Traitement des constructions de ligament avec un sérum conditionné par l'exercice: un modèle d'ingénierie des tissus de traduction

Résumé

Nous présentons un modèle de tissu ligamentaire dans lequel les constructions tridimensionnelles sont traitées avec le sérum conditionné par l'exercice humain et analysées pour la teneur en collagène, la fonction et la biochimie cellulaire.

Résumé

Les expériences in vitro sont essentielles pour comprendre les mécanismes biologiques; Cependant, l'écart entre la culture tissulaire monocouche et la physiologie humaine est important et la traduction des résultats est souvent médiocre. Ainsi, il existe de nombreuses possibilités d'approches expérimentales alternatives. Nous présentons ici une approche dans laquelle les cellules humaines sont isolées à partir de restes de tissus de ligaments croisés antérieurs humains, développés en culture et utilisés pour former des ligaments modifiés. L'exercice modifie le milieu biochimique dans le sang de telle sorte que la fonction de nombreux tissus, organes et processus corporels soit améliorée. Dans cette expérience, le milieu de culture de construction de ligament a été complété par un sérum humain expérimental qui a été «conditionné» par l'exercice. Ainsi, l'intervention est plus biologiquement pertinente car un tissu expérimental est exposé au milieu biochimique endogène complet, y compris les protéines contraignantes et les composés adjuvants qui peuvent être modifiés en tandem avec l'activité d'unAgent inconnu d'intérêt. Après traitement, les ligaments modifiés peuvent être analysés pour fonction mécanique, teneur en collagène, morphologie et biochimie cellulaire. Dans l'ensemble, il existe quatre avantages majeurs par rapport à la culture monocouche traditionnelle et aux modèles animaux, du modèle physiologique du tissu ligamentaire présenté ici. Tout d'abord, les constructions de ligament sont tridimensionnelles, ce qui permet de quantifier les propriétés mécaniques ( c.-à-d . La fonction) telles que la contrainte de traction, la charge de traction maximale et le module. Deuxièmement, l'enthesis, l'interface entre les éléments osseux et tendus, peut être examinée en détail et dans un contexte fonctionnel. Troisièmement, la préparation de médias avec un sérum post-exercice permet d'étudier de manière impartiale les effets du milieu biochimique induit par l'exercice, qui est responsable de la vaste gamme d'avantages pour la santé de l'exercice. Enfin, ce modèle expérimental fait avancer la recherche scientifique de manière humaine et éthique en remplaçant l'utilisation deLes animaux, un mandat fondamental des Instituts nationaux de santé, du Centre pour le contrôle des maladies et de la Food and Drug Administration.

Introduction

Les blessures au tendon et au ligament sont fréquentes et peuvent avoir des conséquences débilitantes sur la mobilité normale et la qualité de vie. L'intervention chirurgicale est souvent nécessaire, mais peut avoir un succès limité et varié ^{4 , 5} . La compréhension actuelle de la façon dont les tendons et les ligaments se développent, mûrit et répond aux blessures est incomplète et, par conséquent, des modèles de recherche efficaces sont nécessaires pour donner un aperçu du développement de traitements plus efficaces ⁵ . Pour remédier à cette lacune des connaissances, les modèles animaux peuvent être utilisés, mais les études in vivo sont intrinsèquement complexes avec une difficulté à contrôler l'environnement et à cibler directement les interventions sur le tissu voulu. En revanche, l'environnement expérimental peut facilement être contrôlé et surveillé in vitro avec une culture cellulaire monocouche traditionnelle. Cependant, cette technique peut trop simplifier l'environnement chimique et mécanique et ne peut donc pas récapitulerTard le comportement in vivo des cellules. L'ingénierie des tissus peut se marier aux avantages de l'environnement complexe in vivo dans les modèles animaux avec le contrôle de l'environnement in vitro et fournit un outil supplémentaire pour étudier la physiologie. En outre, armé d'une meilleure compréhension du développement du ligament, l'ingénierie des tissus peut également fournir une source de tissu greffé lorsque la reconstruction chirurgicale est nécessaire ⁶ . Ainsi, la méthode décrite ici valide un tissu génétique 3D in vitro qui peut être utilisé pour étudier la fonction et la morphologie du ligament.

Les constructions de tendons ou de ligaments basées sur la fibrine ont été utilisées comme modèle in vitro pour étudier les processus physiologiques, y compris la fibrillogenèse du collagène ⁷ et le développement du tendon ⁸ , ainsi que les applications de traduction dans lesquelles leur utilité comme tissu de greffe a été évaluée dans un modèle de mouton de cru antérieurReconstruction du ligament ciaïque (ACL) ⁹ . Notre laboratoire a précédemment établi un modèle de ligament conçu par l'ingénierie 3D couvrant deux brossettes, un matériau de substitution d'os phosphate de calcium, des ancres de ciment. Ce modèle peut être soumis à des conditions expérimentales différentes avec facilité simplement en complétant les milieux de culture avec des facteurs biologiques ¹⁰ ou en appliquant une stimulation mécanique ¹¹ . Il est important de noter que ce modèle de ligament os à os permet une analyse approfondie de l'enthesis, l'interface entre les éléments osseux et tendus, susceptible d'être lésée.

Dans l'étude mise en évidence ¹ ici pour présenter cette méthodologie, nous avons été intéressés par l'effet des changements induits par l'exercice dans le milieu biochimique sur la fonction du ligament. L'exercice améliore la fonction cellulaire et organique dans une variété de tissus dans tout le corps ^{2 , 3 , 12} , un effet qui peut être attribué à la libération de divers éléments connus (p. Ex., IL-6 ¹³ , IL-15 ¹⁴ , Meteorin ¹⁵ , exosomes ^{16 , 17} ) et d'autres facteurs biochimiques inconnus libérés dans la circulation systémique . En outre, le milieu biochimique post-exercice est enrichi d'hormones sensibles à l'exercice, dont la libération est stimulée par la stimulation du système nerveux sympathique des glandes sécrétoires ( p. Ex . Cortisol et catécholamines de la glande surrénale ¹⁸ et hormone de croissance de l'hypophyse antérieure ¹⁹ ). Cependant, i n vivo , il est impossible de différencier les effets de la stimulation mécanique de l'exercice des changements biochimiques induits par l'exercice. Alors que certaines études ont caractérisé l'augmentation attendue de certaines hormones circulantes et des cytokines en réponse à l'exerciceE comme mentionné ci-dessus, il existe trop de facteurs, connus et inconnus, pour récapituler fidèlement in vitro. C'est-à-dire isoler quelques facteurs pour une étude in vitro ne répond pas à la complexité de la réponse biochimique. Dans cette étude, nous avons étudié comment les changements dans le milieu biochimique sérique, provoqués par l'exercice, affectent la fonction du ligament artificiel. Pour isoler les effets des changements biochimiques, nous avons obtenu du sérum des participants humains avant et après un exercice de résistance et l'avons utilisé pour traiter les ligaments 3D conçus à l'aide de fibroblastes de ligament croisé antérieur humain (ACL). En utilisant ce modèle, nous pouvons obtenir des données fonctionnelles, y compris des effets sur les propriétés mécaniques et la teneur en collagène, ainsi que quantifier les effets sur la signalisation moléculaire.

Protocole

Les procédures suivantes respectent un protocole qui a été approuvé par le Conseil d'examen institutionnel de l'Université de Californie, Davis; Consultez le conseil d'éthique local avant de commencer la recherche.

1. Isoler les fibroblastes primaires des restes ACL humains

REMARQUE: Maintenir la stérilité et effectuer toutes les étapes dans une armoire de sécurité biologique (BSC).

