VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Özet

Bu yazının nano ölçekli yapının kesin modellerini üretmek için süper çözünürlüklü mikroskopi görüntülere tek parçacık analizi uygulamak için Fiji tabanlı açık kaynak yazılım paketi VirusMapper kullanır.

Özet

Süper çözünürlüklü floresan mikroskopi şu anda hücre biyolojisi araştırma devrim yaratıyor. Onun kapasitesi nano ölçekli biyolojik kompleksleri ve süreçlerin rutin görüntüleme için izin verir nm yaklaşık 300 çözünürlüğü sınırı kırmak için. Çözünürlükteki bu artış, aynı zamanda, tek parçacık analizi gibi elektron mikroskopisinde popüler yöntem, hali hazırda süper çözünürlüklü floresan mikroskobu uygulanabilir olduğu anlamına gelir. süper çözünürlük optik görüntüleme ile analitik bir yaklaşım birleştirerek, yarı kararlı bir yapı içinde moleküler elemanlar yapısal haritaları oluşturmak için floresan mikroskopi molekülü özel etiketleme kapasitesi yararlanmak mümkün olur. VirusMapper - - bir, yüksek performanslı kullanımı kolay ve yüksek verimli ImageJ eklentisi olarak paketlenmiş Bu amaçla, yeni bir algoritma geliştirdik. Bu makale, biyolojik m yeni yapısal özelliklere ortaya çıkarmak için yeteneğini vitrine, bu yazılım için derinlemesine bir kılavuz sunuyorolecular kompleksleri. Burada, uyumlu veri araya ve süper çözünürlüklü görüntülere tek parçacık analizi uygulamak için bu algoritmayı nasıl kullanılacağına ilişkin bir adım-adım protokolünü nasıl sağlanacağı sunuyoruz.

Giriş

Süper çözünürlüklü (SR) mikroskopi onları anlama açısından son derece önemli moleküler özgü etiketleme ile birlikte görüntü anahtar moleküler süreçler yeteneği sağlayarak hücre biyolojisi üzerinde büyük bir etkisi oldu. SR şu anda bu tür görüntü canlı hücreleri ^{1, 2} potansiyeli gibi ışık mikroskobu önemli faydalar elde edilmesi esnasında, elektron mikroskopisi (EM) ile, daha önce sadece elde çözünürlükleri (20-150 nm) yaklaşmak için ışık mikroskobu sağlar. Bundan başka, nano ölçekli düzeyinde bulunan yapısal koruma SR verilere tek parçacık analizi (SPA), elektron mikroskobu ³ yaygın olarak kullanılan bir kavramın uygulamaya izin verir. SPA kullanarak, bir yapının çok yüksek ölçüde korunmuş kopya görüntülenmiş ve çözünürlük, hassas ya da sinyal-gürültü görüntülenmiştir nesnenin artırmak için birlikte ortalaması alınabilir. SR ile kombinasyon halinde kullanıldığında, SPA yüksek p için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştirHIV ⁷ ve HSV-1 ile ⁸ olarak çekirdek gözenek kompleks ^{4, 5} bileşenleri, sentrozom ⁶ ve virüslerin recision eşleme.

Bununla birlikte, SR, SPA rutin birlikte uygulama yazılım mevcut eksikliğinden öne sürülmüştür. Bu nedenle, biz VirusMapper, popüler görüntü işleme yazılımı ImageJ / Fiji ^9'a bir eklenti geliştirdi. Bu SR mikroskobu ile görüntülenmiş yapıların hızlı, kullanıcı dostu, çok kanallı naif ortalamayı sağlamak üzere tasarlanmış floresan görüntüleri ¹⁰ ile genelleştirilmiş SPA için ilk serbestçe kullanılabilir yazılım paketidir. virüsler için tasarlanmış olsa da, farklı moleküler türler, görüntülenen tanımlanmıştır ve lokalize edilebilir her hangi bir makromoleküler kompleks uygulanabilir.

