Bir Elektronik Romanda Elektronik Sigara Buharı ve Sigara Dumanının Etkilerinin Karşılaştırılması<emIn vivo</em&gt; Pozlama Sistemi

Özet

Bu protokol, kemirgenleri elektronik sigara buharı (E-buhar) ve sigara dumanına maruz bırakmaya yönelik bir yöntemi açıklamaktadır. Maruz kalma odaları, anestezi odalarını, kemirgenlere E-buhar veya sigara dumanı veren otomatik bir pompalama sistemi ile modifiye ederek yapılır. Bu sistem birçok deneysel son noktayı barındıracak şekilde kolaylıkla değiştirilebilir.

Özet

Elektronik sigara (E- sigara ) yaygın olarak kullanılmaktadır ve popülerlik artmaktadır. 9 milyondan fazla yetişkinin bunları düzenli olarak kullandığı tahmin edilmektedir. Elektronik sigara buharı (E-buhar) maruziyetinin potansiyel olumsuz sağlık etkileri tam olarak tanımlanmamıştır. E- buhar maruziyetinin birkaç hayvan modelleri geliştirildi, ancak az sayıda model kemirgeyi klinik olarak ilgili nikotin miktarlarına maruz bırakır ve aynı maruz kalma sistemi içinde sigara dumanı ile doğrudan karşılaştırmalar yapar. Burada, bir E- buhar odası ve sigara dumanı odası oluşturmak ve işletmek için bir yöntem sunuyoruz. Odalar, anestezi odalarını donatılmış bilgisayar kontrollü pompalama sistemi ile tutarlı miktarda E❖: Buharı veya sigara içicisini kemirgenlere bulaştırın Nikotin maruziyeti öncesi ve sonrası maruz kaldıktan sonra kotinin düzeylerini ölçerek dolaylı olarak ölçülür.Bu maruz kalma sistemi çeşitli e- sigara ve tütün sigaralarını içerecek şekilde modifiye edilebilir ve In-vivo buhar ve sigara dumanı etkilerini karşılaştırmak için kullanılmalıdır.

Giriş

2004 yılında ABD pazarına girdikten sonra, elektronik sigara (E-sigara) milyar dolarlık bir sektör haline geldi ve yaklaşık 9 milyon yetişkinin bunları düzenli olarak kullandığı tahmin edilmektedir ¹ . 2014 ve 2015'te, daha fazla lise öğrencisi geleneksel sigaradan ² E-sigarayı kullanmıştı. Artan sayıda E-sigara kullanıcısı, muhtemel olumsuz sağlık etkilerini değerlendirmek için bir araştırma çabası ortaya çıkardı.

E-sigara tipik olarak su, polietilen glikol veya bitkisel gliserin, nikotin ve aroma ^{3 , 4'ün} bir karışımını içeren bir viskoz çözeltiyi ısıtarak bir buhar ("E-buhar" olarak adlandırılır) üretir. E-buharın, Reaktif Oksijen Türleri (ROS), nikotin, çeşitli aldehitler ve polisiklik aromatik hidrokarbonlar ⁵ dahil olmak üzere çeşitli zararlı bileşikler içerdiği gösterilmiştir ^.6. Bu bileşiklerin birçoğu E-sıvının buharlaştırma işlemi sırasında teneffüs etmeden önce oluşur ⁷ . Özellikle, bu zararlı bileşiklerin birçoğu aynı zamanda sigara dumanında mevcut olup, E-sigara kullanımının benzer olumsuz sağlık sonuçları olabileceği endişesi yaratmaktadır ⁷ .

E-sigaranın sağlık üzerindeki etkileri konusunda pek az fikir birliğine varılmıştır. Buna değinmek için, E-buharı maruziyetinin birkaç hayvan modeli geliştirilmiştir ( Tablo 1 ). Bu modeller, tüm vücut E-buhar pozlama ve mekanik havalandırma gibi çeşitli yöntemler kullanmaktadır. Mevcut modeller anlamlı bilgiler sağlamasına rağmen, az sayıda kişi aynı maruz kalma sistemi içinde sigara dumanı ile doğrudan karşılaştırmalar yapmaktadır ( Tablo 1 ). Ek olarak, çeşitli insan çalışmaları, E-sigara kullanıcıları ve sigara içenlerde 30-200 ng / mL arasında serum kotinin düzeylerine sahip olduklarını göstermesine karşın, birçok E-buhar ve duman maruziyeti modeli düşerIde bu aralık ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12} .