1. Obtenir l'approbation du comité d'éthique approprié pour la collecte et l'utilisation des tissus humains comme décrit ci-dessous.
2. Préparez une solution 5x antibiotique / antimycotique (ABAM) en diluant une solution antibiotique / antimycotique 100x dans une solution salée tamponnée au phosphate 1X (PBS)
3. Recueillir des fragments de tissu ACL dans la solution 5X ABAM dans un tube conique de 50 ml, conserver à 4 ° C jusqu'à l'étape de digestion. Couper les tissus en fragments plus petits avec une lame de rasoir si nécessaire à une taille maximale de 1 x 1 x 1 cm ³ .
   ATTENTION: respecter les règlements locaux sur les risques biologiques pourL'utilisation correcte du matériel à risque biologique et la décontamination et l'élimination des déchets biologiques.
4. Préparez un volume suffisant de solution de collagénase pour immerger les fragments de tissu. Dissoudre la collagénase de type II (1 mg / mL) dans du milieu glycémique modifié (DMEM) à haute teneur en glucose Dulbecco contenant 1x pénicilline / streptomycine et 20% de sérum bovin fœtal (FBS) et filtrer à 0,22 μm.
5. Rincer le tissu ACL 3 fois dans le PBS.
6. Tissus digestifs. Transférer le tissu ACL dans un nouveau tube conique de 50 ml et ajouter un volume suffisant de solution de collagénase pour immerger le tissu. Incuber à 37 ° C pendant une nuit (~ 17 h).
7. Avant la fin de la digestion, préparer les milieux de croissance (GM) en complétant le milieu de glucose élevé au DMEM avec 10% de FBS et 100 U / mL de pénicilline.
8. 15 min avant que le temps de digestion soit terminé, tourbillonner brièvement le tube de 50 ml contenant du tissu 3 fois toutes les 5 min.
9. En utilisant une pipette sérologique de 25 ml, triture le tissu digéré vigoureusement pour casser le tiSsue up plus loin et déloger les cellules.
10. Centrifuger à 1.500 xg pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre à nouveau le culot dans 10 ml de GM.
11. Répétez les étapes 1.8-1.9 trois fois de plus.
12. Après la dernière centrifugation, remettez à nouveau le culot dans 5 à 10 ml de GM. Utilisez un petit échantillon de la suspension cellulaire pour effectuer un nombre de cellules avec un hémocytomètre et évaluer la viabilité cellulaire à l'aide de Trypan Blue.
13. Placer la suspension cellulaire sur des plaques de culture tissulaire de 15 cm à une densité de 3-4 x 10 ⁵ cellules par plaque.
14. Culture à 70% de confluence dans un incubateur stérile maintenu à 37 ° C et 5% de CO ₂ , en changeant le GM tous les trois jours. Utilisez ou stockez (voir ci-dessous) des cellules dans 5 passages.
15. Geler les cellules pour une utilisation future.
    1. Essuyez les cellules à une concentration de 70% comme suit. Aspirer les milieux et les cellules de lavage avec du PBS. Ajouter suffisamment de trypsine pré-réchauffée (37 ° C) à 0,05% pour couvrir simplement le fond des plaques de culture tissulaire. Placer les plaques dans l'incubation de la culturePendant environ 5 min jusqu'à ce que les cellules soient détachées (vérifier que les cellules flottent à l'aide d'un microscope optique). Utilisez une pipette pour collecter des cellules et distribuer dans un tube Falcon.
    2. Centrifuger pour granuler les cellules, et resuspendre les cellules dans des milieux de glucose hautement DMEM contenant 20% de FBS et 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO). Suspendre une cellule aliquote dans des cryogénies et refroidir à -1 ° C / min pendant au moins 24 h. Stocker les cryogénies congelées dans de l'azote liquide.

2. Préparer des plaques en silicone

1. Préparer des plaques de culture tissulaire de 35 mm: retirer les couvercles et poser les plaques ouvertes sur une surface plane.
2. Mélanger le kit élastomère silicone conformément aux instructions du fabricant.
3. Utilisez une seringue de 10 mL pour distribuer environ 2 mL par plaque de 35 mm.
4. Laisser durcir la silicone à température ambiante pendant 2-3 jours.

3. Préparer les ancrages de cire de brushite

1. À l'avance, préparez des moules à l'envers en silicone contenant des cylindresLls pour la formation d'ancre. Les moules inversés peuvent être fabriqués selon les spécifications de la forme et de la taille de l'ancre désirée.
   1. Déterminer la hauteur et le diamètre désirés de l'ancre finale. Ce protocole utilise un moule sur mesure formé à partir de silicone artisanal dans un plat de culture tissulaire de 35 mm dans lequel des cylindres en plastique d'environ 3,25 mm de diamètre ont été placés, permettant une hauteur de moule finale d'environ 6,5 mm. Les dimensions finales de l'ancrage ont une hauteur d'environ 3-3,5 mm et d'environ 3,4 mm de diamètre avec une tige de 1,5 mm dépassant du bas de l'ancre.
   2. Ajouter du silicone non durci à un plat de 35 mm dans lequel le moule sera fabriqué. Placez les bouteilles en plastique en conséquence.
      NOTE: La taille des cylindres en plastique déterminera le diamètre des ancrages finaux. Le placement des cylindres en plastique et la quantité de silicone utilisée peuvent être modifiés pour produire des ancres de différentes hauteurs. L'épaisseur entre le fond des puits dans le moule et le fond du moule lui-même sera dEterminez combien de la broche peut faire saillie du bas de l'ancre, ce qui permet à l'ancrage d'être fixé plus avant dans le plat en silicone.
   3. Après avoir laissé durcir la silicone, retirez les bouteilles en plastique et retirez le moule du plat de 35 mm.
2. Préparez une solution orthophosphorique 3,5 M / 100 mM d'acide citrique. Dissoudre 0,961 g d'acide citrique dans 11,5 ml d'acide orthophosphorique. Apportez le volume de la solution jusqu'à 50 ml avec de l'eau MilliQ. Stocker la solution à température ambiante et la protéger de la lumière.
3. Préparez les moules: Placez une goupille minutien au centre de chaque puits cylindrique dans les moules.
4. Combiner le phosphate de β-tricalcium et la solution d'acide orthophosphorique / acide citrique à une concentration de 1 g / mL dans un bateau de pesage en plastique sur glace.
5. Mélangez vigoureusement le ciment à l'aide d'un grattoir en plastique.
6. Triturer le ciment pour continuer à mélanger et mélanger la pipette dans le moule
7. Centrifugez le moule rempli pendant 1 min à 2 250 x g.
8. Laisser les ancrages de ciment de brossette se fixer à température ambiante pendant la nuit.
9. Retirer les ancrages du moule et épisser deux ancrages à 12 mm de distance dans chaque plaque revêtue de silicone.
10. Stériliser les plaques épinglées par pulvérisation avec 70% d'éthanol, en remplissant les plaques et les couvercles et en les plaçant dans un BSC. Après au moins 30 min, aspirer les plaques et remplacer les couvercles, en stockant le BSC jusqu'à ce qu'il soit nécessaire.