VirusMapper yüksek hassasiyetli molekül üretmek için kullanılabilmektedirortalama boyutları ve diğer parametrelerin hesaplanması için izin veren herhangi bir bilinen yapı model bulunur. algoritma tasarımı farklı yönlerde veya farklı morfolojik durumlarının saptanması için temin yapıların popülasyonları ayrılması için elverişli hale getirmektedir. Buna ek olarak, çok kanallı görüntüleme temel yapısı iyi bilinmektedir burada bu şekilde referans tabanlı yapı bulma için izin durumlarda bir referans kanalı kullanmak için kullanılabilir. Yazılım indirme ve yükleme talimatları üzerine sağlanmaktadır https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper . Örnek verileri de orada bulunabilir ve kullanıcıların kendi uygulamak denemeden önce örnek veriler üzerinde yazılım kullanarak uygulama tavsiye edilir.

Burada, ham verilerden SPA modeller üretmek için bu eklentisi kullanarak adımları tarif edilmiştir. Yazılım tek o içeren ham görüntüleri alırgiriş olarak çok etiketli yapılar r. Bu yazılım çalıştırıldığında olarak ayarlanır parametrelerin bir dizi konu, döner, görüntülü yapıları içinde etiketlenmiş bileşenlerin ortalama dağılımlarını gösteren SPA modelleri.

Bu protokolün amacı, Şekil 1 'de ana hatlarıyla boru hattına göre görüntülenen yapıları içinde bileşenlerinin ortalama lokalizasyonu veren hassas SPA modelleri üretmektir. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, program akışı yararlı üç aşamaya ayrılır. İlk aşamada, her bir kanal için parçacık yığınları ile sonuçlanan, kademeli bir çok görüntü etmektir. Bu parçacıklar modelleri oluşturmak için ve model üretimi için tohum üretmek için ortalaması alınır birimleridir. İkinci aşamada son aşamada partiküllerinin tüm dizi kaydetmek için kullanılan tohum görüntü oluşturmak için. Bu s katkıda bu kanalda parçacıkların, el ile, bir referans kanalı seçme ve yapılıreeds. Tohumlar, bu referans kanalı olarak seçilir, ancak tüm kanallar için oluşturulabilir. Parçacıklar başlangıçta bu kanalda bir 2D Gauss uydurma ile yeniden düzenlenebilir edilir. Seçilen ve yeniden düzenlendi olan tüm parçacıkları daha sonra bir tohum üretilmesi için ortalaması alınmıştır. modellenecek olan veriler görülen her bir ortak bir yapı için, parçacıklar açık ve doğru bir şekilde yapıyı temsil tohum olarak seçilmelidir. Bu aşamada arayüz ayrıca, yapıları için verileri taramak için faydalıdır.

Son aşama şablon eşleştirme kullanarak modellerini üretmektir. Bu, başlangıçta, çapraz korelasyon önceki bölümde oluşturulan tohum resimlere ekstre parçacıklarının kayıt ile elde edilir. Kayıtlı parçacıklarının alt birlikte ortalaması alınır ve proses ayrıca arzu edildiği takdirde, hata kare ortalaması modeli azaltmak için tekrarlanır. Bu alt küme yerine getirilmesi gereken tohum karşı minimum benzerlik kurarak belirlenir. model oluştururkenbirden fazla kanal eş zamanlı olarak s, eklem benzerlik, ya da her bir kanal için benzerlikler ortalama kullanılır. bunlara katkıda elde edilen model ve kayıt parçacıklar daha sonra analiz edilebilir.

Protokol

NOT: Bu protokol ve video daha ayrıntılı olarak yazılım paketini açıklayan orijinal kağıt ¹⁰ tamamlar. Okuyucular yazılımın kullanımına yönelik ek rehberlik için dikkatli bir şekilde inceleyin teşvik edilmektedir. üç ana aşama vardır: parçacık ekstraksiyon, tek tek parçacıklar halinde bölümler büyük görüntüler; ortak yapılar son aşamada kullanılan tohum üretmek için veri tanımlanır ve hizalanır tohum seçimi; ve şablon uygun bu tohumlar göre modeli üretme, ekstre parçacıkları ve ortalamalar SPA modeller üretmek için bir alt hizalar.