Burada, insan çalışmalarına benzer serum kotinin düzeyleri veren in vivo sigara dumanının ve E-buhar maruziyetinin etkilerinin karşılaştırılması için bir yöntem sunuyoruz.

Protokol

Aşağıdaki protokol, Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesinin (IACUC) yönlendirmesi ve onayı ile gerçekleştirilmiştir.

1. Elektronik Sigara-Buhar Odası Meclisi

NOT: Komple hazne kullanım sırasında bir duman kabına yerleştirilmelidir. Buradaki oda, sıcaklık kontrollü ve filtrelenmiş bir laboratuar ortamında barındırıldı. Araştırmacılar, oda hava kalitesinin tutarlı olmasını sağlamak için sistemin bu yönlerini izlemeyi seçebilirler. Bir seçenek olarak, monitörleri bir metal kafesle örtmek kemirgen kurcalanmasını önlerken, monitörlerin iç hazne çevresini örneklemesine izin verir.

1. 20 L hacimli hava geçirmez çıkarılabilir kapaklı bir anestezi haznesi edinin.
2. Malzemeyi kesmek için uygun bir bıçak takılmış bir jig tester kullanarak, haznenin kapağında 10,2 cm çapında bir delik, plakanın arka kenarından yaklaşık 7.6 cm kadar kesiniz.bölme.
3. Ayarlanabilir havalandırma deliğini deliğe yerleştirin ve herhangi bir kauçuk yapıştırıcı ile yerine oturtun.
   NOT: Küfe yapıştırabileceğinden, yapışkan kütüğün bölmedeki kemirgenlerin erişemeyeceğinden emin olun. Bu olası sorunu önlemek için havalandırma deliğini monte etmek için keresteyi bölme duvarının dışına uygulayın.
4. Silikon boruları iki 15 cm'lik parçaya kesin ve uçları bir T-konektörün iki tarafına da takın.
   NOT: Silikon hortumun e-buharın veya sigara dumanının bazı bileşenleri ile reaksiyon yapma potansiyeli vardır. Böylece araştırmacılar, reaktif olmayan hortum kullanmayı düşünebilirler.
5. T-konektörün haznenin içinde olması için her iki silikon boruyu hazne kapağının önüne yakın deliklerden geçirin. Borunun, yapışkan krikoyla veya elektrik bandıyla kapağa sabitlendiğinden emin olun.
6. Silikon borunun serbest uçlarını iki mikro hava pompasının çıkış uçlarına bağlayın. Pompalar, haznenin kapağına,Yapışkan bant veya kıvrıktır.
   NOT: Kullanım sırasında borunun iç yüzeyi üzerindeki buhar toplama miktarını sınırlamak için pompanın çıkış ucuna bağlı boru uzunluğu kısa olmalıdır.
7. Yeni bir silikon tüp ile bir ucunu hava pompalarından birinin giriş tarafına takın ( Şekil 1'deki Pompa A) ve bu boruyu yaklaşık 4 cm uzunluğunda kesiniz. Burası oda içi kullanım sırasında elektronik sigara içeceği yerdir. Borunun çapının e-cig'in ucunun etrafında rahatça oturmasını sağlayın.
8. Yeni bir silikon tüp ile bir ucunu diğer hava pompasının giriş tarafına takın ( Şekil 1'deki Pompa B). Bu pompa odaya oda havası getirir. Bu nedenle tüpün ucu davlumbağın dışına yerleştirilmelidir. Bu tüpün uzunluğu kritik değildir, ancak hava akışı direncini sınırlamak için mümkün olduğunca kısa olmalıdır.
9. Odanın içinde, oksigeyi tutmak için çift taraflı yapışkanlı iki küçük kanca takınEn karbon monoksit gaz monitörleri.

