Tratamento de Estruturas Ligamentares com Soro Condicionado por Exercício: Um Modelo Translacional de Engenharia de Tecidos

Resumo

Apresentamos um modelo de tecido ligamentar em que as construções tridimensionais são tratadas com o soro humano exercido pelo exercício e analisadas quanto ao teor de colágeno, função e bioquímica celular.

Resumo

As experiências in vitro são essenciais para compreender os mecanismos biológicos; No entanto, o fosso entre a cultura de tecidos monocamada e a fisiologia humana é grande, e a tradução de achados é frequentemente fraca. Assim, há uma ampla oportunidade para abordagens experimentais alternativas. Aqui apresentamos uma abordagem em que células humanas são isoladas de remanescentes de tecido de ligamento cruzado anterior humano, expandidos em cultura e usados ​​para formar ligamentos manipulados. O exercício altera o meio bioquímico no sangue, de modo que a função de muitos tecidos, órgãos e processos corporais é melhorada. Nesta experiência, o meio de cultura de construção do ligamento foi suplementado com soro humano experimental que foi "condicionado" pelo exercício. Assim, a intervenção é mais biologicamente relevante, uma vez que um tecido experimental é exposto ao meio bioquímico endógeno completo, incluindo proteínas de ligação e compostos adjuntos que podem ser alterados em conjunto com a atividade de umAgente desconhecido de interesse. Após o tratamento, os ligamentos manipulados podem ser analisados ​​quanto à função mecânica, teor de colágeno, morfologia e bioquímica celular. No geral, existem quatro vantagens principais em relação à cultura monocapas e modelos animais tradicionais, do modelo fisiológico do tecido ligamentar que é apresentado aqui. Primeiro, as construções do ligamento são tridimensionais, permitindo a quantificação de propriedades mecânicas ( isto é , função), como o esforço de tração final, a carga de tração máxima e o módulo. Em segundo lugar, o enthesis, a interface entre os elementos do osso e dos ossos podem ser examinados em detalhes e dentro do contexto funcional. Em terceiro lugar, a preparação de mídia com soro pós-exercício permite que os efeitos do meio bioquímico induzido pelo exercício, que é responsável pela ampla gama de benefícios para a saúde do exercício, sejam investigados de forma imparcial. Finalmente, este modelo experimental avança a pesquisa científica de forma humana e ética, substituindo o uso deAnimais, um mandato central dos Institutos Nacionais de Saúde, do Centro de Controle de Doenças e da Administração de Alimentos e Medicamentos.

Introdução

As lesões do tendão e do ligamento são comuns e podem ter consequências debilitantes na mobilidade normal e na qualidade de vida. A intervenção cirúrgica é muitas vezes necessária, mas pode ter um sucesso limitado e variado ^{4 , 5} . A compreensão atual de como os tendões e os ligamentos se desenvolvem, amadurece e responde às lesões é incompleta e, portanto, são necessários modelos de pesquisa efetivos para fornecer informações sobre o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes ⁵ . Para resolver esta lacuna de conhecimento, modelos animais podem ser utilizados, mas os estudos in vivo são inerentemente complexos com dificuldade em controlar o meio ambiente e direcionar diretamente as intervenções para o tecido pretendido. Em contraste, o ambiente experimental pode ser facilmente controlado e monitorado in vitro com a cultura de células monocamadas tradicionais. No entanto, esta técnica pode simplificar demais o ambiente químico e mecânico e, portanto, não pode recapituarAtrasar o comportamento in vivo das células. A engenharia de tecido é capaz de se casar com as vantagens do ambiente complexo in vivo em modelos animais com o controle do ambiente in vitro e fornece uma ferramenta adicional para estudar fisiologia. Além disso, armados com uma melhor compreensão do desenvolvimento do ligamento, a engenharia de tecido também pode fornecer uma fonte de tecido de enxerto quando a reconstrução cirúrgica é necessária ⁶ . Assim, o método aqui descrito valida um tecido de engenharia 3D in vitro que pode ser usado para estudar a função e a morfologia do ligamento.

As construções de tendões ou ligamentos à base de fibrina foram utilizadas como modelo in vitro para estudar processos fisiológicos, incluindo fibrilogênese de colágeno ⁷ e desenvolvimento de tendões ⁸ , bem como aplicações de tradução em que sua utilidade como tecido de enxerto foi avaliada em um modelo de ovelha de cru anteriorReconstrução do ligamento ciar (ACL) ⁹ . Nosso laboratório já estabeleceu um modelo de ligamento de engenharia 3D que abrange duas escovas, um material substituto de ossos de fosfato de cálcio, âncoras de cimento. Este modelo pode ser submetido a diferentes condições experimentais com facilidade, simplesmente complementando os meios de cultura com fatores biológicos ¹⁰ ou aplicando estimulação mecânica ¹¹ . Importante, esse modelo de ligamento ósseo a osso permite a análise aprofundada da entesis, a interface entre os elementos do ossos e ossos, que é suscetível a lesões.

No estudo destacado ¹ aqui para apresentar esta metodologia, estávamos interessados ​​no efeito de mudanças induzidas pelo exercício no meio bioquímico sobre a função do ligamento. O exercício melhora a função celular e orgânica em uma variedade de tecidos em todo o corpo ^{2 , 3 , 12} , um efeito que pode ser atribuído à liberação de vários conhecidos (por exemplo, IL-6 ¹³ , IL-15 ¹⁴ , Meteorin-like ¹⁵ , exossomos ^{16 , 17} ) e outros fatores bioquímicos desconhecidos liberados para a circulação sistêmica . Além disso, o meio bioquímico pós-exercício é enriquecido com hormônios sensíveis ao exercício, cuja liberação é estimulada pela estimulação do sistema nervoso simpático das glândulas secretoras ( por exemplo , cortisol e catecolaminas da glândula supra-renal ¹⁸ e hormônio do crescimento da hipófise anterior ¹⁹ ). No entanto, i n vivo , é impossível diferenciar os efeitos do estímulo mecânico do exercício das alterações bioquímicas induzidas pelo exercício. Embora alguns estudos tenham caracterizado o aumento esperado de certos hormônios circulantes e citocinas em resposta a exercíciosComo mencionado acima, existem muitos fatores, conhecidos e desconhecidos, para recapitular fielmente in vitro. Ou seja, isolar alguns fatores para um estudo in vitro aborda inadequadamente a complexidade da resposta bioquímica. Neste estudo, investigamos como as mudanças no meio bioquímico sérico, provocadas pelo exercício, afetam a função do ligamento manipulado. Para isolar os efeitos das alterações bioquímicas, obtivemos soro de participantes humanos antes e depois de um exercício de resistência e usamos o tratamento de ligamentos de engenharia 3D formados usando fibroblastos de ligamento cruzado anterior humano (ACL). Usando este modelo, podemos obter dados funcionais, incluindo efeitos sobre propriedades mecânicas e conteúdo de colágeno, além de quantificar os efeitos na sinalização molecular.

Protocolo

Os procedimentos a seguir aderem a um protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Califórnia, Davis; Consulte o conselho de ética local antes de começar a pesquisa.

1. Isolar Fibroblastos Primários de Remédios ACL Humanos

NOTA: Mantenha a esterilidade e execute todas as etapas em um gabinete de segurança biológica (BSC).