4. Obtenir du sérum humain

1. Assurez-vous que l'approbation par le comité d'éthique approprié a été obtenue pour ce protocole.
2. Assurez-vous que le consentement écrit et éclairé a été obtenu auprès de sujets humains pour participer à une intervention donnée ( par exemple , l'exercice, l'alimentation ou l'intervention de médicament) qui affectera les changements souhaités dans le sérum. Ici, nous décrivons la collecte au repos et 15 minutes après l'exercice de résistance.
3. En utilisant un phlébotomiste formé, obtenez un échantillon de sang de repos d'un participant par ponction veineuse dans un récipient évacué approprié.
4. Recueillir un échantillon de sang post-exercice 15 min après avoir participé aux participants dans le protocole d'exercice souhaité. Comme décrit précédemment ¹ , utiliser le protocole d'exercice de résistance dans cette expérience pour stimuler une réponse biochimique endogène.
   1. Demandez aux participants de faire cinq séries de presse-jambes avec une minute de repos entre les ensembles. Ensuite, demandez aux participants d'exécuter un ensemble d'extensions de genou et un ensemble de boucles d'ischio-jambiers consécutives sans repos, puis répétez les exercices dos à dos trois fois avec 1 min de repos entre les ensembles.
5. Laisser le sang coagler avant de centrifuger à 1500 xg pendant 10 min. Dans des conditions stériles, transférer le sérum dans des tubes stériles pour une complémentation future des milieux (sérum stocké à 4 ° C) et une analyse biochimique (une petite aliquote de sérum stockée à -20 ° C).

5. Forme des ligaments artificiels

REMARQUE: en avance, développez le fichier fiBrochez et préparez des plaques revêtues de silicone avec des ancrages à brossette pincés.

1. Préparer les réactifs:
   1. Préparer la thrombine. Dissoudre la thrombine bovine à 200 U / mL dans des milieux de glucose élevés au DMEM. Filtrer à 0,22 μm, aliquote, et stocker à -20 ° C.
   2. Préparer le fibrinogène. Dissoudre le fibrinogène bovin à 20 mg / mL dans des milieux de glucose élevés au DMEM. Incuber pendant 3-4 h dans un bain-marie à 37 ° C, tourbillonnant toutes les 30 minutes pour faciliter la dissolution. Filtrer à 0,22 μm (plusieurs filtres peuvent être nécessaires), une aliquote et stocker à -20 ° C.
   3. Préparer l'aprotinine. Dissoudre l'aprotinine dans 10 mg / ml dans de l'eau. Filtrer à 0,22 μm, aliquote, et stocker à -20 ° C.
   4. Préparer l'acide aminohexanoïque. Dissoudre l'acide aminohexanoïque à 0,1 g / ml dans l'eau. Filtrer à 0,22 μm, aliquote, et stocker à 4 ° C.
   5. Préparer l'acide ascorbique. Dissoudre l'acide ascorbique dans des milieux de glucose élevés au DMEM à une concentration de 50 mM. Filtrer à 0,22 μm et conserver à 4 ° C.
   6. Préparez la L-proline. Dissoudre la L-proline dans du PBS à une concentration de 50 mM. Filtrer à 0,22 μm et conserver à 4 ° C.
   7. Préparez le facteur de croissance de transformation-β1 (TGF-β1). Reconstituer TGF-β1 selon les instructions du fabricant à une concentration de 10 μg / mL. Aliquote et entreposez à -20 ° C.
2. Déterminer le nombre de constructions requises pour l'expérience et s'assurer qu'un nombre suffisant de plaques épinglées sont préparées. Des répliques biologiques et techniques sont recommandées. Dans l'étude ¹ soulignée ici, utilisez des répliques techniques en double et 12 répliques biologiques (sérum de 12 personnes au repos et après l'exercice).
   REMARQUE: procédez comme suit dans des conditions stériles dans un BSC.
3. Développez les cellules en cultivant dans des plaques de 15 cm jusqu'à une confluence de 70%. 2,5 x 10 ⁵ cellules sont nécessaires pour chaque construction.
4. Trypsiniser les cellules et resuspendre dans le GM à une concentration de 3,67 x 10⁵ cellules / ml.
5. Générer un mélange maître pour le nombre de constructions requises: Pour 1 construction, le mélange maître contient une suspension cellulaire de 681 μL (contenant 2,5 x 10 ⁵ cellules), 29 μL de thrombine, 2 μl d'aprotinine et 2 μL d'acide aminohexanoïque.
6. Après avoir mélangé bien le mélange maître, ajouter 714 μL à chaque plaque épinglée dans un schéma de la figure 8 autour des ancrages de ciment de brushite. Assurez-vous que le mixage principal entre directement les côtés des ancrages.
7. Tapez doucement chaque plaque pour distribuer le mélange principal uniformément sur la plaque.
8. Pour une plaque à la fois, ajouter rapidement 286 μl de fibrinogène de façon égouttement uniforme sur une plaque et faire glisser immédiatement la plaque d'avant en arrière et de côté en face sur la surface du BSC pour distribuer le fibrinogène pour former les gels de fibrine incorporés dans la cellule . Passez à la plaque suivante.
9. Placer les constructions dans un incubateur stérile maintenu à 37 ° C et 5% de CO ₂ et incuberPendant au moins 15 minutes pour permettre la polymérisation du fibrinogène.
10. Préparez suffisamment de supports d'alimentation (FM) pour 2 mL par construction. Supplémentaire GM avec 200 uM d'acide ascorbique, 50 μM de proline et 5 ng / mL de TGF-β1.
11. Ajoutez 2 mL de FM pour couvrir chaque construction. Culturez les constructions dans un incubateur stérile maintenu à 37 ° C et 5% de CO ₂ pour un total de 14 jours ou au point final désiré, rafraîchissant les médias tous les deux jours avec 2 mL de FM

6. Les ligaments conçus pour l'essai de traction

REMARQUE: Le test de traction a été effectué à l'aide d'un testeur de traction personnalisé dans un bain de PBS; Les poignées moulées en retour qui sont couplées au transducteur de force tiennent les ancres de ciment à brosse en place pendant l'essai.

1. Déterminer la longueur et la largeur des constructions du ligament à l'aide d'étriers numériques; Calculez la section transversale du tissu.
2. Déposer la construction du ligament de la plaque et placer les ancrages dans laDes poignées moulées inverse, assurant que la construction est submergée dans PBS.
3. Réglez la distance entre les poignées, définissant la longueur de la construction à sa longueur initiale.
4. Commencez le test: faites passer la construction à une défaillance à une vitesse de déformation de 0,4 mm / s (ou ~ 3% / s).
5. Après l'achèvement du test, traiter les restes tissulaires pour la teneur en collagène (voir la section 7).
6. A partir des données de décharge-décharge résultantes, calculer les données contrainte-déformation et quantifier les propriétés mécaniques d'intérêt; Par exemple, la charge de traction maximale, la résistance à la traction et le module ( c'est-à-dire une propriété élastique sur une région linéaire de la courbe contrainte-déformation).