Şekil 1. Elektronik Sigara-Buhar Odası Şeması.
Oda hazneye yerleştirilmiştir (gösterilmemiştir). Oda hava pompası (Pompa B), duman kabini dışından odaya sürekli olarak 2 L / dakika ile oda havası getirir. E-cig pompası (Pompa A) 133 santigrat derecede E-buharını 4 s boyunca püskürterek 30 s dinlenme aralığı sağlar. E-buhar ve oda havası oda içine pompalanmadan önce karışır. Gaz monitörleri odadaki karbon monoksit (CO) ve oksijen (O2) konsantrasyonlarını sürekli olarak ölçerler. E-buhar, havalandırma vasıtasıyla paslanmaz çelik davlumbaz içine pasif olarak tüketilir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

2. Sigara Dumanı Odası Ünitesi

NOT: Hemen hemen her marka oF sigarası bu sistemle kullanılabilir, ancak University of Kentucky 1R6F Research Cigarette gibi standart araştırma sigaraları, bu uygulama için uygun maliyetli, güvenilir ve en iyisidir.

1. Adım 1.1 - 1.6, & 1. adıma kadar olan adımları izleyin.
2. Yeni bir silikon tüp ile bir ucunu sigara aydınlatma cihazına ve diğer ucunu hava pompasının giriş tarafına ( Şekil 2'deki Pompa A) takın. Sigara aydınlatması kullanırken duman kabini içine ve odanın dışına yerleştirilmelidir.
   Not: Sigara aydınlatma cihazının yapımı metal imalatı ve elektrik mühendisliği bilgisi gerektirir. Burada yapım aşamalı bir kılavuz verilmezken, planlar için ek materyallere bakın.
3. Yeni bir silikon tüp ile bir ucunu diğer hava pompasına takın ( Şekil 2'deki Pompa B). Bu pompa oda içine oda havası getirir, böylece tüpün ucu davlumbazın dışına yerleştirilmelidir. >
4. Bölmenin ön duvarında 5 mm genişliğinde dikey yarıkları kesin ve bölmenin dışına bir bilgisayar fanı bağlayın, böylece bu açıklığı kapatacaktır. Pervanenin ön tarafının odaya doğru baktığından emin olun, böylece fan bu açıklıktan odaya hava üfleyecektir.

Şekil 2. Sigara-duman Odasının Şeması.
Oda hava pompası (Pompa B), duman kabini dışından odaya sürekli olarak 2 L / dakika ile oda havası getirir. Pompa A, litre başına 2 litrelik bir hızla 40 saniye boyunca yanar ve 20 saniye sonra bilgisayar fanı odacığı 3 dakika boyunca boşaltır. Odaya pompalanmadan önce duman ve oda havası karışımı. Gaz monitörleri sürekli olarak karbon monoksit (CO) ve oksijen (O ₂ ) oda konsantrasyonlarını ölçerler. Duman ventili vasıtasıyla davlumbaza tükendi.Ftp_upload / 55672 / 55672fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürden daha büyük sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.

3. Mikrodenetleyici Meclisi ve Yazılımı

1. E-sigara buhar odası ve sigara dumanı odasının pompa sistemini ayrı mikro denetleyicilerle kontrol edin. Mikrodenetleyici yazılımını indirin ve S Tamamlayıcı Materyaller'de verilen işletim kodlarını yükleyin . Elektronik sigara buhar kodu, oda hava pompasını sürekli çalışacak ve her 30 saniyede 4 s süreyle E-sigara pompasını çalıştıracaktır. Sigara dumanı kodu, oda hava pompasını sürekli olarak çalıştırır, sigara pompasını 40 saniye boyunca çalıştırır ve sigara pompası durduktan 20 saniye sonra bilgisayar fanını etkinleştirir. Fan, 3 dakika boyunca çalıştırıldıktan sonra kapanacaktır.
   Not: Pompa ve fan zamanlaması gerektiğinde ayarlanabilir. Mikrodenetleyiciye ilgili kodların nasıl yükleneceği ile ilgili referans üreticinin talimatları.
2. BirleştirmekMikrodenetleyici, fermuar kablolarını, diyotları, dirençleri ve kapasitörleri Şekil 3'te gösterildiği gibi ekme kartına bağlayın ve timsah klips tellerini karşılık gelen hava pompalarına (ve sigara dumanı odacığı için bilgisayar fanı) takın. Mümkünse mikro denetleyiciyi davlumbazın dışında bırakın.