1. Obtenha aprovação da placa de revisão de ética apropriada para a coleta e uso de tecidos humanos como descrito abaixo.
2. Prepare 5x solução antibiótica / antimicótica (ABAM), diluindo 100x solução antibiótica / antimicótica em solução salina tamponada com fosfato 1X (PBS)
3. Recolher fragmentos de tecido de ACL na solução 5X ABAM em um tubo cônico de 50 mL, armazenar a 4 ° C até o passo de digestão. Corte o tecido em fragmentos menores com uma lâmina de barbear, se necessário, até um tamanho máximo de 1 x 1 x 1 cm ³ .
   CUIDADO: Cumprir os regulamentos locais de risco biológico paraUso adequado de material de risco biológico e descontaminação e descarte de resíduos biológicos.
4. Prepare um volume suficiente de solução de colagenase para submergir os fragmentos de tecido. Dissolver colagenase tipo II (1 mg / mL) em meio de Eagle modificado com Dulbecco de alta glicose (DMEM) contendo 1x penicilina / estreptomicina e 20% de soro bovino fetal (FBS) e filtro a 0,22 μm.
5. Enxague o tecido ACL 3 vezes em PBS.
6. Digerir tecido. Transfira o tecido ACL para um novo tubo cônico de 50 mL e adicione um volume suficiente de solução de colagenase para submergir o tecido. Incubar a 37 ° C durante a noite (~ 17 h).
7. Antes da conclusão da duração da digestão, prepare meios de crescimento (GM), completando o meio de glicemia de DMEM com 10% de FBS e 100 U / mL de penicilina.
8. 15 minutos antes do tempo de digestão estar completo, vorteie o tubo de 50 mL que contém tecidos 3 vezes a cada 5 min.
9. Usando uma pipeta sorológica de 25 mL, triture o tecido digerido vigorosamente para quebrar o tiSair mais e desalojar as células.
10. Centrifugar a 1.500 xg por 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o grânulo em 10 mL de GM.
11. Repita as etapas 1.8-1.9 mais três vezes.
12. Após a última centrifugação, ressuspender o grânulo em 5-10 mL de GM. Use uma pequena amostra da suspensão celular para realizar uma contagem de células com um hemocitómetro e avaliar a viabilidade celular usando Trypan Blue.
13. Placa a suspensão celular em placas de cultura de tecidos de 15 cm com uma densidade de 3-4 x 10 ⁵ células por placa.
14. Cultura para 70% de confluência em uma incubadora estéril mantida a 37 ° C e 5% de CO ₂ , alterando o GM a cada três dias. Use ou armazene (veja abaixo) células dentro de 5 passagens.
15. Congele células para uso futuro.
    1. Tapsinsize células a 70% de confluência da seguinte maneira. Aspirar meios e lavar células com PBS. Adicionar suficiente pré-aquecido (37 ° C) 0,05% de tripsina para apenas cobrir o fundo de placas de cultura de tecidos. Coloque as placas na incubadora de culturaDurante 5 minutos até as células serem separadas (verifique se as células estão flutuando usando um microscópio de luz). Use uma pipeta para coletar células e distribuir em um tubo Falcon.
    2. Centrifugar para sedimentar células e ressuspender células em meio de glicose alto DMEM contendo 20% de FBS e 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Suspensão de células alíquotas em crioviais e arrefecida a -1 ° C / min durante pelo menos 24 h. Armazenar congelados congelados em nitrogênio líquido.

2. Prepare placas revestidas de silicone

1. Prepare placas de cultura de tecidos de 35 mm: Remova as tampas e aplique as placas abertas sobre uma superfície plana.
2. Misture o kit de elastômero de silicone de acordo com as instruções do fabricante.
3. Use uma seringa de 10 mL para dispensar aproximadamente 2 mL por placa de 35 mm.
4. Permitir que o silicone cure à temperatura ambiente durante 2-3 dias.

3. Prepare âncoras de cimento Brushite

1. Com antecedência, prepare moldes reversíveis de silicone contendo cilíndricos nósLls para a formação da âncora. Os moldes reversos podem ser feitos às especificações da forma e tamanho da âncora desejada.
   1. Determine a altura desejada e o diâmetro da âncora final. Este protocolo usa um molde feito sob medida formado a partir de silicone artesanal em um prato de cultura de tecidos de 35 mm em que foram colocados cilindros plásticos de aproximadamente 3,25 mm de diâmetro, permitindo uma altura final do molde de cerca de 6,5 mm. As dimensões da âncora final são de aproximadamente 3-3,5 mm de altura e cerca de 3,4 mm de diâmetro, com pino de 1,5 mm saindo do fundo da âncora.
   2. Adicione o silicone sem curar a um prato de 35 mm no qual o molde será fabricado. Coloque cilindros de plástico em conformidade.
      NOTA: O tamanho dos cilindros de plástico determinará o diâmetro das âncoras finais. A colocação dos cilindros de plástico e a quantidade de silicone utilizada podem ser modificadas para produzir âncoras de diferentes alturas. A espessura entre o fundo dos poços no molde e o fundo do próprio molde d dEtermine quanto do pino pode salientar do fundo da âncora, permitindo que a âncora mais tarde seja fixada com segurança no prato revestido de silicone.
   3. Depois de permitir que o silicone cure, remova os cilindros de plástico e remova o molde do prato de 35 mm.
2. Prepare uma solução de ácido cítrico ortofosfórico 3,5 M / 100 mM. Dissolver 0,961 g de ácido cítrico em 11,5 ml de ácido ortofosfórico. Traga o volume da solução até 50 mL com água MilliQ. Armazene a solução à temperatura ambiente e proteja da luz.
3. Prepare moldes: Coloque um pino minutien no centro de cada poço cilíndrico nos moldes.
4. Combine a solução de fosfato de β-tricálcico e ácido ortofosfórico / cítrico em uma concentração de 1 g / mL em um barco de pesagem de plástico no gelo.
5. Misture o cimento vigorosamente usando um raspador de células de plástico.
6. Triturar o cimento para continuar a mistura e juntar a mistura no molde
7. Centrifugar o molde preenchido por 1 min a 2.250 x g.
8. Permitir que as âncoras de cimento de escovão se estabeleçam à temperatura ambiente durante a noite.
9. Remova as âncoras do molde e pino duas âncoras de 12 mm de distância em cada placa revestida de silicone.
10. Esterilize as placas fixadas por pulverização com etanol a 70%, preenchendo ambas as placas e tampas, e colocando em um BSC. Após pelo menos 30 min, aspirar as placas e substituir as tampas, armazenando no BSC até que seja necessário.