7. Quantification du contenu en collagène des ligaments artificiels

1. Retirer les ligaments modifiés des ancrages de ciment à brosselle et sécher à 120 ° C pendant 25 min.
2. Déterminer la masse sèche des constructions et les placer dans des tubes individuels de 1,5 mL. Les constructions à sec peuvent être stockées à température ambianteJusqu'à un traitement ultérieur.
3. Pour chaque construction, ajouter 200 μL de HCl 6 M. Faire bouillir à 120 ° C dans un bloc de chauffage pendant 2 h dans une hotte aspirante.
   ATTENTION: Le HCl est hautement corrosif et acide, il est recommandé d'utiliser des tubes anti-éponge ou de sécurité ou d'autres méthodes de fixation des tubes.
4. Centrifuger brièvement les tubes pour collecter le liquide et les laisser reposer pour évaporer à 120 ° C dans un bloc de chauffage pendant 1,5 h dans une hotte aspirante.
5. Remettre en suspension la pastille résultante dans 200 μL de tampon d'hydroxyproline. Conserver à -20 ° C jusqu'à ce qu'il soit nécessaire.
   1. Préparer le tampon hydroxyproline. Dans 300 ml d'eau, ajouter 16,6 g d'acide citrique, 4 mL d'acide acétique, 11,4 g de NaOH et remuer jusqu'à dissolution. PH à 6-6,5 et augmente le volume jusqu'à 500 mL. Ajouter 250 μL de toluène comme conservateur et conserver à 4 ° C protégé de la lumière.
6. Préparez les réactifs.
   1. Préparez la trans-4-Hydroxy-L-proline. Dissoudre dans de l'eau pour obtenir une solution de 4 mg / ml.
   2. Préparer la chloramine-T. Dissoudre dans de l'eau pour obtenir une solution de 14,1 mg / ml.
   3. Préparer l'aldéhyde-perchlorate. Dissoudre 1,5 g de 4-diméthylaminobenzaldéhyde dans 6 mL de 1-propanol, 2,6 ml d'acide perchlorique (ATTENTION: corrosif, oxydant fort, utiliser les précautions appropriées) et 0,5 mL d'eau.
7. Dans un ensemble de nouveaux tubes de 1,5 mL, diluer un échantillon de chaque culot remis en suspension dans du tampon d'hydroxyproline à un volume de 200 μL.
   NOTE: Les dilutions peuvent varier de 1: 4 à 1:50 d'échantillon: tampon selon la teneur en collagène attendue de l'échantillon; Par conséquent, des tests d'essai et d'erreur peuvent être nécessaires pour déterminer un facteur de dilution approprié pour l'ensemble d'échantillons donné (c'est-à-dire placer les échantillons vers le milieu de la courbe standard).
8. Préparer les normes d'hydroxyproline. Diluer l'hydroxyproline dans le tampon d'hydroxyproline (voir section 7.5.1) à 80 μg / mL. Effectuez des dilutions en série pour produire des standards de 6-8 200 μL entre 0-20 μg / mL.
9. Ajouter 150 μL 14,1 mg /Ml de solution de chloramine T à chaque échantillon standard et dilué. Vortex et incuber à température ambiante pendant 20 min.
10. Ajouter 150 μL de solution de perchlorate aldéhyde à chaque échantillon et échantillon dilué. Vortex et incuber dans un bloc de chauffage à 60 ° C pendant 15 min. Éliminer la solution excédentaire de perchlorate aldéhyde en tant que déchets dangereux conformément à la réglementation locale (contient de l'acide perchlorique).
11. Laisser refroidir les normes et les échantillons, avant d'aliquoter 200 μL de chaque, en double, dans des plaques à 96 puits.
12. Lisez la plaque à 550 nm dans un spectrophotomètre. Éliminer la plaque et le volume restant dans des tubes de 1,5 mL comme déchets dangereux conformément à la réglementation locale (contient de l'acide perchlorique).
13. Calcul de la fraction totale de collagène et de collagène.
    1. Convertissez la valeur d'absorbance pour chaque échantillon en microgrammes d'hydroxyproline en utilisant la courbe standard d'hydroxyproline.
    2. Multipliez chaque puits par 2,5 pour calculer la quantité d'hydroxyproline dansL'échantillon dilué. Rappelons que seulement 200 de 500 μL de mélange total (200 μL d'échantillon dilué + 150 μL de solution de chloramine T +150 μL AP) sont ajoutés à chaque échantillon.
    3. Multipliez par facteur de dilution (section 7.7) pour calculer la quantité d'hydroxyproline dans l'échantillon d'origine.
    4. Diviser par 0.137 pour calculer la quantité de collagène (suppose que le collagène contient 13,7% d'hydroxyproline ²⁰ ).
       NOTE: L'abondance d'hydroxyproline de mammifères dans le collagène varie légèrement entre les tissus et les espèces de mammifères; Par exemple, le tendon d'Achille de porc et de mouton contient 13,5 et 13,7% (masse d'hydroxyproline / masse sèche), respectivement ²¹ . Ici, utilisez 13,7% pour estimer le pourcentage d'hydroxyproline dans le collagène, qui est utilisé pour calculer la teneur en collagène d'un échantillon de tissu en utilisant l'équation suivante:
       
    5. Diviser par la masse sèche pour calculer le collagène fraCtion et convertir en un pourcentage.
       

8. Quantification des points d'extrémité moléculaires

REMARQUE: En plus des résultats primaires des tests de traction et de la teneur en collagène, les points d'extrémité moléculaires peuvent être mesurés sur un tissu 2D ou 3D pour ajouter une vision mécanique. Les résultats biologiques peuvent être utilisés pour déterminer les points d'extrémité moléculaires (voir la section suivante ci-dessous pour le contexte L'impact du milieu sérique post-exercice sur la fonction du ligament in vitro ).

1. Pour les tissus 3D:
   1. Préparer les constructions selon l'étape 5 ci-dessus.
   2. Après avoir construit un traitement / une intervention, construisons des glaçons dans l'azote liquide.
   3. À l'aide d'un mortier et d'un pilon refroidis sur de la glace carbonique, broyer les constructions dans une poudre. Continuez à l'étape 8.4 / 5).
2. Pour les tissus 2D:
   1. Culture des fibroblastes ACL humains à confluent en un moisOlayer dans des plaques à six puits contenant DMEM.
   2. Aspirer le DMEM et appliquer les moyens de traitement selon votre stratégie d'expérimentation ( p. Ex. , Le temps ou les expériences de réponse à la dose).
   3. Aspirer les milieux de traitement et les cellules de lavage avec du PBS.
   4. Rince les cellules pour collecter à l'aide d'un tampon d'extraction / réactif approprié (voir ci-après).
3. Analyse d'expression des protéines: utiliser un tampon d'extraction cytosolique ( p. Ex. , Saccharose 250 mM, Tris 50 mM pH 7,4, MgCl2 5 mM et cocktail anti-protéase / phosphatase) pour obtenir des lysats protéinés. Effectuer un dosage de concentration de protéines et poursuivre l'analyse selon les procédures standard de western blot.
4. Analyse d'expression génétique: isoler l'ARN total en utilisant un réactif d'isolation d'ARN de 500 μL conformément aux instructions du fabricant pour obtenir un ARN de haute qualité. Effectuer une transcription inverse et une analyse quantitative PCR en temps réel selon les procédures standard.
5. Isolation de l'ADN: isoler et quantifier gADN énomique en utilisant un réactif d'isolement d'ADN selon les instructions du fabricant. Quantifier la concentration d'ADN en utilisant un spectrophotomètre pour mesurer l'absorbance de l'échantillon à 260 nm.

Résultats

Vue d'ensemble de la formation de ligament artificiel et de l'intervention expérimentale

La figure 1 montre un aperçu de la formation de ligaments modifiés. Le ciment de brushite, un matériau substitut osseux ^22, est préparé en combinant une solution d'acide orthophosphorique / acide citrique avec du phosphate β-tricalcique dans des puits cylindriques. Alternativement, si l'on ne mesure pas directement la fonction mécanique des tissus, les sutures de soie 3-0 peuvent être utilisées comme ancres dans la formation d'un tissu. Ils sont épilés à 12 mm d'épaisseur dans des plats de 35 mm revêtus de silicone et stérilisés par trempage dans de l'éthanol à 70%. Les fibroblastes sont isolés des restes du ligament croisé antérieur obtenus lors de la chirurgie de reconstruction du LCA. Après l'expansion, 2,5 x 10 ⁵ cellules sont encapsulées dans un gel de fibrine formé dans le plat à épingle d'ancrage au ciment à la brosse. Après la formation, ligament constrOn peut examiner les modifications des propriétés mécaniques, la teneur en collagène, la prolifération cellulaire, l'expression des gènes, les niveaux de protéines et la morphologie tissulaire.