Şekil 3. Mikrodenetleyici Şematiği.
Mikrodenetleyici ve ekmek tahtası şematik olarak hava pompaları ve fan zamanlaması çalışması için. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

4. Hayvanlar

1. 450-520 g ağırlığındaki yetişkin fareleri kullanın.
2. Grup sıçanlar maruz kalma türüne göre ( ör. Elektronik sigara, sigara dumanı, oda havası oda içine pompalanır).
3. Şu anda prMaruz kalmaktan önce, temel serum kotinin konsantrasyonunu ölçmek için şırınga kullanarak kuyruk damarından EDTA kaplı tüplerde 500 μL kan toplayın.
4. Kan örneklerini 20,000 xg'de 4 ˚C'de 30 dakika döndürünüz ve serum toplamış olursunuz. Bu işlem boyunca örneklerin buzda soğutulduğundan emin olun.
5. Üreticinin protokolünü takiben, serum numunelerindeki kotinin testi toplandı. Numuneler daha sonra kullanmak üzere -80 ˚C'de saklanabilir.

5. Elektronik Sigara Odasının Çalıştırılması

1. Odanın içini% 70 etanol, daha sonra deiyonize su ile temizleyin ve oda tamamen kurumana kadar (veya yaklaşık 30 dakika) hava kurumasına izin verin.
2. Gaz monitörlerini kalibre edin ve tüm monitörü haznenin içindeki duvara monte edin.
3. Sıçanları odanın içine yerleştirin. Eşzamanlı olarak üç hayvanın aynı anda maruz kalabileceğini unutmayın.
4. E-sigaranın yeterli miktarda E-sıvı ile dolu olduğundan emin olun ve E-sigarayı takınGirdi tüpüne. E-sigara pilinin ve E-sıvı seviyelerinin 90 dakikalık maruz kalma süresi boyunca yeterli olduğundan emin olmak önemlidir.
5. Hava pompalarını açın ve zamanlayıcıyı çalıştırın.
6. Maruz kalma esnasında bölmenin>% 20 O ₂ ve 0 ppm CO içerdiğinden emin olmak için gaz monitörlerini gözlemleyin.
   Not: Oksijen seviyeleri düşerse, hazne iyi havalandırılamayabilir veya oksijen monitörü uygun şekilde kalibre edilemeyebilir.
7. Maruz kalma süresi 90 dakikaya ulaştığında, E-sigarayı çıkarın ve geri kalan buharı boşaltmak için gaz pompalarını çalıştırmaya devam edin. Buna ek olarak, havalandırma hızını arttırmak için odanın üstü kaldırılabilir.
8. Buhar giderildikten sonra sıçanları çıkarın ve bölmeyi temizleyin.
9. Deneysel protokolün sonucunda maruz kaldıktan yaklaşık 1 saat sonra her bir sıçandan kuyruk veninden 500 μL kan toplayın.
10. Kantini için serum ve tahlil izole etmek için 4.4 - 4.5 adımlarını izleyin.