4. Obter o soro humano

1. Certifique-se de que a aprovação pelo conselho de avaliação ética apropriado foi obtida para este protocolo.
2. Certifique-se de que o consentimento informado por escrito tenha sido obtido de indivíduos humanos para participar de uma determinada intervenção ( por exemplo , exercício, alimentação ou intervenção na droga) que afetará as mudanças desejadas no soro. Aqui, descrevemos a coleção em repouso e 15 minutos após o exercício de resistência.
3. Usando um farmacêutico treinado, obtenha uma amostra de sangue em repouso de um participante por punção venosa em um recipiente evacuado apropriado.
4. Coletar uma amostra de sangue pós-exercício 15 minutos depois de ter participantes envolvidos no protocolo de exercício desejado. Conforme descrito anteriormente ¹ , use o protocolo de exercício de resistência nesta experiência para estimular uma resposta bioquímica endógena.
   1. Peça aos participantes que executem cinco conjuntos de pressão na perna com um minuto de descanso entre conjuntos. Em seguida, peça aos participantes que executem um conjunto de extensões de joelho e um conjunto de cachos de isquiotibiais consecutivamente sem descanso e, em seguida, repita os exercícios repetidos três vezes com 1 minuto de descanso entre conjuntos.
5. Deixe o sangue coagular antes de centrifugar a 1.500 xg durante 10 min. Em condições estéreis, transfira o soro para tubos estéreis para suplementação de mídia futura (soro armazenado a 4 ° C) e análise bioquímica (uma pequena alíquota de soro armazenada a -20 ° C).

5. Forma de Ligamentos de Engenharia

NOTA: antecipadamente, expandaBroblastes e prepare placas revestidas de silicone com âncoras de escovinha fixadas.

1. Preparar reagentes:
   1. Prepare a trombina. Dissolver a trombina bovina a 200 U / mL em meio de glicemia de DMEM. Filtrar a 0,22 μm, alíquota, e armazenar a -20 ° C.
   2. Prepare fibrinogênio. Dissolver fibrinogênio bovino a 20 mg / mL em meio de glicemia com DMEM. Incubar durante 3-4 h em um banho-maria a 37 ° C, rodando a cada 30 minutos para facilitar a dissolução. Filtro a 0,22 μm (vários filtros podem ser necessários), alíquotas e armazenar a -20 ° C.
   3. Prepare a aprotinina. Dissolver a aprotinina em 10 mg / mL em água. Filtrar a 0,22 μm, alíquota, e armazenar a -20 ° C.
   4. Prepare o ácido amino-hexanóico. Dissolver ácido amino-hexanóico a 0,1 g / mL em água. Filtrar a 0,22 μm, alíquota e armazenar a 4 ° C.
   5. Preparar ácido ascórbico. Dissolver ácido ascórbico em meio de alto teor de glicose DMEM a uma concentração de 50 mM. Filtrar a 0,22 μm e armazenar a 4 ° C.
   6. Prepare L-prolina. Dissolver L-prolina em PBS a uma concentração de 50 mM. Filtrar a 0,22 μm e armazenar a 4 ° C.
   7. Prepare o fator de crescimento da transformação - β1 (TGF-β1). Reconstitua TGF-β1 de acordo com as instruções do fabricante a uma concentração de 10 μg / mL. Alíquota e armazene a -20 ° C.
2. Determine o número de construções necessárias para a experiência e assegure-se de que sejam preparadas quantidades suficientes de placas fixadas. São recomendadas replicações biológicas e técnicas. No estudo ¹ destacado aqui, use repetições técnicas duplicadas e 12 repetições biológicas (soro de 12 indivíduos em repouso e após o exercício).
   NOTA: Execute as seguintes etapas em condições estéreis em um BSC.
3. Expandir células por cultura em placas de 15 cm a 70% de confluência. São necessárias 2,5 x 10 ⁵ células por construção.
4. Tripsilize células e ressuspenda em GM a uma concentração de 3,67 x 10⁵ células / mL.
5. Gerar uma mistura principal para o número de construções necessárias: Para 1 construção, a mistura principal contém suspensão celular de 681 μL (contendo 2,5 x 10 ⁵ células), 29 μL de trombina, 2 μL de aprotinina e 2 μL de ácido aminohexanoico.
6. Depois de misturar bem a mistura principal, adicione 714 μL a cada placa fixada em um padrão de "figura 8" em torno das âncoras de cimento de escoveteria. Certifique-se de que a mistura principal entre diretamente nos lados das âncoras.
7. Tire suavemente cada placa para distribuir a mistura principal uniformemente através da placa.
8. Para um prato de cada vez, adicione rapidamente 286 μL de fibrinogênio de uma forma gota a gota uniformemente sobre uma placa e deslize de imediato a placa para frente e para trás e de lado a lado sobre a superfície do BSC para distribuir o fibrinogênio para formar os géis de fibrina incorporados em células . Prossiga para a próxima placa.
9. Coloque as construções em uma incubadora estéril mantida a 37 ° C e 5% de CO ₂ e incubaDurante pelo menos 15 min para permitir a polimerização do fibrinogênio.
10. Prepare meios de alimentação suficientes (FM) para 2 mL por construção. Suplementar GM com ácido ascórbico 200 uM, prolina 50 μM e TGF-β1 5 ng / mL.
11. Adicione 2 mL de FM para cobrir cada construção. Cultive as construções em uma incubadora estéril mantida a 37 ° C e 5% de CO ₂ por um total de 14 dias ou no ponto final desejado, atualizando a mídia a cada 2 dias com 2 mL de FM

6. Tensile Testing Engineered Ligaments

NOTA: O teste de tração foi realizado usando um testador de tração personalizado em um banho PBS; Apertos de moldagem reversa que são acoplados ao transdutor de força, mantêm as âncoras de cimento em escova no lugar durante o teste.

1. Determine o comprimento e a largura das construções do ligamento usando compassos de calibre digitais; Calcule a área da seção transversal do tecido.
2. Descolhe a construção do ligamento da placa e coloque as âncoras noApertos moldados reversamente, garantindo que a construção seja submersa em PBS.
3. Ajuste a distância entre os punhos, ajustando o comprimento da construção ao seu comprimento inicial.
4. Comece o teste: coloque a construção na falha a uma taxa de deformação de 0,4 mm / s (ou ~ 3% / s).
5. Após a conclusão do teste, processar os remanescentes de tecido para o teor de colágeno (ver seção 7).
6. A partir dos dados de deformação de carga resultantes, calcular dados de tensão-deformação e quantificar propriedades mecânicas de interesse; Por exemplo, carga de tração máxima, força de tração máxima e módulo ( isto é , propriedade elástica em uma região linear da curva tensão-deformação).

