serum içeren besleme ortamını tamamlayın
İnsan serum metabolomu glikoproteinler, lipoproteinler, lipit türevleri, enerji substratları, metabolitler, vitaminler, enzimler, hormonlar, nörotransmitterler ve yapı taşları / ara ürünlerin bolluğunu içeren ancak bunlarla sınırlı olmayan 4,500 bileşiğin bir çevredir. ²⁹ İnsan serum metabolomunun bileşik sınıflarına göre daha fazla incelenmesi ²⁹ additi ortaya koymaktadırDeneysel serumun in vitro deneylere entegrasyonunun bir avantajı. Diğer bir deyişle, serumda ~ 4500 bileşiğin çoğunluğu hidrofobik veya lipit türevi olup, taşıma / çözünürlük için bağlama proteinlerinin önemini vurgulamaktadır. Sonuçta, deneysel olarak tekrarlanan endojen bileşik taşıma dinamikleri ve dolayısıyla biyoyararlılık ve bileşik hedef etkileşimleri neredeyse imkansız olurdu. Bu nedenle, deneysel serum, çözündürme, aktarım, hedef bağlama ve etki mekanizması için yardımcı moleküllere bağımlı olduğu bilinen bileşiklerin çalışılması için özellikle etkilidir.

Laboratuarımız, egzersizin sağlık yararları konusunda uzun zamandır ilgi duyuyor. Egzersiz, çeşitli faktörlere (örneğin IL-6 ¹³ , IL-15 ¹⁴ , Meteorin benzeri ¹⁵ ,Eksozomlar ^{16 , 17} ) sistemik dolaşıma bırakılır. Egzersiz sonrası biyokimyasal ortam, hem salgın bezlerinin sempatik sinir sisteminin uyarılması ( örneğin , adrenal bezdeki kortizol ve katekolaminler ¹⁸ ve büyümenin sonucu olarak salınan faktörlerin yanı sıra, iskelet kası egzersize duyarlı hormonları kastederek salınan faktörleri yansıtır Ön pituiter hormon hormonu ¹⁹ ). Egzersiz kaynaklı biyokimyasal çevrenin mühendislik dokusu üzerindeki etkilerini araştırmak için kısa bir süre önce egzersiz öncesi ve sonrası serum örnekleri kullandık. ¹ Pek çok önemli egzersizle ilgili araştırma sorusu kalırken, model hiçbir şekilde bu şekilde kısıtlı değildir. Örneğin, serum diyet veya farmakolojik müdahaleleri takiben hayvan kaynaklı veya beşeri kaynaklardan veya farklı yaş gruplarından veya klinik popülasyondan elde edilebilirS ³⁰ . Bu yolla, eksojen veya endojen olan ilgi çekici bileşikler serum ve tedavi ortamlarında biyoyararlanılabilir miktarlarda bulunacak ve hedef doku ile endojen çevre ile ( yani daha fizyolojik bağlamda) etkileşime girecektir. Bu yaklaşım, belirli bir müdahalenin çoklu organ (ve çoklu bileşik) bir etki göstereceği ve dolayısıyla fizyolojik ortamın birlikte modifiye edileceği ihtimalinin yüksek olması nedeniyle dinamiktir. Bu yaklaşım belirli zorlukları beraberinde getirirken, çoklu sistemik biyokimyasal değişkenler aynı anda değiştirildiğinden saf rediskistist deneysel yöntem ^{31 ,} 32'deki dezavantajların üstesinden gelmeye yardımcı olabilecek bir yaklaşımdır. Birlikte ele alındığında, şartlandırılmış serumun bir doku mühendisliği ( in vitro biomimetik ) doku ile birlikte uygulanması, fizyoloji, beslenme ve klinik araştırma soruları için bir araç olarak kullanılabilir.

Klinik uygulamalar sayısız
Burada sunulan doku mühendisliği modeli, geleneksel in vitro modellerin yapamadığı anatomik ve klinik araştırma sorularını araştırmak için kullanılabilir. In vivo bir ligament veya tendon , entez adı verilen yumuşak-sert doku geçiş bölgesi içerir. Mekanik strese bağlı yaralanmaya karşı savunmasız kalan teleskopi, histokimyasal ve elektron mikroskobu teknikleri ^{22 , 26} ile kesitsel olarak incelenebilir. Bu eşsiz arayüz, düşük hareketsizliği olan kişiler için iki kat daha önemlidir, çünkü fiziksel hareketsizlik, bağ dokusunun yükü düşükten yükseğe doğru uyumluluk bölgelerine aktarabilme yeteneğini engeller ve sonuçta doku uyumluluğunda genel bir azalma ve yaralanma riskinde artışa neden olur.