Tout au long de la culture, les cellules contractent le gel de fibrine et forment un tissu linéaire entre les deux ancrages ( figure 2A ). Après 1-2 jours de culture, les cellules ont été attachées au gel de fibrine, aux processus cellulaires étendus et ont commencé à exercer des forces de traction ( Figure 2B ). Comme le gel de fibrine est contracté par des forces de traction et décomposé par des enzymes cellulaires, une tension est générée entre les deux points d'ancrage et nos cellules s'alignent parallèlement à cet axe ( Figure 2B ) et commencent à déposer du collagène. Après 4 à 5 jours, les constructions se sont contractées autour des ancrages formant un tissu cylindrique linéaire ( figure 2A ; à ce stade, des stimuli externes peuvent être appliqués au système (intervÀ ce moment-là, évite de perturber le processus de formation linéaire des tissus). Les interventions peuvent consister à compléter les milieux de culture avec un sérum humain ou animal après une intervention donnée, des cytokines exogènes et des facteurs de croissance, en utilisant une stimulation mécanique ou en modifiant d'autres facteurs environnementaux tels que la tension de l'oxygène. En utilisant des milieux de croissance (DMEM avec 10% de FBS et 100 U / mL de pénicilline) additionnés d'acide ascorbique 200 u, de L-proline 50 μM et de TGF-β1 de 5 ng / mL, nous avons déterminé que la prolifération cellulaire se poursuit tout au long d'une culture de 2 semaines ( Figure 2C ) et en effet, le microscope optique révèle un tissu dense contenant des cellules hautement alignées à 14 jours de culture ( figure 2B ).

Évaluation des ligaments modifiés

À la fin de la période de culture, les ligaments modifiés peuvent être évalués dans un varietPlusieurs façons. Un avantage majeur de ce système est la capacité à déterminer les changements fonctionnels du tissu via des tests mécaniques, une évaluation vitale compte tenu du rôle mécanique du ligament indigène. Des tests de traction uniaxial peuvent être utilisés pour mesurer les propriétés mécaniques, y compris la charge à l'échec, la résistance à la traction finale et le module de Young. Les propriétés viscoélastiques peuvent également être mesurées avec des tests de relaxation du stress et de fluage. La figure 3A représente un ligament manipulé maintenu dans des poignées moulées inverse dans un testeur de traction uniaxial sur mesure. La poignée droite est attachée à un transducteur de force pour mesurer la charge à travers le ligament lorsque le tissu est tendu à l'échec. La figure 3B montre un diagramme représentatif de contrainte-contrainte pour un test à l'échec. Après avoir subi des essais mécaniques, les mêmes constructions peuvent être séchées et traitées pour un dosage d'hydroxyproline ²³ pour évaluer la teneur totale en collagène ainsi que d'autres biocheTests miques. Avec un nombre suffisant d'échantillons supplémentaires par condition, un examen approfondi d'une intervention expérimentale peut être mené, y compris ses effets sur la prolifération cellulaire, l'expression des gènes et des protéines et la morphologie histologique. Alors que 14 jours sont un critère d'évaluation typique pour nos études, les ligaments modifiés continuent à s'améliorer dans leurs propriétés mécaniques et leur teneur en collagène au cours de 28 jours de culture, comme le montre la figure 3C et peuvent survivre pendant au moins 3 mois en culture ²⁴ .

La variabilité des donneurs est une considération importante pour la répétabilité expérimentale. La figure 4 montre une expérience représentative rapportée par Lee et al. ²⁵ comparant 7 donneurs d'ACL différents (n = 3 hommes et n = 4 femelles) démontrant des propriétés de traction typiques et la teneur en collagène après une culture de 2 semaines dans le décrit précédemment Médias de croissance complétés. En utilisant des cellules provenant de collections ACL similaires, l'âge du donneur, le temps après la blessure, le genre, etc., les ligaments modifiés démontrent une faible variabilité entre les donneurs et des caractéristiques similaires entre les donneurs masculins et féminins, à l'exception de la différence de fraction de collagène. Dans l'étude susmentionnée, les ligaments modifiés ont été utilisés comme modèle in vitro pour étudier pourquoi les femmes ont un risque significativement plus élevé de lésions ACL que les hommes et ont démontré que les fibroblastes ACL isolés des donneuses femelles ne forment pas forcément des ligaments mécaniques plus faibles et moins collagènes25.

L'impact du milieu sérique post-exercice sur la fonction de ligament in vitro

Nous avons précédemment démontré la capacité des ligaments modifiés à utiliser pour sondage des processus physiologiques ^{1 ,}Ss = "xref"> 25. Dans l'expérience représentative suivante, rapportée par West et al. ¹ , nous avons déterminé les effets biochimiques de l'exercice sur la fonction du ligament et soulignons la méthodologie et les résultats ici. Nous avons formé des ligaments modifiés à l'aide de cellules ACL humaines et avons appliqué une intervention, au jour 7 de la culture, consistant en un milieu de culture conditionné avec du sérum humain prélevé avant ou après l'exercice. En bref, nous avons recruté des jeunes participants masculins en bonne santé et collecté des échantillons de sang avant et après un exercice de résistance aiguë qui augmente les hormones circulantes et les cytokines, y compris l'hormone de croissance humaine (GH). Le sérum humain a été isolé à partir d'échantillons de sang pré et post-exercice et utilisé à la place du sérum bovin fœtal dans les milieux de culture pour la deuxième semaine de culture ligamentaire manipulée ( Figure 5A ). Les échantillons de sérums pré et post-exercice ont été analysés à l'aide d'ELISA pour des modifications de la GH et du facteur de croissance 1 de l'insuline (IGF-1)Dont la concentration peut être modifiée par l'exercice ( figure 5B ). Cette information a été utilisée pour corréler les effets sériques sur les ligaments modifiés avec des changements dans le sérum en réponse à l'exercice. Après une période de culture de 14 jours, les constructions du ligament ont été évaluées à l'aide de tests mécaniques et une détermination de la teneur en collagène de l'hydroxyproline et ont démontré une augmentation significative de la charge de traction maximale et de la teneur en collagène en réponse au sérum post-exercice. Dans le but d'évaluer si cet effet était lié aux libérations induites par l'exercice de GH ou d'IGF-1, des ligaments modifiés ont été formés dans une expérience séparée et traités avec une réponse à la dose de GH recombinant humain ou d'IGF-1. Fait intéressant, bien que la GH sérique augmente dans le sang ( Figure 5B- i), la concentration croissante progressive de GH dans les milieux de culture n'a pas augmenté la teneur en collagène ( Figure 5D -i) ou mécaniquePropriétés (données non représentées) dans les ligaments modifiés. En revanche, les taux sériques d'IGF-1 n'ont pas augmenté après l'exercice, mais une expérience dose-réponse a révélé que les niveaux croissants dans les milieux de culture ont amélioré la teneur en collagène des constructions du ligament ( figure 4D -ii). Ainsi, alors que l'exercice a entraîné une augmentation robuste de la GH après l'exercice, l'expérience dose-réponse utilisant rhGH soulève des doutes quant à savoir si GH est directement responsable de l'amélioration phénotypique des ligaments modifiés (au moins, l'isoforme de 22 kDa seule ne Semble être responsable). À l'inverse, alors que l'IGF-1 du sérum n'a pas été altéré à 15 min après l'exercice, le test de la rhIGF-1 sur une large gamme de concentrations a révélé que l'IGF-1 est capable d'améliorer la teneur en collagène; Cependant, il convient de noter que l'augmentation des concentrations de rhIGF-1 dans une gamme qui a estimé les niveaux physiologiques n'a pas augmenté de manière significative la teneur en collagène. Ainsi, l'environnement sérique post-exercice uniqueÉtait important pour améliorer la mécanique et le collagène des ligaments manipulés.