7. Quantificação do conteúdo de colágeno de ligamentos de engenharia

1. Remova os ligamentos manipulados das âncoras de cimento com escovas e seque a 120 ° C durante 25 min.
2. Determine a massa seca de construções e coloque em tubos individuais de 1,5 mL. As construções secas podem ser armazenadas à temperatura ambienteAté processamento posterior.
3. Para cada construção, adicione 200 μL de HC1 6 M. Ferva a 120 ° C num bloco de aquecimento durante 2 h numa exaustão.
   CUIDADO: O HCl é altamente corrosivo e ácido, é recomendável o uso de tubos à prova de ferver ou de segurança ou outro método de fixação de tubos.
4. Centrifugue os tubos brevemente para coletar o líquido e deixe-os desligados para evaporar a 120 ° C em um bloco de aquecimento durante 1,5 h em uma exaustão.
5. Ressuspender o sedimento resultante em 200 μL de tampão de hidroxiprolina. Armazenar a -20 ° C até ser necessário.
   1. Prepare o tampão de hidroxiprolina. Em 300 mL de água, adicione 16,6 g de ácido cítrico, 4 mL de ácido acético, 11,4 g de NaOH e agite até dissolver. PH para 6-6,5 e traga volume até 500 mL. Adicionar 250 μL de tolueno como conservante e armazenar a 4 ° C protegido da luz.
6. Prepare reagentes.
   1. Prepare a trans-4-hidroxi-L-prolina. Dissolver em água para fazer uma solução de 4 mg / ml.
   2. Preparar cloramina-T. Dissolver em água para fazer uma solução de 14,1 mg / mL.
   3. Preparar aldeído-perclorato. Dissolver 1,5 g de 4-dimetilaminobenzaldeído em 6 mL de 1-propanol, 2,6 mL de ácido perclórico (CUIDADO: corrosivo, oxidante forte, usar as precauções apropriadas) e 0,5 mL de água.
7. Em um conjunto de novos tubos de 1,5 mL, diluir uma amostra de cada pastilha ressuspensa em tampão de hidroxiprolina até um volume de 200 μL.
   NOTA: As diluições podem variar entre 1: 4 e 1:50 da amostra: tampão dependendo do teor esperado de colágeno da amostra; Portanto, alguns testes de teste e erro podem ser necessários para determinar um fator de diluição apropriado para o determinado conjunto de amostras (ou seja, coloque as amostras em direção ao meio da curva padrão).
8. Prepare os padrões de hidroxiprolina. Diluir hidroxiprolina em tampão de hidroxiprolina (ver secção 7.5.1) até 80 μg / mL. Execute diluições em série para produzir padrões de 6-8 200 μL entre 0-20 μg / mL.
9. Adicionar 150 μL 14,1 mg /ML de solução de cloramina T em cada amostra padrão e diluída. Vortex e incubar à temperatura ambiente durante 20 min.
10. Adicione 150 μL de solução de aldeído-perclorato a cada amostra e amostra diluída. Vortex e incubar em um bloco de aquecimento a 60 ° C durante 15 min. Descarte o excesso de solução de aldeído-perclorato como resíduo perigoso de acordo com as normas locais (contém ácido perclórico).
11. Permitir que os padrões e as amostras esfriem, antes de aliquotar 200 μL de cada, em duplicado, em placas de 96 poços.
12. Leia a placa a 550 nm em um espectrofotômetro. Descarte a placa e o volume restante em tubos de 1,5 mL como resíduos perigosos de acordo com as normas locais (contém ácido perclórico).
13. Cálculo da fração total de colágeno e colágeno.
    1. Converta o valor de absorvância para cada amostra em microgramas de hidroxiprolina usando a curva padrão de hidroxiprolina.
    2. Multiplique cada poço em 2,5 para calcular a quantidade de hidroxiprolina emA amostra diluída. Lembre-se de que apenas 200 da mistura total de 500 μL (200 μL de amostra diluída + 150 μL de solução de cloramina T +150 μL AP) são adicionados a cada amostra.
    3. Multiplique pelo fator de diluição (Seção 7.7) para calcular a quantidade de hidroxiprolina na amostra original.
    4. Divida por 0.137 para calcular a quantidade de colágeno (assume que o colágeno contém 13,7% de hidroxiprolina ²⁰ ).
       NOTA: A abundância de hidroxiprolina de mamífero no colágeno varia ligeiramente entre os tecidos e as espécies de mamíferos; Por exemplo, o tendão de Aquiles e ovelhas de Aquiles contém 13,5 e 13,7% (massa de hidroxiprolina / massa seca do tecido), respectivamente ²¹ . Aqui, use 13,7% para estimar o percentual de hidroxiprolina no colágeno, que é usado para calcular o teor de colágeno de uma amostra de tecido usando a seguinte equação:
       
    5. Divida pela massa seca para calcular o colágeno fraCuste e converta para uma porcentagem.
       

8. Quantificação dos pontos finais moleculares

NOTA: Além dos resultados primários do teste de tração e do conteúdo de colágeno, os pontos finais moleculares podem ser medidos em tecido 2D ou 3D para adicionar informações mecânicas. Os bioensaios podem ser usados ​​para determinar os pontos finais moleculares (veja a seguinte seção abaixo para o contexto O impacto do meio sérico pós-exercício na função do ligamento in vitro ).

1. Para tecidos 3D:
   1. Prepare as construções de acordo com a Etapa 5 acima.
   2. Após a construção de tratamento / intervenção, construções de congelamento instantâneo em nitrogênio líquido.
   3. Usando uma argamassa e pilão arrefecidos em gelo seco, triturar construções em pó. Continue no passo 8.4 / 5).
2. Para tecido 2D:
   1. Cultura de fibroblastos ACL humanos para confluir em um mêsOlher em placas de seis poços contendo DMEM.
   2. Aspirar DMEM e aplicar meios de tratamento de acordo com a sua estratégia de experimentação ( por exemplo , experiências de tempo ou resposta a dose).
   3. Aspirar meios de tratamento e lavar células com PBS.
   4. Raspe células para coletar usando um buffer / reagente de extração apropriado (veja a seguir).
3. Análise de expressão de proteínas: Utilize um tampão de extração citossólica ( por exemplo , sacarose 250 mM, Tris 50 mM pH 7,4, MgCl2 5 mM e coquetel inibidor de protease / fosfatase) para obter lisados ​​proteicos. Execute o teste de concentração de proteína e continue a análise de acordo com os procedimentos padrão de Western Blot.
4. Análise de expressão de genes: isolar ARN total utilizando 500 μL de reagente de isolamento de ARN de acordo com as instruções do fabricante para obter ARN de alta qualidade. Execute transcrição reversa e análise quantitativa de PCR em tempo real de acordo com procedimentos padrão.
5. Isolamento de DNA: isola e quantifica gDNA enológico usando reagente de isolamento de DNA de acordo com as instruções do fabricante. Quantificar a concentração de DNA usando um espectrofotômetro para medir a absorvância da amostra a 260 nm.

Resultados

Visão geral da formação de ligamentos manipulados e intervenção experimental

A Figura 1 mostra uma visão geral da formação de ligamentos manipulados. Cimento de brushite, um material substituto ósseo ²² é preparado combinando uma solução de ácido ortofosfórico / ácido cítrico com fosfato de β-tricálcio em poços cilíndricos. Alternativamente, se não estiverem medindo diretamente a função mecânica dos tecidos, as suturas de seda 3-0 podem ser usadas como âncoras na formação de um tecido. Estes são fixados a 12 mm de distância em placas de 35 mm revestidos de silicone e esterilizados por imersão em etanol a 70%. Os fibroblastos são isolados dos remanescentes do ligamento cruzado anterior obtidos durante a cirurgia de reconstrução do LCA. Após a expansão, 2,5 x 10 ⁵ células são encapsuladas em um gel de fibrina formado no prato fixado por âncora de cimento de brushite. Após a formação, a construção do ligamentoPodem ser examinadas alterações de propriedades mecânicas, conteúdo de colágeno, proliferação celular, expressão gênica, níveis de proteína e morfologia tecidual.