1. Kur öncesinde Yazılım Paketi Koşu için

1. Bir lamel veya ilgili deney koşullarında çalışılan yapının örnekleri hazırlayın.
2. Resim gibi yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SİM) ¹¹ veya stimula olarak süper çözünürlüklü floresan mikroskobu ile örnekleri,ted emisyon tükenmesi (STED) ¹² mikroskopi.
   NOT: hazırlamak ve ilgili literatür danışılmalıdır böylece görüntü örnekleri, çalışmanın altında yapının niteliğine büyük ölçüde bağlıdır nasıl kesin detayları. Bir örnek olarak, hazırlama ve burada kullanılanlar gibi aşı virüsü örnekleri, görüntüleme için kesin usul, temsili sonuçlar bölümünde tarif edilmektedir.
3. yapı ya da tanecikler, tercihen binlerce ayrı kopyalar, çok sayıda gösteren birkaç bakış alanları görüntü oluşturma. hem de mümkün olduğu kadar birbirlerinden ayrılmış ve görüntüler kir veya ilgi olmayan diğer floresan yapılar olduklarından emin olan Resim parçacıkları.
4. Fiji araç çubuğu içine dosyaları sürükleyerek veya> "Aç" "Dosya" seçerek Fiji partikülleri içeren tüm görüntüleri açın.
5. bitiştirmek için "Concatenate" "Görüntü"> "Yığın"> "Araçlar"> seçinTek bir yığın halinde ve görüntüler. çıkan görüntü bir hyperstack ise, daha sonra,> "Hyperstacks"> "hyperstack Stack için" "Image" seçeneğini seçerek bir yığın haline getirmek.
   NOT: Nihai yığın interkalantlı kanalları olmalıdır. iki kanal varsa, istifin ilk dilim ilk görüntü kanal 1 olmalıdır, ikinci dilim karşılık gelen kanal 2, üçüncü dilim ikinci görüntü kanal 1 olabilir, ve böylece gereken olmalıdır.

2. Partiküllerin ekstrakte

1. segmente resim seçin ve "Viral Yapılar Özü" seçeneğini seçin. çıkarılan parçacıkları kaydetmek ve "Özü Viral Yapılar" görmek yeri seçin iletişim (Şekil 2).
2. aşağıdaki gibi "Viral Yapılar Özü" iletişim girerek ilk tahminleri ile ekstraksiyon parametrelerinin atayın. görüntü segmentasyon önizledikten sonra bu parametreler ince ayar.
   1. uyuşmuş ayarlaimaged farklı floresan kanalların sayısı veri kümesi kanal er (örneğin, 2).
   2. parçacıklar kanal seçim numarasını girerek bu kanal piklerin tespiti ile ekstre edildiği bir referans kanalı olarak ayarlayın. en tutarlı kanalı seçin; yani, kanal içinde en parçacıklar aynı görünüme sahiptir.
      NOT: Bu kanalda parçacıkların bir merkezi maksimum olacaktır Mümkünse.
   3. Önceden tespit Gauss bulanıklığı uygulamak olsun veya olmasın seçin. herhangi bir bulanıklık geçerlidir 0 önceden tespit Gauss bulanıklığı ayarlayın; bu değer arttırılırsa, belirli bir yarıçapın bir Gauss bulanıklığı filtre lokal maksimumlar algılama önce uygulanır. Referans kanal bir orta maksimum (örneğin, halka şekli) sahip değildir, bu özelliği kullanılır; bulanıklaştırma birinin görünümünü uyarır.
      NOT: Bu özellik sadece kullanımıdır gibi ilgi Parçalara bölgeleri (ROI), kendilerine uygulanan Gauss bulanıklığı yokd referans kanalı olarak ROI konumlandırmak için.
   4. piksel olarak (her bir yerel maksimum yaklaşık ayarlanacaktır) YG çapındaki ayarlayın. Bu ROI, örneğin Şekil 3'te olduğu gibi büyük partiküllerin, biraz daha büyük olacak şekilde bir değer seçin. büyük parçacıklar (göz ile kabaca tahmin edilen), yaklaşık 30 piksellik bir çapa sahip olduğu görülmektedir, örneğin, daha sonra 20 piksel YG çapındaki ayarlayın.
   5. 100'ün altında bir ilk, nispeten daha küçük bir değere çerçeve başına kullanımı İB'nin sayısını ayarlar.
   6. Maksimum YG örtüşme ayarlayın. Partiküller ayrılır, bu küçük tutmak; partiküller, kümelenmiş ise, üst üste gelecek şekilde ROI etkinleştirmek için bu artış.
3. "Gösterisi önizleme" seçiniz.
   Not: Bu seçildiğinde, mevcut çerçeve ile ilişkili bir referans kanalı için ekstre ROI'ler görünür.
4. YG çapındaki, ROI sayısı ve mümkün olduğu kadar çok partiküller etrafında uygun boyutta ROI için maksimum YG örtüşme ayarlamaŞekil 3'te olduğu gibi.
5. segmentasyon çalıştırmak için "OK" i seçin. Görüntüyü ve YG yöneticisini kapatın.
   NOT: parçacık kümeleri dosyaların isimlerini değiştirmeyin. Bu isimler biçiminde olmalıdır "Viral parçacıklar - channelX" Aşağıdaki bölümler için.