Dans l'étude mise en évidence ici ¹ , le volume de sérum expérimental était limité en raison de considérations éthiques; Donc, les essais biologiques à 2D à court terme, qui avaient des exigences sériques plus faibles, ont été utilisés pour approfondir les mécanismes moléculaires responsables de l'augmentation du collagène qui a été observée. Les fibroblastes ACL ont été cultivés en confluence dans des plaques à 6 puits et traités pendant 1 heure avec un sérum de repos ou post-exercice, et comparés aux réponses de dose de GH recombinant, d'IGF-1, de TGF-β1 et d'activation de cibles dans le PI3K / mTORC1 , ERK1 / 2, et les voies de signalisation de Smad ont été déterminées. En présence de sérum post-exercice, la voie PI3K / mTORC1 et ERK1 / 2 a montré une plus grande activation, telle que évaluée par phosphorylation de S6K ( Figure 5D -i) et ERK1 / 2 ( Figure 5D -ii), respectivement.Par rapport aux réponses aux doses d'hormones et de cytokines, tandis que la GH a eu un faible effet positif sur la signalisation du mTOR ( Figure 5D- i) et l'IGF-1 a montré un effet positif à la dose la plus faible, les trois traitements de GH, IGF-1 et TGF -β1 n'a pas tenu compte de l'augmentation de la signalisation PI3K / mTORC1 et ERK1 / 2. Ensemble, notre modèle de ligament 3D conçu et les données de dosage biologique 2D suggèrent que l'environnement sérique après l'exercice est capable d'améliorer la fonction de ligament et le contenu en collagène par l'activation des voies PI3K / mTORC1 et ERK1 / 2.

En résumé, en utilisant un modèle de ligament artificiel combiné avec un sérum conditionné par l'exercice, nous avons pu: i) étudier l'effet de l'environnement sérique post-exercice sur la fonction du ligament modifié et le collagène, ii) corréler les changements dans le phénotype du ligament avec des changements de la concentration d'hormone sérique, Dans le but de déterminer quels changements dans le sérum ont conduit à changEs dans les ligaments d'ingénierie, et iii) en outre, la portée du travail en utilisant des essais biologiques 2D pour sonder les cibles moléculaires du milieu biochimique sérique afin de déterminer les mécanismes moléculaires qui sont activés par le sérum post-exercice qui entraînent des améliorations dans la fonction du ligament.

Figure 1: Aperçu de la formation et de l'utilisation des ligaments modifiés. Les ancrages de ciment de brushite sont fabriqués et épinglés dans des plaques revêtues de silicone. Les fibroblastes primaires sont isolés et développés à partir des restes ACL. Les ligaments mécanisés sont formés en encapsulant des fibroblastes dans un gel de fibrine autour de deux ancrages de ciment à brosse. Les ligaments fabriqués sont cultivés et traités avec les stimuli chimiques ou mécaniques spécifiques ( par exemple , par un bioréacteur) souhaités. Au point final souhaité, les ligaments modifiés peuvent être collectés et évalués pour le mécaniqueL propriétés, l'expression des gènes, la teneur en collagène, l'expression des protéines et l'histologie. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2. Les fibroblastes de ligaments primaires forment un ligament artificiel à base de fibrine à base de fibre à base de deux ancres de ciment de brosselle. ( A ) Au fil du temps, les fibroblastes contractent le gel de fibrine autour des ancres de ciment de brushite formant un tissu linéaire. ( B ) Au cours des trois premiers jours, les cellules se fixent au gel de fibrine et exercent des forces de traction, alignant les cellules avec l'axe long de la construction. Plus de 14 jours, les cellules forment un tissu fortement aligné. Barre d'échelle = 160 μm. ( C ) La teneur en ADN des ligaments modifiés continue d'augmenter oVer 14 jours en culture à mesure que les cellules prolifèrent. Les données sont présentées comme moyen ± SD avec n = 3-4 constructions par groupe. groupes. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3: les propriétés mécaniques du ligament artificiel et la teneur en collagène s'améliorent avec le temps. ( A ) Les constructions de ligament sont testées de manière uniaxialement pour déterminer l'effet d'une intervention donnée sur la fonction du ligament. Comme on l'a vu, deux poignées imprimées 3D moulées à l'arrière maintiennent des ancrages à forme réciproque qui sont reliés par le tendon mécanique. Les ancrages sont couplés à un moteur pas à pas et à un transducteur de force pour générer des courbes contraintes / contraintes du tissu testé, ce qui permet de déterminer les propriétés mécaniques. ( B </ Strong>) Courbe contrainte-déformation représentative d'un ligament artificiel tendu à l'échec. Au cours de 28 jours, ( C ) la résistance à la traction finale (UTS), ( D ) la charge de traction maximale (MTL), ( E ) le module de Young et ( F ) la fraction de collagène continuent à s'améliorer. Les données sont présentées sous la forme moyenne ± SD avec n = 5 constructions par groupe. * Indique une différence significative par rapport à tous les autres groupes. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4: Les ligaments mécanisés peuvent être évalués pour la fonctionnalité et le contenu biochimique, affichant une faible variabilité des donneurs. Des ligaments fabriqués ont été formés 7 donneurs différents (n = 3 hommes, n = 4 femelles). Après 2 semaines o(Culture), on a évalué les différences dans ( A ) la charge de traction maximale, ( B ) la résistance à la traction finale (UTS), ( C ) le module de Young, ( D ) la section transversale (CSA), ( E ) la teneur totale en collagène par Construire, et ( F ) le collagène en tant que fraction de masse sèche. Les données sont présentées sous la forme moyenne ± SD et la signification statistique a été effectuée avec le test t de Student. * Indique une différence significative par rapport aux autres groupes (p <0,05). Figure adaptée de Lee et al. ²⁵ Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5. Les ligaments artificiels démontrent des changements mécaniques et biochimiques en réponse au bioloInterventions locales. ( A ) Le sérum a été isolé des prélèvements de sang recueillis auprès de sujets pré (RestTx) et post-exercice (ExTx) et utilisés pour traiter les ligaments modifiés pendant la deuxième semaine de culture. ( B ) (i) l'hormone de croissance humaine (GH) et (ii) le taux de facteur de croissance de l'insuline (IGF) -1 dans le reste et le sérum d'exercice ont été quantifiés par ELISA. ( C ) Les ligaments fabriqués avec ExTx ont démontré une teneur en collagène améliorée (i) et (ii) une charge de traction maximale. La signification statistique des comparaisons appariées (RestTx et ExTx) a été analysée par un test t avec un niveau de signification fixé à p <0,05. ( D ) Une dose-réponse de (i) GH et (ii) IGF-1 a été utilisée pour déterminer les contributions possibles de ces facteurs aux modifications de la teneur en collagène due à ExTx. E) Des essais biologiques 2D ont été utilisés pour comparer les effets de doses croissantes de GH, RestTx et ExTx sur des cibles de signalisation moléculaire telles que la phosphorylation de (i) S6K ^Thr389 et (ii) ERK1 / 2 ^{Thr202 / Tyr204} . La comparaison statistique de plus de deux groupes expérimentaux a été effectuée en utilisant ANOVA et HSD de Tukey. Les données sont présentées sous la forme de moyenne ± SD. * Indique une différence significative par rapport au contrôle (p <0,05) et § indique une différence significative par rapport à 150 ng / mL et à 300 ng / mL d'IGF-1. Figure adaptée de West et al. ¹ Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Le présent manuscrit décrit un modèle de tissu ligamentaire qui est une plate-forme expérimentale utile pour les chercheurs ayant un large éventail de sujets de recherche, du développement tissulaire aux questions de traduction / clinique. Le modèle de ligament conçu ici est basé sur un protocole polyvalent qui peut être adapté à différents points tout au long du flux de travail ( Figure 1 et Section de discussion ). En outre, la nature intrinsèquement réductionniste de l'environnement in vitro peut être rapprochée du domaine physiologique en complétant les milieux d'alimentation avec un sérum humain ou animal conditionné.