Ao longo da cultura, as células contraem o gel de fibrina e formam um tecido linear entre as duas âncoras ( Figura 2A ). Após 1-2 dias de cultura, as células aderiram ao gel de fibrina, processos de células estendidas e começaram a exercer forças de tração ( Figura 2B ). À medida que o gel de fibrina é contraído por forças de tração e discriminado por enzimas celulares, a tensão é gerada entre os dois pontos de ancoragem e nossas células se alinham paralelamente a este eixo ( Figura 2B ) e começam a depositar colágeno. Após 4-5 dias, as construções se contraíram em torno das âncoras formando um tecido cilíndrico linear ( Figura 2A , neste momento estímulos externos podem ser aplicados ao sistema (intervNeste momento, evita interromper o processo de formação de tecido linear). As intervenções podem consistir em suplementar o meio de cultura com soro humano ou animal após uma dada intervenção, citocinas exógenas e fatores de crescimento, empregando estimulação mecânica ou alterando outros fatores ambientais, como a tensão do oxigênio. Utilizando meio de crescimento (DMEM com 10% de FBS e 100 U / mL de penicilina) suplementado com ácido ascórbico 200 μM, L-prolina 50 μM e TGF-β1 5 ng / mL, determinamos que a proliferação celular continua ao longo de uma cultura de 2 semanas Período ( Figura 2C ) e, de fato, o microscópio de luz revela um tecido denso contendo células altamente alinhadas aos 14 dias de cultura ( Figura 2B ).

Avaliação de ligamentos artificiais

No final do período de cultura, os ligamentos manipulados podem ser avaliados em uma variedadeDe maneiras. Uma grande vantagem deste sistema é a capacidade de determinar mudanças funcionais no tecido através de testes mecânicos, uma avaliação vital dada a função mecânica do ligamento nativo. O teste de tração uniaxial pode ser utilizado para medir as propriedades mecânicas, incluindo carga a falha, resistência à tração final e módulo de Young. As propriedades viscoelásticas também podem ser medidas com relaxamento do estresse e testes de fluência. A Figura 3A descreve um ligamento manipulado mantido em alças moldadas reversas em um testador de tração uniaxial custom-built. A aderência direita é anexada a um transdutor de força para medir a carga através do ligamento, pois o tecido é forçado a falhar. A Figura 3B mostra um gráfico representativo de tensão-deformação para uma prova de falha. Após serem submetidos a testes mecânicos, as mesmas construções podem ser secas e processadas para um ensaio de hidroxiprolina ²³ para avaliar o teor total de colágeno, bem como outros biocheEnsaios mecânicos. Com um número suficiente de amostras adicionais por condição, pode-se realizar um exame completo de uma intervenção experimental, incluindo seus efeitos sobre a proliferação celular, a expressão de genes e proteínas e a morfologia histológica. Enquanto 14 dias é um ponto final típico para nossos estudos, os ligamentos manipulados continuam a melhorar suas propriedades mecânicas e conteúdo de colágeno através de 28 dias de cultura como mostrado na Figura 3C e podem sobreviver por pelo menos 3 meses em cultura ²⁴ .

A variabilidade dos dadores é uma consideração importante para a repetibilidade experimental. A Figura 4 mostra um experimento representativo relatado por Lee et al. ²⁵ comparando 7 dadores de ACL diferentes (n = 3 machos e n = 4 fêmeas) demonstrando propriedades típicas de tração e conteúdo de colágeno após uma cultura de 2 semanas descrita anteriormente Meios de crescimento suplementados. Usando células de coleções similares de ACL, idade do doador, tempo após lesão, gênero, etc., os ligamentos manipulados demonstram baixa variabilidade entre dadores e características semelhantes entre doadores do sexo masculino e feminino, com exceção da diferença na fração de colágeno. No estudo acima mencionado, os ligamentos manipulados foram utilizados como um modelo in vitro para investigar por que as mulheres têm um risco significativamente maior de lesão do ACL do que os homens e demonstraram que os fibroblastos de ACL isolados de dadores do sexo feminino não possuem, inerentemente, ligamentos mais fracos e menos colaginosos ²⁵ .

O impacto do meio sérico pós-exercício na função do ligamento in vitro

Nós já demonstraram a capacidade dos ligamentos manipulados para serem utilizados na sonda de processos fisiológicos ^{1 ,}Ss = "xref"> 25. Na experiência representativa a seguir, conforme relatado por West et al. ¹ , determinamos os efeitos bioquímicos do exercício sobre a função do ligamento e destacamos a metodologia e os achados aqui. Nós formamos ligamentos manipulados usando células ACL humanas e aplicamos uma intervenção, no dia 7 da cultura, consistindo em meio de cultura condicionado com soro humano coletado pré ou pós-exercício. Resumidamente, recrutamos jovens jovens saudáveis ​​e colecionamos amostras de sangue antes e depois de um ataque agudo de exercícios de resistência que aumenta hormônios circulantes e citocinas, incluindo hormônio de crescimento humano (GH). O soro humano foi isolado de amostras de sangue pré e pós-exercício e utilizado no lugar do soro bovino fetal nos meios de cultura para a segunda semana de cultura de ligamentos manipulados ( Figura 5A ). As amostras de soro pré e pós-exercício foram analisadas utilizando ELISA para alterações na GH e no fator de crescimento semelhante a insulina (IGF-1), aCuja concentração pode ser alterada pelo exercício ( Figura 5B ). Esta informação foi utilizada para correlacionar os efeitos séricos nos ligamentos manipulados com alterações no soro em resposta ao exercício. Após um período de cultura de 14 dias, as construções do ligamento foram avaliadas usando testes mecânicos e determinação de hidroxiprolina do teor de colágeno e demonstraram um aumento significativo na carga máxima de tração e no conteúdo de colágeno em resposta ao soro pós-exercício. Com o objetivo de avaliar se esse efeito estava relacionado a libertações induzidas pelo exercício de GH ou IGF-1, os ligamentos manipulados foram formados em um experimento separado e tratados com uma resposta à dose de GH recombinante humano ou IGF-1. Curiosamente, enquanto a GH sérica aumentou no sangue ( Figura 5B- i), o aumento progressivo da concentração de GH recombinante nos meios de cultura não aumentou o teor de colágeno ( Figura 5D -i) ou mecânicoPropriedades (dados não mostrados) em ligamentos manipulados. Em contraste, os níveis séricos de IGF-1 não aumentaram após o exercício, mas um experimento dose-resposta revelou que os níveis crescentes nos meios de cultura melhoraram o conteúdo de colágeno das construções do ligamento ( Figura 4D -ii). Assim, enquanto o exercício resultou em aumentos robustos no GH pós-exercício, o experimento dose-resposta usando rhGH aumenta a dúvida quanto ao fato de GH ser diretamente responsável pelo aprimoramento fenotípico dos ligamentos manipulados (pelo menos, a isoforma de 22 kDa por si só não Parece ser responsável). Por outro lado, enquanto que o IGF-1 no soro não foi alterado aos 15 minutos após o exercício, o teste de rhIGF-1 em uma ampla gama de concentrações revelou que o IGF-1 é capaz de melhorar o conteúdo de colágeno; No entanto, deve-se notar que o aumento das concentrações de rhIGF-1 através de uma faixa que estimou níveis fisiológicos não aumentou significativamente o teor de colágeno. Assim, o ambiente soro pós-exercício únicoFoi importante para melhorar a mecânica e o colágeno dos ligamentos manipulados.