3. Tohumları

1. "Tohumlar üret" Seç çıkarılan parçacıklar kaydedildiği klasörü seçin ve "Tohumlar üret" iletişim ve pencereler (Şekil 4) görmek.
2. aşağıdaki gibi, "Seeds üret" iletişim girerek ilk tohum seçimi parametrelerini atama.
   1. Tüm kanallar hizalamak ve merkez uydurulur referans kanalı olarak ayarlayın. parçacıkların çoğu aynı görünüme sahip ve mümkünse bu, merkezi bir maksimuma sahip olan bir kanal seç.
   2. Bir tohum oluşturulacağı için tüm kanallar için kutuları seçin.
   3. Tohumlar rotat olmalıdır eğer seçin90 ° ed. diğer modelleri ile tutarlı uyum sağlamak için bu özelliği kullanın
   4. Önceden hizalama Gauss bulanıklığı uygulamak olsun veya olmasın seçin. herhangi bir bulanıklık geçerlidir 0 her bir kanal için bulanıklık çapındaki ayarlayın. yeniden düzenlenmesinden önce verilen yarıçaplı bir Gauss bulanıklığı filtre uygulamak için bu değeri arttırın. parçacıkların bir merkezi maksimum yoksa bu özelliği kullanın; bulanıklaştırma birinin görünümünü uyarır.
      NOT: Bu özellik, tutarlı uyum almak için tek olduğu gibi tohumları, uygulanan bulanıklık olmaz.
   5. kontrol ya da her bir kanal için "Kaydırma düzeltme", kutuları, döndürmek olmamakla birlikte, ayrı ayrı referans olmayan kanallar için tohum merkezi kaydırma düzeltme kullanmak için seçin.
      NOT: Kanallar birbirlerini iyi hizalanmış değilse bunu kullanın; Bu aynı zamanda kaydırma düzeltme olmaksızın sadece referansa göre diğer kanallar hizalamak için yararlı olabilir.
3. Tohum olarak kullanmak için parçacıkların seçin. t yoluyla arao model ve çerçeve sayısını kaydetmek için aşağıdaki yapıya benzer bir parçacık bulmak için sekansı partikül.
4. Kutusu "kullanmaya Çerçeveler" in numarasını girin ve daha pencereler (Şekil 5) görünecektir. virgülle ayrılmış birden çok çerçeve numarasını girin.
5. görünen pencerelerde tohum çerçeveleri ve sonuçta ortalama tohum görüntüle.
   NOT: Günlük ortalamaya benzer tohum önerir.
6. Bulunan tohum kare bir dizi benzer bir görünüme sahip olacak şekilde, tohum seçimi işlemi optimize etmek için bir referans kanalı, Gauss bulanıklığı çapındaki ve kaydırma düzeltme seçeneklerini ayarlayın. Ortalama tohumlar tatminkar modellenmiş edilecek verilerde görülen yapıyı benzediğini oluşturulur kadar eklenmeye tohumları devam edin.
7. tohum Ad ve onlar kaydedilebilir ve seçmek olacaktır nerede "Tamam" modeli nesil sonra kullanılmak üzere nihai tohum görüntüleri kaydetmek için.