Les constructions peuvent être formées à l'aide de fibroblastes provenant de diverses sources
Bien que la méthodologie et les résultats représentatifs présentés ici soient basés sur l'utilisation de fibroblastes primaires de l'ACL, le protocole d'isolement cellulaire peut être ajusté pour collecter d'autres types de fibroblastes primaires. Comme décritSur la figure 4 , les ligaments modifiés formés avec des cellules primaires isolées de jeunes donneurs humains montrent une faible variabilité des donneurs. Les cellules primaires sont limitées par l'isolement initial et la restriction de passage; L'utilisation de lignées cellulaires peut améliorer la reproductibilité des expériences. L'utilisation d'autres types de cellules peut nécessiter des modifications dans les milieux de culture cellulaire et la formulation de gel de fibrine. Par exemple, nous avons observé que les cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC) ne sont pas capables de former des tissus linéaires entre les ancrages de ciment de brosselle au cours de 2 semaines alors que les fibroblastes tendineux à flexion numérique équine supérieurs, les cellules stromales de moelle osseuse équine, les fibroblastes de tendon embryonnaire de poulet , Et les MSC C3H10T1 / 2 murins se contractent rapidement et digèrent le gel de fibrine pour former un tissu linéaire (observations non publiées). Ce contraste peut être une conséquence des différences de contractilité cellulaire, de prolifération et de production d'enzymes fibrinolytiques.

Application du produit chimiqueEt stimulation mécanique
Dans le procédé décrit ici, le tissu à base de fibrine se forme autour des ancres de ciment à brosse, permettant l'application d'une stimulation mécanique via un bioréacteur étirable ¹¹ , ainsi que pour le test de traction au point final. La présence de l'interface entre le ciment de brossette et les tissus mous (enthesis) offre également une possibilité d'approfondissement et d'amélioration ^{22 , 26} (voir la section des applications cliniques ci-dessous). Dans cet environnement in vitro , la contribution des facteurs chimiques et mécaniques peut être plus facilement identifiée; Un exemple de ceci est montré dans la figure 5 , dans lequel l'effet de l'environnement sérique post-exercice a été séparé des stimuli mécaniques de l'exercice. Des études pilotes peuvent être nécessaires pour déterminer le calendrier des interventions expérimentales, la composition des traitements et les paramètres appropriés pour s'attendre à un changement observable. FoPar exemple, dans l'étude sérique post-exercice ¹ , la durée du traitement expérimental a été limitée par la fourniture de sérum utilisé pour compléter les médias, à partir de laquelle des constructions ont été alimentées tous les deux jours. En outre, au cours de la deuxième semaine de culture, les milieux de culture ont été complétés par un sérum de repos ou post-exercice avec de l'acide ascorbique et une L-proline maintenue pendant que le TGF-β1 a été éliminé. TGF-β1 est un facteur de croissance pro-fibrotique connu qui augmente dans le sérum après l'exercice ²⁷ . Par conséquent, pour éviter d'obscurcir les effets liés au TGF-β1 du sérum post-exercice, cette cytokine n'a pas été maintenue dans les milieux de culture.

Ce modèle de ligament artificiel peut également être utilisé pour tester l'effet de l'étirement mécanique. En faisant appel à des poignées modélisées inversées pour maintenir les extrémités d'ancrage du ciment de brossette (semblable au testeur de traction uniaxial représenté sur la figure 1 ), les bioréacteurs étirables peuvent être conçus pour s'adapter à eng. Ligaments inefficaces. Notre laboratoire a précédemment utilisé ce modèle pour étudier la réponse de signalisation moléculaire des ligaments modifiés à un étirement de traction uniaxial dans un bioréacteur fait sur mesure ¹¹ qui permettra de mieux comprendre la conception rationnelle d'un paradigme d'étirement in vitro ou même potentiellement in vivo Extension / activité / applications thérapeutiques.

Évaluation des ligaments modifiés
Comme pour la culture monocouche traditionnelle, les constructions 3D peuvent être testées pour l'expression génique / protéine; En outre, leur morphologie 3D offre également l'opportunité d'évaluer les changements fonctionnels et morphologiques et les constructions peuvent être maintenues en culture pour des études à long terme ( Figure 3 ). Bien que les ligaments modifiés n'équivalent pas aux ligaments indigènes et matures, ils ressemblent à des tendons / ligaments en développement et se comportent de manière similaire aux tissus indigènes en réponse aux nutriments"> 26, les facteurs de croissance ¹⁰ , les hormones ²⁵ et l'exercice ^{11 , 28.} Ainsi, bien que la prudence soit justifiée avant de généraliser de manière générale n'importe quel modèle in vitro , les résultats du test de construction du ligament peuvent révéler ou informer un mécanisme physiologique particulier qui pourrait être autrement Impossible d'enquêter in vivo.

Supplément alimentaire avec sérum conditionné pour un modèle flexible et dynamique avec de larges applications
Le métabolome du sérum humain est un milieu de ~ 4 500 composés, y compris, mais sans s'y limiter, les glycoprotéines, les lipoprotéines, les dérivés lipidiques, les substrats énergétiques, les métabolites, les vitamines, les enzymes, les hormones, les neurotransmetteurs et une pléthore de blocs de construction / intermédiaires. ²⁹ Une inspection supplémentaire du métabolome du sérum humain selon les classes composées ²⁹ révèle une additiAvantages généraux d'intégrer le sérum expérimental dans des expériences in vitro. C'est-à-dire que la majorité des ~ 4500 composés dans le sérum sont hydrophobes ou dérivés de lipides, soulignant l'importance de la liaison des protéines pour le transport / solubilisation. Il s'ensuit que la récurrence expérimentale de la dynamique du transport composé endogène, et donc la biodisponibilité et les interactions composé-cible, serait presque impossible. Ainsi, le sérum expérimental est particulièrement efficace pour l'étude de composés qui dépendent des molécules accessoires pour la solubilisation, le transport, la liaison cible et le mécanisme d'action.