No estudo destacado aqui ¹ , o volume de soro experimental foi limitado devido a considerações éticas; Então, os bioensaios 2D de curto prazo, que apresentaram menor demanda de soro, foram utilizados para estimular ainda mais os mecanismos moleculares responsáveis ​​pelo aumento do colágeno que foi observado. Os fibroblastos de ACL foram cultivados em confluência em placas de 6 poços e tratados durante 1 hora com soro de repouso ou pós-exercício e comparados com respostas de dose de GH recombinante, IGF-1, TGF-β1 e a ativação de alvos no PI3K / mTORC1 As vias de sinalização ERK1 / 2 e Smad foram determinadas. Na presença de soro pós-exercício, a via PI3K / mTORC1 e ERK1 / 2 mostrou maior ativação, avaliada por fosforilação de S6K ( Figura 5D -i) e ERK1 / 2 ( Figura 5D -ii), respectivamente.Em comparação com as respostas de dose de hormônio e citoquina, enquanto a GH teve um pequeno efeito positivo na sinalização do mTOR ( Figura 5D- i) e o IGF-1 mostrou um efeito positivo na menor dose, os três tratamentos de GH, IGF-1 e TGF -β1 não representou o aumento na sinalização PI3K / mTORC1 e ERK1 / 2. Em conjunto, nosso modelo de ligamento de engenharia 3D e dados de bioensaio 2D sugerem que o ambiente sérico pós-exercício é capaz de melhorar a função de ligamento e o conteúdo de colágeno manipulados através da ativação das vias PI3K / mTORC1 e ERK1 / 2.

Em resumo, usando um modelo de ligamento manipulado combinado com soro condicionado ao exercício físico, conseguimos: i) investigar o efeito do ambiente sérico pós-exercício na função do ligamento manipulado e colágeno, ii) correlacionar as alterações no fenótipo do ligamento com alterações na concentração de hormônio sérico, Com o objetivo de determinar quais mudanças no soro levaram a changEm ligamentos artificiais e iii) além do alcance do trabalho usando bioensaios 2D para sondar alvos moleculares do meio bioquímico sérico para determinar mecanismos moleculares que são ativados pelo soro pós-exercício que levam a melhorias na função do ligamento.

Figura 1: Visão geral da formação e uso de ligamentos manipulados. As âncoras de cimento Brushite são fabricadas e fixadas em placas revestidas de silicone. Os fibroblastos primários são isolados e expandidos a partir de restos ACL. Os ligamentos de engenharia são formados pela encapsulação de fibroblastos em um gel de fibrina em torno de duas âncoras de cimento de escovado. Os ligamentos de engenharia são cultivados e tratados com os estímulos químicos ou mecânicos específicos ( por exemplo , através de um biorreator) desejados. No ponto final desejado, os ligamentos manipulados podem ser coletados e avaliados para mecânicaL propriedades, expressão gênica, conteúdo de colágeno, expressão protéica e histologia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Os fibroblastos do ligamento primário formam um ligamento manipulado ósseo a osso baseado em fibrina que abrange duas âncoras de cimento de escoveteria. ( A ) Ao longo do tempo, os fibroblastos contraem o gel de fibrina em torno das âncoras de cimento de escoveteria formando um tecido linear. ( B ) Nos primeiros três dias, as células se ligam ao gel de fibrina e exercem forças de tração, alinhando as células com o eixo longo da construção. Durante 14 dias, as células formam um tecido altamente alinhado. Barra de escala = 160 μm. ( C ) O conteúdo de DNA dos ligamentos manipulados continua a aumentar oVer 14 dias em cultura à medida que as células proliferam. Os dados são apresentados como média ± DP com n = 3-4 construções por grupo. Grupos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: As propriedades mecânicas do ligamento manipulado e o conteúdo de colágeno melhoram ao longo do tempo. ( A ) As construções do ligamento são ensaiadas uniaxialmente para determinar o efeito de uma dada intervenção na função do ligamento. Conforme mostrado, dois apertos moldados reversos e 3D imprimem âncoras de forma recíproca que são encapsuladas pelo nervo de engenharia. As âncoras são acopladas a um motor de passo e a um transdutor de força para gerar curvas de tensão / deformação do tecido testado, permitindo que as propriedades mecânicas possam ser determinadas. ( B </ Strong>) Curva de tensão-deformação representativa de um ligamento de engenharia tenso a falha. Ao longo de 28 dias, ( C ) resistência à tração máxima (UTS), ( D ) carga de tração máxima (MTL), ( E ) Módulo de Young e ( F ) fração de colágeno continuam a melhorar. Os dados são apresentados como média ± DP com n = 5 construções por grupo. * Indica diferença significativa de todos os outros grupos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Os ligamentos manipulados podem ser avaliados quanto à funcionalidade e conteúdo bioquímico, apresentando baixa variabilidade do doador. Ligou-se ligamentos foram formados 7 dadores diferentes (n = 3 machos, n = 4 fêmeas). Após 2 semanas o(Cultura), foram avaliadas quanto às diferenças na ( A ) carga de tração máxima, ( B ) resistência à tração máxima (UTS), ( C ) Módulo de Young, ( D ) área de seção transversal (CSA), ( E ) conteúdo total de colágeno por Construir e ( F ) colágeno como uma fração de massa seca. Os dados são apresentados como média ± DP e significância estatística foi com o teste t de Student. * Indica diferença significativa de outros grupos (p <0,05). Figura adaptada de Lee et al. ²⁵ Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Os ligamentos manipulados demonstram mudanças mecânicas e bioquímicas em resposta ao bioloIntervenções gísticas. ( A ) O soro foi isolado de desenhos de sangue coletados de indivíduos pré (RestTx) e pós-exercício (ExTx) e utilizados para tratar ligamentos manipulados durante a segunda semana de cultura. ( B ) (i) hormônio de crescimento humano (GH) e (ii) níveis de fator de crescimento de insulina (IGF) -1 no restante e soro de exercício foram quantificados através de ELISA. ( C ) Os ligamentos de engenharia tratados com ExTx demonstraram (i) conteúdo de colágeno melhorado (i) e (ii) carga de tração máxima. O significado estatístico das comparações em pares (RestTx e ExTx) foi analisado por um teste t com nível de significância definido em p <0,05. ( D ) Uma dose-resposta de (i) GH e (ii) IGF-1 foi usado para determinar possíveis contribuições desses fatores para as mudanças no conteúdo de colágeno devido à ExTx. E) Os bioensaios 2D foram utilizados para comparar os efeitos do aumento das doses de GH, RestTx e ExTx em alvos de sinalização molecular, como a fosforilação de (i) ^{S6K Thr38}9 e (ii) ERK1 / 2 ^{Thr202 / Tyr204} . A comparação estatística de mais de dois grupos experimentais foi realizada com ANOVA e HSD de Tukey. Os dados são apresentados como apresentados como média ± DP. * Indica uma diferença significativa do controle (p <0,05) e § indica diferença significativa de 150 ng / mL e 300 ng / mL de IGF-1. Figura adaptada de West et al. ¹ Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O presente manuscrito descreve um modelo de tecido ligamento que é uma plataforma experimental útil para pesquisadores com um amplo espectro de tópicos de pesquisa, do desenvolvimento de tecidos a questões de tradução / clínica. O modelo de ligamento manipulado descrito aqui é baseado em um protocolo versátil que pode ser adaptado em vários pontos ao longo do fluxo de trabalho ( Figura 1 e Seção de Discussão ). Além disso, a natureza inerentemente reducionista do ambiente in vitro pode ser aproximada do domínio fisiológico, completando meios de alimentação com soro humano ou animal condicionado.