4. Modelleri üret

1. Select, "tohumları Dayalı modelleri oluşturmak" ekstre parçacıkları kaydedilir klasörü seçin ve "modelleri oluşturmak" iletişim (Şekil 6).
2. işaret kutularını kullanarak her bir kanal için tohum yükleyin.
   NOT: Tohumlar "Seeds üret" iletişim kutusunda seçildi bir alt klasörde kaydedilir. Varsayılan ad "Analiz" dir. Tohum Ortalamalar değil de referans için kaydedilir Çerçeveler, seçmek için özen gösterin.
3. aşağıdaki gibi, "Modeller üret" iletişim girerek ilk modeli oluşturma parametrelerini atama. Bu parametreler daha sonra ince ayar.
   1. Sadece referans kanalından translasyon ve rotasyon hesaplar ile bütün kanallar için uygular hizalama için bir referans kanalı kullanmak için seçin. Bu seçeneği kullanılıyorsa, referans olarak kullanmak üzere kanalı seçin.
      NOT: Bu seçenek yalnızca özel bir refere olarak bir kanal kullanmayı tercih edilmelidirBu tür bir referans tabanlı yapı bulma durumu gibi nce. Aksi takdirde, daha az doğru modellere sonuçlanacaktır. kanallar da bu seçeneği kullanılarak eğer aynı hizada olmalıdır.
   2. Şablon eşleme sırasında görüntü yoğunluklarını kare seçin. Bu küçük farklılıkları vurgulamak, bu nedenle özellikle ince özelliklere sahip bir model oluştururken bunu kullanır.
   3. "En az bir benzerlik tohum karşı" sürgüyü kullanarak ya da kutuya bir sayı girerek tohum karşı minimum benzerlik seçin.
      NOT: Sadece kullanılan bu kesme daha büyük tohumlara bir benzerliği olan parçacıklar. % 60-80, tipik ile başlamak için iyi bir seçimdir.
   4. 1'e Maksimum yineleme sayısı ayarlama tohum karşı en az benzerlik optimize etmek ve gerekirse, daha sonra artar.
   5. görünecektir model üretme sürecinin unsurlarını seçmek için kutuları işaretleyin.
      NOT: "Göster tohumlar" kutularda yükledik tohum gösterecektirİletişim kutusunun üstündeki s. "Göster modelleri" tohum karşı asgari benzerlik karşılayan parçacıkların alt kümesini ortalaması alınarak oluşturulan modellerin tüm yinelemeleri gösterecektir. "Göster MSE" En değişkendir modelin yerleri vurgulamaktadır ortalama kare hatası (MSE) karesini gösterir. "Göster parçacıklar" görüntülenir modelin en yüksek yineleme gereği kayıtlı modelleri oluşturmak için kullanılan parçacıkların alt kümesini, gösterecektir.
4. önizleme modellerini oluşturmak ve sonuçlarını görüntülemek için "göster önizleme" seçiniz.
   NOT: Bu sürecin en yoğun hesaplama gerektiren adımdır. Bir masaüstü bilgisayarda piksel birkaç onlarca çaplı birkaç bin parçacıkların kümesi için çalışma süresi yaklaşık 10 dakika olmalıdır. hesaplama zamanı sorunu ise, kullanıcılar ilk verilerin daha küçük bir alt kümesinde algoritması denemelisiniz ya da mümkünse, adım 2.2.4 daha küçük bir ROI yarıçapı kullanın.
5. üretmek görüntüled model parametreleri, tohum karşı, özellikle en az bir benzerlik optimize. modellenen morfolojisinin tek gerçek parçacıklar modeline dahildir kadar tohum karşı asgari benzerliği arttırın.
6. sürgünün "Maksimum yineleme sayısı" kullanarak veya kutusuna bir numara girerek Maksimum yineleme sayısı artırmak ve model üretme işlemi yineleme izin verir. maksimal yineleme için 10 civarında bir değeri kullanın.
7. modellerini Ad ve son model üretme sürecinin tüm yinelemeleri ihtiva modeli evrim yığınlarını kaydetmek için "Tamam" ı seçin.
   NOT: tohum karşı asgari benzerlik yok parçacıklar bu benzerliği var o kadar yüksektir ki, hiçbir şey güncellenecektir. eklenti dondurulacak görünüyorsa, asgari benzerlik çok yüksek olma olasılığını göz önünde bulundurun.