Notre laboratoire a un intérêt de longue date pour les avantages pour la santé de l'exercice. L'exercice améliore la fonction cellulaire et organique dans une variété de tissus dans tout le corps ¹² , un effet qui peut être attribué à une variété de facteurs (p. Ex., IL-6 ¹³ , IL-15 ¹⁴ , Meteorin- ¹⁵ ,Exosomes ^{16 , 17} ) qui sont libérés dans la circulation systémique. Le milieu biochimique post-exercice reflète les facteurs libérés à la fois de la contraction des hormones sensibles à l'exercice des muscles squelettiques ainsi que des facteurs qui sont libérés à la suite de la stimulation du système nerveux sympathique des glandes sécrétoires ( p. Ex . Cortisol et catécholamines de la glande surrénale ¹⁸ et croissance Hormone de l'hypophyse antérieure ¹⁹ ). Nous avons récemment utilisé un modèle de sérum pré et post-exercice pour étudier les effets du milieu biochimique induit par l'exercice sur le tissu artificiel. ¹ Bien que de nombreuses questions importantes de recherche liées à l'exercice restent, le modèle n'est en aucun cas limité de cette façon. Par exemple, le sérum peut être obtenu, soit à partir de sources animales ou humaines, suite à des interventions alimentaires ou pharmacologiques, ou à partir de différents groupes d'âge ou de la population cliniqueS ³⁰ . De cette manière, des composés exogènes ou endogènes d'intérêt seront présents dans le sérum et les milieux de traitement, dans des quantités biodisponibles et interagiront avec le tissu cible de concert avec le milieu endogène ( c.-à-d . Dans un contexte plus physiologique). Cette approche est dynamique car il est très probable qu'une intervention donnée exercera un effet multi-organe (et multi-composé) et que le milieu physiologique sera co-modifié. Bien que cette approche présente certains défis, puisque de multiples variables biochimiques systémiques sont modifiées simultanément, c'est une approche qui peut aider à surmonter les inconvénients de la méthodologie expérimentale purement réductionniste ^{31 , 32} . Ensemble, la mise en œuvre du sérum conditionné avec un tissu biomimétique (biomimétique in vitro ) peut être utilisé comme outil de physiologie, de nutrition et de recherche clinique.

Les applications cliniques sont nombreuses
Le modèle d'ingénierie tissulaire présenté ici peut être utilisé pour étudier les questions de recherche anatomique et clinique que les modèles in vitro traditionnels ne peuvent pas. Un ligament ou un tendon in vivo contient une région de transition de tissu doux à dur appelée enthesis. L'enthesis, qui est vulnérable aux blessures liées au stress mécanique ³³ , peut être étudié en coupe transversale par des techniques de microscopie histochimique et électronique ^{22 , 26} . Cette interface unique est doublement importante pour ceux qui ont une mobilité faible ou limitée, car l'inactivité physique nuit à la capacité du tissu conjonctif à transférer la charge à des régions de faible à haute conformité ³⁴ , entraînant finalement une diminution globale de la conformité des tissus et un risque accru de blessure.

Notre laboratoire a récemment utilisé ce modèle d'ingénierie tissulaire ^{25 <}/ Sup> pour modeler une autre population, les athlètes féminines, qui sont à risque pour les lésions du tissu conjonctif: l'incidence de la lésion ACL est environ cinq fois supérieure à celle de leurs homologues masculins ³⁵ . Les mécanismes potentiels qui sous-tendent cette disparité fondée sur le sexe dans les blessures ont été étudiés en traitant les constructions de ligaments avec des concentrations physiologiques de l'hormone sexuelle féminine, des œstrogènes, à des concentrations qui imitaient les étapes du cycle menstruel. Il est intéressant de noter que de fortes concentrations d'œstrogène ont inhibé l'expression du gène et l'activité de la lysl oxydase, principale enzyme responsable de la création de liaisons de lysine-lysine dans la matrice de collagène des ligaments et des tendons. Fait important, 48 h d'œstrogène élevé (pour simuler la phase folliculaire) ont diminué la rigidité de la construction du ligament sans altérer la densité de collagène des constructions. D'un point de vue physiologique, cela suggère que l'augmentation du laxisme des ligaments chez les femmes peut être due, au moins en partie, à une diminutionFormation de liaison croisée. D'un point de vue expérimental, ces résultats ²⁵ mettent en évidence l'utilité du modèle de construction 3D, qui a permis d'examiner l'activité de réticulation fonctionnelle. D'un point de vue clinique, ce modèle peut maintenant être utilisé pour dépister rapidement des interventions qui peuvent empêcher les effets négatifs de l'œstrogène de la fonction du ligament.

Remarques de clôture
Ici, nous avons présenté une méthodologie détaillée pour la formation de ligaments modifiés et leur utilité en tant que modèle de tissu 3D in vitro . Le modèle est hautement adaptable à un large éventail d'objectifs, offrant une certaine flexibilité dans le type de cellule, les interventions et les mesures de résultat d'intérêt. La supplémentation des milieux d'alimentation avec le sérum conditionné ajoute un contexte physiologique qui ne peut être atteint dans un environnement traditionnel in vitro , améliorant ainsi la modélisation de la physiologie in vivo . En bref, nous croyons que c'est un mode largement applicableJ'ai des implications intéressantes pour favoriser les domaines de la physiologie et de l'ingénierie tissulaire.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20	Entomoravia	N/A	For brushite cement anchors
β-tricalcium phosphate	Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK)	N/A	For brushite cement anchors
o-phosphoric acid, 85% (w/w)	EMD Millipore	PX0995	For brushite cement anchors
Citric acid	Sigma-Aldrich	251275-500g	For brushite cement anchors
Falcon 35 mm tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772A	For silicone-coated plates
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Ellsworth Adhesives	4019862	For silicone-coated plates
1x Phosphate-buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	SH3002802	For cell isolation and expansion
100x antibiotic/antimycotic solution	VWR	45000-616	For cell isolation
Type II collagenase	Thermo Fisher Scientific	17101015	For cell isolation
100x penicillin/streptomycin solution	Thermo Fisher Scientific	15140122	For cell isolation
Steriflip-GP, 0.22 µm pore, polyethersulfone, gamma irradiated	EMD Millipore	SCGP00525	For reagent sterilization
DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine	VWR	10-013-CV	For cell and tissue culture
Fetal bovine serum	BioSera	FBS2000	Component of tissue digestion media and growth media
Penicillin G Potassium Salt	MP Biomedicals	0219453680 - 100 MU	Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20°C.
CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 mm x 20 mm)	VWR	82050-598	For cell culture
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	T10282	For cell isolation
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	25200056	For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301	For cell freezing media
Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	For cell freezing
BD Vacutainer Red Plastic 10 mL	Fisher Scientific	367820	For human serum collection
Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22 G x 1 inch Needle	Fisher Scientific	354221	For human serum collection
Thrombin, bovine origin	Sigma-Aldrich	T4648-1KU	For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
Fibrinogen, bovine origin	Sigma-Aldrich	F8630-5G	For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
Aprotinin from bovine lung	Sigma-Aldrich	A3428	For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
6-Aminohexanoic acid	Sigma-Aldrich	07260-100g	For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at 4 °C.
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960-5G	Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C.
L-proline	Sigma-Aldrich	P5607-25G	Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C.
Transforming growth factor-β1	Peprotech	100-21	Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer's instructions at a concentration of 10 μg/mL. Aliquot and store at -20 °C.
Stericup-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, 250 mL, radio-sterilized	EMD Millipore	SCGPU02RE	For reagent sterilization
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144-212	Dilute in water to 6 M
4-Dimethylaminobenzaldehyde	Sigma-Aldrich	39070-50g	For hydroxyproline assay
Chloramine-T trihydrate	Sigma-Aldrich	402869-100g	For hydroxyproline assay
trans-4-Hydroxy-L-proline	Sigma-Aldrich	H54409-100g	For hydroxyproline assay
1-propanol	Sigma-Aldrich	279544-1L	For hydroxyproline assay
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	311421-250ml	For hydroxyproline assay
Acetic acid, glacial	EMD Millipore	AX0073-9	For hydroxyproline assay
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S318-500	For hydroxyproline assay
Toluene, anhydrous	Sigma-Aldrich	244511-1L	For hydroxyproline assay
Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates	Fisher Scientific	07-200-656	For hydroxyproline assay