As construções podem ser formadas usando fibroblastos de várias fontes
Embora a metodologia e os resultados representativos aqui apresentados sejam baseados no uso de fibroblastos primários de ACL, o protocolo de isolamento celular pode ser ajustado para a coleta de outros tipos de fibroblastos primários. Como descritoNa Figura 4 , os ligamentos manipulados formados com células primárias isoladas de jovens doadores humanos mostram baixa variabilidade do doador. As células primárias são limitadas pelo isolamento inicial e restrição de passagem; O uso de linhas celulares pode melhorar a reprodutibilidade de experiências. O uso de outros tipos de células pode exigir modificações nos meios de cultura celular e na formulação de gel de fibrina. Por exemplo, observamos que as células estaminais mesenquimais humanas (MSCs) não conseguem formar tecidos lineares entre as âncoras de cimento de brushite ao longo de 2 semanas, enquanto os fibroblastos tendinosos flexores digitais superiores equinos, células eróticas da medula óssea eqüina, fibroblastos do tendão embrionário de pinto , E os MSC C3H10T1 / 2 murinos rapidamente se contraem e digerem o gel de fibrina para formar um tecido linear (observações não publicadas). Esse contraste pode ser uma conseqüência das diferenças na contratilidade celular, na proliferação e na produção de enzimas fibrinolíticas.

Aplicação de produtos químicosE estimulação mecânica
No método aqui descrito, o tecido à base de fibrina se forma em torno de âncoras de cimento de escoveteria, permitindo a aplicação de estimulação mecânica através de um biorreator de alongamento ¹¹ , bem como para testes de tração no ponto final. A presença de interface de cimento e tecido mole de brushite (entesis) também apresenta uma oportunidade para maior investigação e melhoria ^{22 , 26} (ver seção de aplicações clínicas abaixo). Neste ambiente in vitro , a contribuição de fatores químicos e mecânicos pode ser mais prontamente identificada; Um exemplo disso é mostrado na Figura 5 , pelo qual o efeito do ambiente sérico pós-exercício foi separado dos estímulos mecânicos do exercício. Estudos-piloto podem ser necessários para determinar o prazo das intervenções experimentais, a composição dos tratamentos e os pontos finais apropriados para esperar uma mudança observável. FoPor exemplo, no estudo soro pós-exercício ¹ , o comprimento do tratamento experimental foi restringido pelo suprimento de soro usado para suplementar a mídia, a partir da qual as construções foram alimentadas a cada dois dias. Além disso, durante a segunda semana de cultura, o meio de cultura foi suplementado com soro de repouso ou pós-exercício com ácido ascórbico e L-prolina mantida enquanto o TGF-β1 foi removido. TGF-β1 é um fator de crescimento pró-fibrótico conhecido que aumenta no soro após o exercício ²⁷ . Portanto, para evitar obscurecer os efeitos relacionados ao TGF-β1 do soro pós-exercício, essa citocina não foi mantida nos meios de cultura.

Este modelo de ligamento manipulado também pode ser usado para testar o efeito do estiramento mecânico. Ao englobar apertos modelados reversos para segurar as extremidades da âncora do cimento de brushite (semelhante ao testador de tração uniaxial representado na Figura 1 ), os biorreatores de estiramento podem ser projetados para acomodar eng Ligamentos ineficazes. Nosso laboratório já usou este modelo para investigar a resposta de sinalização molecular de ligamentos manipulados ao estiramento de tensão uniaxial em um biorreator customizado ¹¹ que proporcionará uma melhor compreensão para o projeto racional de um paradigma de alongamento in vitro ou mesmo, potencialmente, in vivo Estiramento / atividade / aplicações terapêuticas.

Avaliação de ligamentos artificiais
Tal como acontece com a cultura monocamada tradicional, as construções 3D podem ser testadas quanto à expressão de genes / proteínas; Além disso, sua morfologia 3D também oferece a oportunidade de avaliar mudanças funcionais e morfológicas e as construções podem ser mantidas em cultura para estudos de longo prazo ( Figura 3 ). Enquanto os ligamentos manipulados não são equivalentes aos ligamentos nativos e maduros, eles têm semelhança com o desenvolvimento de tendões / ligamentos e se comportam de forma semelhante ao tecido nativo em resposta a nutrientes"26, fatores de crescimento ¹⁰ , hormônios ²⁵ e exercício ^{11 , 28.} Assim, enquanto o cuidado é garantido antes de fazer amplas generalizações de qualquer modelo in vitro , os resultados do teste de construção do ligamento podem revelar ou informar um mecanismo fisiológico particular que de outra forma poderia ser Impossível investigar in vivo.

Suplemento de mídia de alimentação com soro condicionado para um modelo flexível e dinâmico com aplicações amplas
O metaboloma do soro humano é um meio de cerca de 4.500 compostos, incluindo, entre outros, glicoproteínas, lipoproteínas, derivados lipídicos, substratos energéticos, metabolitos, vitaminas, enzimas, hormônios, neurotransmissores e uma infinidade de blocos de construção / intermediários. ^{29 A} inspeção adicional do metabolome do soro humano de acordo com as classes compostos ²⁹ revela additiBenefícios da integração de soro experimental em experiências in vitro. Ou seja, a maioria dos ~ 4500 compostos no soro são hidrofóbicos ou derivados de lípidos, sublinhando a importância das proteínas de ligação para transporte / solubilização. Segue-se que a recapitulação experimental da dinâmica do transporte composto endógeno e, portanto, a biodisponibilidade e as interações composto-alvo, seria quase impossível. Assim, o soro experimental é particularmente eficaz para o estudo de compostos que são conhecidos por depender de moléculas acessórias para solubilização, transporte, ligação alvo e mecanismo de ação.