6. Tütün Sigara Porsiyonunun İşletilmesi

1. 5.1 - 5.3 arasındaki adımları izleyin.
2. Sigaranın ucu ısıtma elemanlarına yaslanacak şekilde sigara aydınlatma cihazına sigarayı yerleştirin.
3. Sigara izmariti yanmaya başlayıncaya kadar (yaklaşık 5 saniye), sigara aydınlatma cihazını açın.
4. Sigarayı yaktıktan sonra, pompa sistemini açın, zamanlayıcıyı çalıştırın ve sigarayı tamamlamak üzere (yaklaşık 40 saniye) gözlemleyin.
5. Sigara bir kez yandığında, harcanmış sigarayı, forseps ile dikkatlice sigara aydınlatma cihazından çıkarın.
6. CO seviyelerinin 1000 ppm'nin üzerine çıkmadığından ve O2 seviyelerinin% 20'nin altına düşmediğinden emin olun. Bilgisayar fanı zamanlaması ve süresi, karbon monoksit birikimini önlemede kritik önem taşır.
7. Fareler 90 dk (veya yaklaşık 23 sigara) tütün dumanına maruz bırakılana kadar 4 dakika sonra pompalama sistemini kapatın ve adım 6.2'ye geri dönün.
   NOT: Sigara burundan 4 dakika sonra karbon monoksit seviyeleriNing 400 ppm'nin altına düşecektir, aksi takdirde oda içinde karbon monoksit birikmeye başlayabilir.
8. Pozlama tamamlandığında, artık dumanı havalandırmak için pompa sistemini açık bırakmaya devam edin. Karbon monoksit 100 ppm'in altına düştüğünde, fareyi odacıklardan çıkarın. Bu işlem 5-10 dakika sürmelidir.
9. Sıçanları çıkarın ve bölmeyi temizleyin.
10. E-sigaralar gibi deney protokolünün sonucunda maruz kaldıktan yaklaşık 1 saat sonra kuyruk damarından 500 μL kan toplayın.
11. Kantini için serum ve tahlil izole etmek için 4.4 - 4.5 adımlarını izleyin.

Sonuçlar

Karbon monoksit ve oksijen denetimi

E-buhar maruziyeti sırasında oksijen konsantrasyonları% 20'nin altına düşmedi ve CO konsantrasyonları maruz kalma boyunca saptanamamış kaldı. Sigara dumanı maruziyeti sırasında gaz monitörleri, oksijen konsantrasyonunun% 20'nin üzerinde kaldığını gösteriyor. Karbon monoksit konsantrasyonları 1000 ppm'yi geçmemiştir ( Şekil 4 ).

Tartışmalar

Burada, kemirgenleri E-buhar ve sigara dumanına kontrollü bir şekilde maruz bırakan bölmelerin oluşturulması için bir yöntem anlatılmaktadır ( Şekil 6 ). E-sigara odasının yapımı, ticari pozlama sistemlerine ^{14 , 15 , 16} kıyasla nispeten basit ve ucuzdur. Bölmeyi inşa etmek için gerekli parça ve aletler online ticari tedarikçilerden kolayca temin edilebilir. Benzer şekilde, sigara dumanı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
blu PLUS Rechargeable Kit	blu eCigs	N/A
1R6F Reference Cigarettes	Center for Tob Ref  Prod UK	N/A
Lexan Anesthesia Chamber 20 L	Jorgensen Laboratories	JOR265
Arduino UNO	Arduino	2877
Diode Rectifier - 1 A; 50 V	Spark Fun	COM-08589
Resistor 10 KOhm 1/6th W PTH - 20 pack	Spark Fun	COM-11508
Electrolytic Decoupling Capacitors - 100 uF/25 V	Spark Fun	COM-00096
Solderless Plug-in BreadBoard	BusBoard Prototype Systems	BB400
Alligator-Clip Wires	BusBoard Prototype Systems	CA-M-20
ZipWire	BusBoard Prototype Systems	ZW-MM-10
Standard Fan 80 ST2	Cooler Master	R4-S8R-20AK-GP
ARIC 4" adjustable vent	Bestlouver	N/A
ToxiPro  Carbon Monoxide (CO) Monitor	Honeywell Analytics	54-00-10316
ToxiPro Oxygen (O2) Monitor	Honeywell Analytics	54-45-90-VD
ToxiPro IQ Express Docking Station	Honeywell/Sperian Biosystems	54-46-9100
Command Wall Hook Small Wire 6-Pack	3M	N/A
Micro Water/Air Pump	Xiamen Conjoin Electronics	CJWP40-A12A1
1/4" Silicon Tubing	NewAge	2801470-100
T Connector	Bel-Art Scienceware	F196060000
Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA	Becton, Dickinson and Company	367841
Cotinine ELISA kit	Calbiotech	CO096D