Laboratuvarımız son zamanlarda bu doku mühendisliği modelini kullandı ^{25 <}/ Sup>, bağ dokusu yaralanmaları için risk altındaki başka bir nüfusu, bayan sporcuları modellemek için kullanılmıştır: ACL yaralanması insidansı erkek meslektaşlarından yaklaşık ³⁵ kat daha fazladır. Yaralanmada cinsiyete dayalı bu farklılığın altını çizen potansiyel mekanizmalar, bağ yapısı döngüsünün aşamalarını taklit eden konsantrasyonlarda bağ yapılarını dişi seks hormonunun fizyolojik konsantrasyonları olan östrojen ile tedavi ederek araştırılmıştır. İlginçtir, yüksek konsantrasyonlarda östrojen, ligamanların ve tendonların kollajen matrisinde lizin-lisin çapraz bağları oluşturan primer enzim olan liz oksidazın gen ifadesini ve aktivitesini inhibe etti. Önemlisi, 48 saatlik yüksek östrojen (folliküler fazı taklit etmek için), yapıların kollajen yoğunluğunu değiştirmeden ligaman yapısının sertliğini azalttı. Fizyolojik bir perspektiften bakıldığında, bu, dişilerde gevşeklikteki artışların en azından kısmen azaltılmışÇapraz bağ oluşumu. Deneysel bir perspektiften bu bulgular ²⁵ , fonksiyonel çapraz bağlanma aktivitesinin incelenmesine izin veren 3D yapım modelinin yararını vurgulamaktadır. Klinik açıdan bakıldığında, bu model bağ işlevinin östrojeninin olumsuz etkilerini önleyebilecek müdahaleleri hızla taramak için kullanılabilir.

Kapanış ifadeleri
Burada, mühendislik yapılan bağların oluşumu ve 3D in vitro doku modeli olarak kullanılması için ayrıntılı bir metodoloji sunduk. Model, hücre tipinde, müdahalelerde ve sonuç önlemlerinde esneklik sağlayan geniş bir hedef yelpazesine oldukça uyarlanabilir. Besleme ortamının kıvamlandırılmış serum ile desteklenmesi, geleneksel in vitro ortamda elde edilemeyen fizyolojik bir bağlam ekler ve in vivo fizyolojinin modellenmesini geliştirir. Kısacası, bunun geniş ölçüde uygulanabilir bir mod olduğuna inanıyoruzFizyoloji ve doku mühendisliğinin her ikisini de ilerletmek için heyecan verici etkileri olan l.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20	Entomoravia	N/A	For brushite cement anchors
β-tricalcium phosphate	Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK)	N/A	For brushite cement anchors
o-phosphoric acid, 85% (w/w)	EMD Millipore	PX0995	For brushite cement anchors
Citric acid	Sigma-Aldrich	251275-500g	For brushite cement anchors
Falcon 35 mm tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772A	For silicone-coated plates
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Ellsworth Adhesives	4019862	For silicone-coated plates
1x Phosphate-buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	SH3002802	For cell isolation and expansion
100x antibiotic/antimycotic solution	VWR	45000-616	For cell isolation
Type II collagenase	Thermo Fisher Scientific	17101015	For cell isolation
100x penicillin/streptomycin solution	Thermo Fisher Scientific	15140122	For cell isolation
Steriflip-GP, 0.22 µm pore, polyethersulfone, gamma irradiated	EMD Millipore	SCGP00525	For reagent sterilization
DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine	VWR	10-013-CV	For cell and tissue culture
Fetal bovine serum	BioSera	FBS2000	Component of tissue digestion media and growth media
Penicillin G Potassium Salt	MP Biomedicals	0219453680 - 100 MU	Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20°C.
CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 mm x 20 mm)	VWR	82050-598	For cell culture
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	T10282	For cell isolation
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	25200056	For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301	For cell freezing media
Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	For cell freezing
BD Vacutainer Red Plastic 10 mL	Fisher Scientific	367820	For human serum collection
Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22 G x 1 inch Needle	Fisher Scientific	354221	For human serum collection
Thrombin, bovine origin	Sigma-Aldrich	T4648-1KU	For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
Fibrinogen, bovine origin	Sigma-Aldrich	F8630-5G	For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
Aprotinin from bovine lung	Sigma-Aldrich	A3428	For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
6-Aminohexanoic acid	Sigma-Aldrich	07260-100g	For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at 4 °C.
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960-5G	Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C.
L-proline	Sigma-Aldrich	P5607-25G	Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C.
Transforming growth factor-β1	Peprotech	100-21	Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer's instructions at a concentration of 10 μg/mL. Aliquot and store at -20 °C.
Stericup-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, 250 mL, radio-sterilized	EMD Millipore	SCGPU02RE	For reagent sterilization
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144-212	Dilute in water to 6 M
4-Dimethylaminobenzaldehyde	Sigma-Aldrich	39070-50g	For hydroxyproline assay
Chloramine-T trihydrate	Sigma-Aldrich	402869-100g	For hydroxyproline assay
trans-4-Hydroxy-L-proline	Sigma-Aldrich	H54409-100g	For hydroxyproline assay
1-propanol	Sigma-Aldrich	279544-1L	For hydroxyproline assay
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	311421-250ml	For hydroxyproline assay
Acetic acid, glacial	EMD Millipore	AX0073-9	For hydroxyproline assay
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S318-500	For hydroxyproline assay
Toluene, anhydrous	Sigma-Aldrich	244511-1L	For hydroxyproline assay
Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates	Fisher Scientific	07-200-656	For hydroxyproline assay