Nosso laboratório tem um interesse de longa data nos benefícios para a saúde do exercício. O exercício melhora a função celular e orgânica em uma variedade de tecidos em todo o corpo ¹² , um efeito que pode ser atribuído a uma variedade de fatores (por exemplo, IL-6 ¹³ , IL-15 ¹⁴ , Meteorin-like ¹⁵ ,Exossos ^{16 , 17} ) que são liberados para a circulação sistêmica. O meio bioquímico pós-exercício reflete os fatores liberados tanto da contração de hormônios sensíveis ao exercício do músculo esquelético quanto de fatores que são liberados como resultado da estimulação do sistema nervoso simpático das glândulas secretoras ( por exemplo , cortisol e catecolaminas da glândula supra-renal ¹⁸ e crescimento Hormônio da hipófise anterior ¹⁹ ). Recentemente usamos um modelo de soro pré e pós-exercício para investigar os efeitos do meio bioquímico induzido pelo exercício no tecido de engenharia. ¹ Embora permaneçam inúmeras questões de pesquisa importantes relacionadas ao exercício, o modelo não é, de forma alguma, limitado dessa maneira. Por exemplo, o soro pode ser obtido, seja de fontes animais ou humanas, após intervenções dietéticas ou farmacológicas, ou de diferentes faixas etárias ou população clínicaS ³⁰ . Desta forma, os compostos de interesse exógenos ou endógenos estarão presentes no soro e nos meios de tratamento, em quantidades biodisponíveis e interagirão com o tecido alvo em conjunto com o meio endógeno ( ou seja , em um contexto mais fisiológico). Esta abordagem é dinâmica, uma vez que é altamente provável que uma determinada intervenção exerça um efeito multi-órgão (e multi-composto) e, assim, o meio fisiológico será co-modificado. Embora esta abordagem ofereça certos desafios, uma vez que múltiplas variáveis ​​bioquímicas sistêmicas são alteradas simultaneamente, é uma abordagem que pode ajudar a superar as desvantagens da metodologia experimental puramente reducionista ^{31 , 32} . Em conjunto, a implementação de soro condicionado junto com tecido tecido biomimético in vitro pode ser usado como ferramenta para questões de fisiologia, nutrição e pesquisa clínica.

Aplicações clínicas são numerosas
O modelo de engenharia de tecidos apresentado aqui pode ser usado para investigar questões de pesquisa anatômica e clínica que os modelos in vitro tradicionais não podem. Um ligamento ou tendão in vivo contém uma região de transição de tecido macio para difícil chamada entesis. A entesis, que é vulnerável à lesão mecânica relacionada ao estresse ³³ , pode ser estudada em seção transversal através de técnicas histoquímicas e de microscopia eletrônica ^{22 , 26} . Esta interface única é duplamente importante para aqueles com mobilidade baixa ou restrita, uma vez que a inatividade física prejudica a capacidade do tecido conjuntivo de transferir carga para regiões de baixa a alta conformidade ³⁴ , resultando em uma diminuição geral da conformidade tecidual e aumento do risco de lesões.

Nosso laboratório usou recentemente esse modelo de engenharia de tecidos ^{25 <}/ Sup> para modelar outra população, atletas do sexo feminino, que estão em risco de lesões do tecido conjuntivo: a incidência de lesão do LCA é aproximadamente cinco vezes maior do que as suas homólogas masculinas ³⁵ . Os mecanismos potenciais subjacentes a essa disparidade baseada no sexo em lesões foram investigados pelo tratamento de construções de ligamentos com concentrações fisiológicas do hormônio sexual feminino, estrogênio, em concentrações que imitavam estágios do ciclo menstrual. Curiosamente, altas concentrações de estrogênio inibiram a expressão gênica e a atividade da lysl oxidase, a enzima primária responsável pela criação de reticências lisina-lisina na matriz colágena de ligamentos e tendões. Importante, 48 h de alto teor de estrogênio (para simular a fase folicular) diminuíram a rigidez da construção do ligamento sem alterar a densidade de colágeno das construções. Do ponto de vista fisiológico, isso sugere que o aumento do laxismo do ligamento nas fêmeas pode ser devido, pelo menos em parte, a diminuiçãoFormação de cross-link. De uma perspectiva experimental, esses achados ²⁵ destacam a utilidade do modelo de construção 3D, que permitiu a análise da atividade de reticulação funcional. Do ponto de vista clínico, este modelo agora pode ser usado para detectar rapidamente intervenções que podem prevenir os efeitos negativos do estrogênio da função do ligamento.

Observações de encerramento
Aqui apresentamos uma metodologia detalhada para a formação de ligamentos manipulados e sua utilidade como modelo de tecido 3D in vitro . O modelo é altamente adaptável a uma ampla gama de objetivos, proporcionando flexibilidade no tipo de células, intervenções e medidas de resultado de interesse. A suplementação de meios de alimentação com soro condicionado adiciona um contexto fisiológico que não pode ser alcançado em um ambiente tradicional in vitro , melhorando a modelagem da fisiologia in vivo . Em resumo, acreditamos que este seja um modo amplamente aplicávelCom implicações emocionantes para promover os campos da fisiologia e engenharia de tecidos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20	Entomoravia	N/A	For brushite cement anchors
β-tricalcium phosphate	Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK)	N/A	For brushite cement anchors
o-phosphoric acid, 85% (w/w)	EMD Millipore	PX0995	For brushite cement anchors
Citric acid	Sigma-Aldrich	251275-500g	For brushite cement anchors
Falcon 35 mm tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772A	For silicone-coated plates
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Ellsworth Adhesives	4019862	For silicone-coated plates
1x Phosphate-buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	SH3002802	For cell isolation and expansion
100x antibiotic/antimycotic solution	VWR	45000-616	For cell isolation
Type II collagenase	Thermo Fisher Scientific	17101015	For cell isolation
100x penicillin/streptomycin solution	Thermo Fisher Scientific	15140122	For cell isolation
Steriflip-GP, 0.22 µm pore, polyethersulfone, gamma irradiated	EMD Millipore	SCGP00525	For reagent sterilization
DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine	VWR	10-013-CV	For cell and tissue culture
Fetal bovine serum	BioSera	FBS2000	Component of tissue digestion media and growth media
Penicillin G Potassium Salt	MP Biomedicals	0219453680 - 100 MU	Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20°C.
CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 mm x 20 mm)	VWR	82050-598	For cell culture
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	T10282	For cell isolation
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	25200056	For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301	For cell freezing media
Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	For cell freezing
BD Vacutainer Red Plastic 10 mL	Fisher Scientific	367820	For human serum collection
Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22 G x 1 inch Needle	Fisher Scientific	354221	For human serum collection
Thrombin, bovine origin	Sigma-Aldrich	T4648-1KU	For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
Fibrinogen, bovine origin	Sigma-Aldrich	F8630-5G	For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
Aprotinin from bovine lung	Sigma-Aldrich	A3428	For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C.
6-Aminohexanoic acid	Sigma-Aldrich	07260-100g	For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at 4 °C.
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960-5G	Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C.
L-proline	Sigma-Aldrich	P5607-25G	Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C.
Transforming growth factor-β1	Peprotech	100-21	Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer's instructions at a concentration of 10 μg/mL. Aliquot and store at -20 °C.
Stericup-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, 250 mL, radio-sterilized	EMD Millipore	SCGPU02RE	For reagent sterilization
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144-212	Dilute in water to 6 M
4-Dimethylaminobenzaldehyde	Sigma-Aldrich	39070-50g	For hydroxyproline assay
Chloramine-T trihydrate	Sigma-Aldrich	402869-100g	For hydroxyproline assay
trans-4-Hydroxy-L-proline	Sigma-Aldrich	H54409-100g	For hydroxyproline assay
1-propanol	Sigma-Aldrich	279544-1L	For hydroxyproline assay
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	311421-250ml	For hydroxyproline assay
Acetic acid, glacial	EMD Millipore	AX0073-9	For hydroxyproline assay
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S318-500	For hydroxyproline assay
Toluene, anhydrous	Sigma-Aldrich	244511-1L	For hydroxyproline assay
Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates	Fisher Scientific	07-200-656	For hydroxyproline assay