전자 담배와 담배 연기의 효과 비교<em&gt; In Vivo</em&gt; 노출 시스템

요약

이 프로토콜은 설치류를 전자 담배 (E-vapor) 및 담배 연기에 노출시키는 방법을 설명합니다. 노출 챔버는 설치류에 전자 증기 또는 담배 연기를 전달하는 자동화 된 펌핑 시스템으로 마취 챔버를 개조하여 구성됩니다. 이 시스템은 많은 실험적 엔드 포인트를 수용하도록 쉽게 수정할 수 있습니다.

초록

전자 담배 (E- cigarettes )가 널리 사용되고 있으며 인기가 높아지고 있습니다. 900 만 명 이상의 성인이 정기적으로 사용합니다. 전자 담배 증기 (E- 증기) 노출로 인한 잠재적 인 건강상의 악영향은 잘 정의되어 있지 않습니다. E- 수증기 노출의 여러 동물 모델이 개발되었지만, 설치류를 임상 적으로 관련된 양의 니코틴에 노출시키고 동일한 노출 시스템 내에서 담배 연기와 직접 비교할 수있는 모델은 거의 없습니다. 여기서는 E- 증기 챔버 및 담배 연기 챔버를 구성하고 작동시키는 방법을 제시합니다. 챔버는 컴퓨터 제어 펌핑 시스템으로 마취 챔버를 구성하여 일정한 양의 E쥐에게 증기 또는 담배 연기가 나는 경우 니코틴 노출은 사전 및 사후 노출 혈청 코티닌 수치를 정량적으로 측정하여 간접적으로 측정됩니다.이 노출 시스템은 다양한 종류의 전자 담배 및 담배를 수용 할 수 있도록 변형 될 수 있으며 생체 내에서 의 전자 증기 및 담배 연기의 효과를 비교하는 데 사용됩니다.

서문

2004 년 미국 시장에 진출한 이래 전자 담배 (E 담배)가 10 억 달러 규모의 산업으로 확대되면서 거의 9 백만 명의 성인이 정기적으로 담배를 사용하고있는 것으로 추산됩니다 ¹ . 2014 년과 2015 년에는 고교생이 기존의 담배보다 전자 담배를 더 많이 사용했습니다 ² . E- 담배 사용자가 늘어나면서 잠재적 인 건강 상 악영향을 평가하기위한 연구 노력이 시작되었습니다.

전자 담배는 일반적으로 물, 폴리에틸렌 글리콜 또는 식물성 글리세린, 니코틴 및 향료의 혼합물을 포함하는 점성 솔루션을 가열하여 증기 ( "E- 증기"라고 함)를 생성합니다 ^{3 , 4} . 전자 증기는 반응성 산소 종 (ROS), 니코틴, 다양한 알데히드 및 ​​다환 방향족 탄화수소를 포함한 몇 가지 유해 화합물을 함유하고 있으며 ^,6. 이러한 많은 화합물은 흡입 전에 E- 액체의 증발 과정에서 형성됩니다. 주목할 만하게,이 유해한 화합물의 몇몇은 또한 담배 연기 안에 또한 있고, E 담배가 유사한 건강 결과 초래할 수 있는다 고 우려를 제기했다.

전자 담배의 건강에 미치는 영향에 대해서는 거의 합의가 없습니다. 이를 해결하기 위해 E- 증기 노출에 대한 몇 가지 동물 모델이 개발되었다 ( 표 1 ). 이 모델은 전신 E- 증기 노출 및 기계식 환기와 같은 다양한 방법을 사용합니다. 현재 모델은 통찰력있는 데이터를 제공하지만, 동일한 노출 시스템 내에서 담배 연기를 직접 비교하는 사람은 거의 없습니다 ( 표 1 ). 또한 여러 사람의 연구에서 E 담배와 흡연자가 혈청 cotinine 수치가 30-200ng / mL 사이임을 보여 주었지만 E- 증기 및 담배 연기 노출의 많은 모델이 감소했습니다이 범위는 ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12} 입니다.