Sonuçlar

Burada, modeli poksvirüs, aşı virüsü yazılımı göstermektedir. En kompleks bir memeli virüsleri, aşı paketi bir 350 x 270 x 250 mil ³ tuğla şekilli parçacık ^{13, 14} içinde yaklaşık 80 farklı proteinler. Üç altyapılar elektron mikroskobu ile ayırt edilebilen: dsDNA genomu içeren bir merkezi çekirdek; İki protein yapıları, çekirdek kuşatan adı yanal gövdeleri; ve tek bir proteolipid iki tabakalı ¹⁵ zarf. Rekombinant floresan protein etiketleme büyük boy, karmaşık bir yapı ve yatkınlığını vaccinia VirusMapper akışını göstermek için mükemmel bir sistem yapmak.

Burada açıklandığı gibi yazılım kullanılarak, aşı virionun proteinlerin çeşitli dağılımı modellenebilir. Bir proteini, etiketlenmiş ve kombi muhtemelen, görüntülenmiştirparçacık o proteinin lokalizasyonu ortalama modeller üretmek için tarif edildiği gibi, bir referans olarak bilinen dağıtım başka protein ve yazılım ile ulus kullanılmıştır. Bu örnekte, iki proteinin, iç çekirdek proteini L4 model ve ana yanal gövde bileşeni, F17 edildi.

F 17 sahip olan bir rekombinant vaccinia virüsü, GFP'li etiketlenmiş ve MCherry ¹⁶ kullanılmıştır L4 etiketli. Saflaştırılmış virüsü 1 mM Tris, pH 9 içinde seyreltilmiş ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kaplanmasıyla yıkandı ve yüksek performanslı lamelleri bağlanmıştır. Numuneler daha sonra 20 dakika boyunca PBS içinde% 4 formaldehit uygulanması ile tespit edilmiştir. Lameller antifade montaj ortamda slaytların üzerine derhal monte edildi. Görüntüleme ticari bir SİM mikroskop SİM tarafından gerçekleştirilmiştir. görüntü alanı 5 faz değişimleri ve 561 nm 3 ızgara dönüşleri (32 um ızgara pe kullanılarak elde edildi virüs ve yüzlerce görüntü içeren seçildiön em) ve 488 nm (32 um Izgara periyodu) lazerler. Görüntüler bir sCMOS kamera kullanılarak elde ve mikroskop yazılımı kullanılarak işlenmiştir. Kanallar aynı görüntü elde etme ayarları ile görüntülenmiş çok renkli boncuk slayt dayalı hizalanmış edildi. SİM yeniden yapılanma ve kanal hizalama görüntü Fiji açıldı ve tek bir görüntü yığını halinde birleştirilmiş edildikten sonra.

Bu tanecikler, bir merkezi en fazla gibi viral partiküller, referans olarak ve herhangi bir Gauss bulanıklığı uygulamadan L4 kanalı kullanarak görüntü elde edildi. Yaklaşık 15,000 parçacıklar, bu deneyde ekstre edildi.

Nedeniyle ineklerdeki geometrisine, yanal gövdeleri virüs yönlendirmesine göre belirgin bir şekilde farklı bir görünüme sahiptir. Bu bir ya da iki yan organları ayırt edilebilir olan iki yönelimleri görüntülenmiştir. Biz frontal ve sagittal, saygı gibi bu yönelimlerin anılacaktıryanıtını verdiler.

Ön ve sajital yönelimleri için ayrı tohumlar "tohumları oluşturmak" aşamasında parçacık liste boyunca arama yolu ile seçildi (Şekil 4 ve 5); Bir yönde açık olan ya da başka seçilmiştir parçacıkları. L4 kanalı birbirleriyle tohum hizalamak için referans kanalı olarak kullanılmıştır. Yine, herhangi bir Gauss bulanıklığı gerekliydi. Her yönlendirme için 5 parçacıkları, ve tohum üretmek için ortalaması alınmıştır.

Modeller bu tohumlar dayalı olarak her bir yönlendirme için üretilmiştir. Bir referans kanalı veya kare yoğunluk değerleri ne kullanılmıştır. Maksimum yineleme sayısı 1 başlangıçta ayarlandı ve en az benzerlik, her yönlendirme için tutarlı bir görünüm veren her bir durumda, yaklaşık 1000 parçacıklar içerir ayarlandı. Maksimum yineleme sayısı, daha sonra yükseltilmiştirModelin yakınlaşma için izin verir. Modeller, böylece iki kanal iki yönelimleri (Şekil 7) için üretilmiştir.