여기서 우리는 인체 연구와 유사한 혈청 코티닌 수준을 산출 하는 생체 내에서의 담배 연기 및 E- 증기 노출의 효과를 비교하는 방법을 제시한다.

프로토콜

다음 프로토콜은 미시간 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 지침 및 승인하에 수행되었습니다.

1. 전자 담배 - 증기 챔버 어셈블리

참고 : 사용 중에는 전체 챔버를 흄 후드에 두어야합니다. 여기 챔버는 온도 조절되고 여과 된 실험실 환경에 보관되었습니다. 수사관은 실내 공기의 질을 일정하게 유지하기 위해 시스템의 이러한 측면을 모니터링하도록 선택할 수 있습니다. 옵션으로 금속 케이지로 모니터를 덮으면 설치류 조작을 방지하고 모니터가 실내 실내 환경을 샘플링하도록 할 수 있습니다.

1. 20 L의 부피로 공기가 통과하는 탈착식 뚜껑이있는 마취 챔버를 확보하십시오.
2. 재료 절단에 적합한 날을 장착 한 지그 톱을 사용하여 챔버의 뚜껑에있는 직경 10.2cm의 구멍을 구멍의 뒤쪽 가장자리에서 약 7.6cm 정도 잘라냅니다.방.
3. 조정 가능한 벤트를 구멍에 삽입하고 모든 코크 접착제로 제자리에 장착하십시오.
   참고 : 코킹을 씹을 수 있으므로 챔버 안의 설치류에 접착제 코킹이되어 있지 않은지 확인하십시오. 이 가능한 문제를 방지하려면 벤트를 장착하기 위해 챔버 벽 바깥쪽에 코킹을하십시오.
4. 실리콘 튜브를 두 개의 15cm 세그먼트로 자르고 T- 커넥터의 한쪽 끝을 연결하십시오.
   참고 : 실리콘 튜빙은 전자 증기 또는 담배 연기의 일부 구성 요소와 반응 할 가능성이 있습니다. 따라서 연구자는 비 반응성 튜브 사용을 고려할 수 있습니다.
5. T- 커넥터가 챔버 내부에 있도록 챔버 뚜껑 앞쪽에있는 미리 준비된 구멍에 두 개의 실리콘 튜브를 끼 웁니다. 접착제가 코킹 또는 전기 테이프로 뚜껑에 고정되었는지 확인하십시오.
6. 실리콘 튜빙의 자유 단을 두 개의 마이크로 공기 펌프의 출력 단에 연결하십시오. 펌프는 챔버의 뚜껑에 더블 -양면 접착 테이프 또는 코킹.
   참고 : 펌프 출력단에 연결된 튜빙의 길이는 사용 중에 튜빙 내부 표면의 증기 수집량을 제한하기 위해 짧아야합니다.
7. 새로운 실리콘 튜브를 사용하여 공기 펌프 중 하나의 입력측 ( 그림 1의 펌프 A)에 한쪽 끝을 연결하고이 튜브를 약 4cm 길이로 자릅니다. 이것은 전자 담배가 챔버 사용 중에 삽입되는 곳입니다. 튜브의 직경이 e-cig의 끝 부분에 꼭 맞도록하십시오.
8. 새로운 실리콘 튜브를 사용하여 한쪽 끝을 다른 공기 펌프 ( 그림 1의 펌프 B)의 입력쪽에 연결하십시오. 이 펌프는 실내로 실내 공기를 도입합니다. 따라서, 튜브 끝은 흄 후드 외부에 배치해야합니다. 이 튜브의 길이는 중요하지 않지만 공기 흐름 저항을 제한하기 위해 가능한 한 짧아야합니다.
9. 챔버 내부에 산소가 들어갈 수 있도록 양면 접착제로 두 개의 작은 후크를 부착하십시오.en 및 일산화탄소 가스 모니터.