Şekil 1: VirusMapper akışı. eklenti üç ana aşamada düzenlenir. Viral parçacıklar geniş görüntülerden çıkarılır, şablon resim veya tohumlar verilerinden yarı elle seçilir ve nihai SPA modelleri tohum başvurarak veriden üretilmesidir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 2: iletişim "Viral Yapıları Özü". seçerken "Viral structur Özü es ROI önizlenemiyor sağlayan Önizleme göster 'o zaman seçilebilir", bu iletişim görünecektir. parametreleri. Optimal segmentasyon için ilk tahminler ile doldurulmalıdır' ve parametreler ince ayar olması. Bir görüntülemek için lütfen tıklayınız Bu rakamın daha büyük versiyonu.

Şekil 3: ekstraksiyon parametrelerinin ayarlanması. çıkartılacaktır ROI, YG çapındaki, ROI sayısı ve en yüksek YG örtüşme önizleme sonra böyle bir durum elde etmek için ayarlanır. ROI tüm parçacıkların bir ROI dahil edilir ve ROI'ler kümelenmiş parçacıkların ayrılmasına olanak sağlamak için yeterince üst üste binerek, parçacıklar biraz daha büyüktür.ank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: şablon uygun tohum üretme. "Tohum üret" iletişim (1) atanacak parametrelerini ortaya koyar. Referans parçacıkları sekansı (2), kullanıcı referans kanalı olarak parçacıklar aracılığıyla tarama sağlar. bir parçacık referans parçacıkları sırayla bakıldığında, her kanal için yeniden düzenlenebilir parçacıklar realigned parçacık önizleme (3) 'de izlenebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 5: tohum resimler ekleme. Tohumlar eklendikçe kutusu "çerçeveleri kullanımı", ilgili tüm tohumlar (4) ortalama ve çerçeveler (5) gösterildi. mevcut ortalama tohumlara benzer parçacıklar iletişim kutusunda (6) öneriliyor. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 6: iletişim "Modeller üret". seçme "Tohum dayanarak Modelleri üret," Ne zaman bu iletişim görünecektir. parametreleri optimal model üretimi için başlangıç ​​tahminlerinin ile doldurulmalıdır, ve model üretme işleminden unsurları seçilmelidir hesaplama sırasında gösterilebilir. "Önizlemeyi göster" o zaman çalıştırmak için bir model oluşturma sürecini sağlayan seçilebilir ve parametreler ince ayar olması.ftp_upload / 55471 / 55471fig6large.jpg" target = '_ blank'> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: VirusMapper oluşturulacak modeller. mCherry ile etiketlenmiş L4 çekirdek proteini ve EGFP ile etiketlenmiş F17 lateral vücut proteini ile vaccinia virionlar SIM kullanılarak görüntülendi. protokolde tarif edildiği gibi modeller, daha sonra yazılım ile elde edilmiştir. ön ve sajital iki yönelimleri, yan cisimlerin ortaya çıkması ile ayırt edilir. Ölçü bar = 100 nm. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Tartışmalar

Bu yöntemle, araştırmacılar virüs ve diğer makromoleküler kompleksleri protein mimarisinin yüksek hassasiyet, çok kanallı 2D modellerini oluşturmak için SPA ve SR mikroskobu gücünü birleştirmek için donatılmıştır. Ancak, bazı önemli hususlar dikkate alınmalıdır.

Tohumlar sürekli görülen bir yapıyı temsil etmek seçilmelidir. Bu nedenle, ham veriler tohum seçilir önce dikkatlice kontrol edilmelidir. Bu önyargılı modellerini önlenmesi açısından önemlidir. Seçimleri modellerinde parçacıkların belirli bir sayıda içerir için gereken minimum benzerlik eşikleri incelenmesiyle doğrulanabilir. Açıktır ki, tohum seçimi için, daha yüksek Bu eşik parçacıklarının belirli bir sayıda olması gerekmektedir, daha bu yapı verileri belirgindir.

veri heterojenlik olduğunda şablon uygun konsept, özellikle yararlıdır. vi olan bütün farklı yapılarsible tespit edilmeli ve farklı modeller her durum için yarattı. bir kanalda heterojen yapıların ayrılması, ancak eş zamanlı olarak ikinci bir kanala modelleri oluşturarak, desen hususu derhal olmazdı ortaya çıkabilir.

Diğer bir faktör bu algoritma kullanılarak iterasyon prosedürü stokastik asimetri maksimize edeceği zaman farkında olmak. iki simetrik bir maksimaya sahip bir yapı modellerken Örneğin, maksimum arasındaki tüm hafif asimetriler yineleme sırasında birbirleri ile aynı hizada olacak ve nihai modeli, maksimum asimetrik olacaktır. Bu modellenen yapının bilinen bir simetri yansıtmaz, o zaman bu hesaba alınmalıdır. VirusMapper model üretme sürecine simetri eksenleri dahil etmek için potansiyel bir gelişme olacağını rağmen şu anda bu maksimizasyonu önlemenin tek yolu, 1 yineleme sayısını sınırlamaktır. VirusMapper Herhangi yeni versiyonları avai olacakBaşvurulan web sitesinde tıklamanız yeterli olacaktır (Malzeme Tablo). Kullanıcılar ayrıca herhangi bir ortak sorularına yanıt burada SSS bulacaksınız.

açıklandığı gibi yazılım kullanıcı modellemek istediği özelliklere görselleştirmek için yeterli çözünürlüğe sahip görüntülü olabilir herhangi yapıya uygulanabilir. SPA çözünürlüğünü artırabilir rağmen, açıkça aksi görünmez özelliklerin görünürlüğünü artırmak olmayacaktır. Bu protokol, bu nedenle, yöntem, verilerin kalitesini artırmak için değildir. En temiz veri ve iyi çıkan modellerini sağlayacak görüntüleme stratejisinin herhangi bir teknik, dikkatli numune hazırlama ve optimizasyon olduğu gibi.

SR görüntüleme yönteminin seçimi genel olarak el altında numunenin bağlı olacaktır, ayrıca önemlidir ve. , VirusMapper SIM ve STED'in ¹⁰ iyi çalışacak şekilde valide edilmiş ve aynı zamanda yüksek kaliteli yerelleştirme mikroskopi verileri ile kullanılabilir, ancak bakım bu durumda alınmalıdırolarak seyrek etiketleme asimetri maksimizasyonu benzer sorunlara yol açabilir.

Şu anda, VirusMapper floresans görüntüleri tek parçacık analiz ve sadece genel amaçlı 2D SPA ortalama yazılımın tek serbestçe algoritmadır. Aynı ilkeler ^{4, 6} kullanımı yaptık Diğer ^{çalışmalar, 8} her bir çalışma için uzman özel yazılım kullandık. Hiçbir yazılım sağlandı, ancak 3D veri yeniden inşası için Genel amaçlı algoritmalar, ^{5, 18} yayınlandı.

Bu makalede tarif edildiği gibi kullanıldığında, VirusMapper virüs ve diğer kompleksler makromoleküler proteini mimarisi, hassas, doğru ve sağlam bir modeli üretmek için kullanılabilir. Bu model ile, araştırmacılar yapının ortalama boyutları hassas ölçümler alabilirÇalışmanın altında ures, potansiyel olarak onları başka türlü mümkün olmazdı biyolojik sonuçlara ulaşmanıza olanak verir.

Ayrıca, bu tekniğin çok kanallı yetenekleri ile, komplekslerin proteinler ve bileşenlerin sınırsız sayıda eşlemek için ve yeni protein organizasyonu bilgiye mümkündür. Böyle bir virüs yaşam döngüsünün farklı aşamalarında farklı biyolojik ilgili koşullar, içinde nano ölçekli yapısında değişiklikler inceleyen biyoloji değerli bilgiler sunma potansiyeline sahiptir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fiji			Open-source image analysis software
NanoJ-VirusMapper	developed by the Henriques lab		Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper)
VectaShield antifade mounting medium	Vector Labs	H-100
Elyra PS1	Zeiss
ZEN BLACK	Zeiss		Image processing software for SIM
High performance coverslip	Zeiss	474030-9000-000
TetraSpeck beads	ThermoFisher	T7279