그림 1. 전자 담배 - 증기 챔버의 개략도.
챔버는 흄 후드에 보관됩니다 (표시되지 않음). 실내 공기 펌프 (펌프 B)는 흄 후드 외부의 실내 공기를 2L / 분으로 지속적으로 챔버로 유입합니다. E-cig 펌프 (펌프 A)는 30 초의 휴식 간격으로 4 초에 걸쳐 133 mL의 E-vapor를 퍼프합니다. 챔버로 펌핑되기 전에 E- 증기 및 실내 공기 혼합. 가스 모니터는 챔버 내부의 일산화탄소 (CO) 및 산소 (O ₂ ) 농도를 지속적으로 측정합니다. E- 증기는 배기 가스를 통해 흄 후드로 수동적으로 배출됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 담배 연기 챔버 어셈블리

참고 : 사실상 모든 브랜드 of 담배를이 시스템과 함께 사용할 수 있지만 University of Kentucky 1R6F Research Cigarette와 같은 표준화 된 연구용 담배는 비용 효율적이고 신뢰성이 높으며이 용도에 가장 적합합니다.

1. 1.1 - 1.6, 1.9 단계를 따릅니다.
2. 새로운 실리콘 튜브를 사용하여 한쪽 끝을 담배 조명 장치에 연결하고 다른 쪽 끝을 공기 펌프의 입력측에 연결하십시오 ( 그림 2의 펌프 A). 담배 조명 장치는 사용 중에 흄 후드 내부와 챔버 외부에 배치해야합니다.
   주 : 담배 조명 장치의 제작에는 금속 제조 및 전기 공학에 대한 지식이 필요합니다. 건설에 대한 단계별 안내서는 여기에 나와 있지 않지만 계획에 대한 보충 자료를 참조하십시오.
3. 새 실리콘 튜브로 한쪽 끝을 다른 공기 펌프에 연결하십시오 ( 그림 2의 펌프 B). 이 펌프는 실내에 실내 공기를 도입 할 것이므로 튜브 끝을 흄 후드 외부에 배치해야합니다. >
4. 챔버의 전면 벽에 5mm 너비의 수직 슬릿을 몇 개 잘라 내고 챔버 외부에 컴퓨터 팬을 설치하여이 개구를 덮도록하십시오. 팬이이 개구부를 통해 챔버 안으로 공기를 불어 넣을 수 있도록 팬의 전면이 챔버를 향하게하십시오.

그림 2. 담배 연기 상자의 개략도.
실내 공기 펌프 (펌프 B)는 흄 후드 외부의 실내 공기를 2L / 분으로 지속적으로 챔버로 유입합니다. 펌프 A는 2 L / 분의 속도로 40 초 동안 점화 된 담배를 끌어 들였고, 20 초 후에 컴퓨터 팬은 3 분 이상 챔버를 비웠다. 연기와 실내 공기는 챔버로 펌핑되기 전에 혼합됩니다. 가스 모니터는 지속적으로 일산화탄소 (CO) 및 산소 (O ₂ ) 챔버 농도를 측정합니다. 연기는 흄 후드로 벤트를 통해 소진됩니다.ftp_upload / 55672 / 55672fig2large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 마이크로 컨트롤러 어셈블리 및 소프트웨어

1. 별도의 마이크로 컨트롤러로 전자 담배 증기 챔버 및 담배 연기 챔버의 펌핑 시스템을 제어하십시오. 마이크로 컨트롤러 소프트웨어를 다운로드하고 S upplementary Materials에 제공된 작동 코드를 업로드하십시오. 전자 담배 증기 코드는 실내 공기 펌프를 연속적으로 가동하고 30 초마다 4 초 동안 전자 담배 펌프를 작동시킵니다. 담배 연기 코드는 실내 공기 펌프를 연속적으로 가동하고 40 초 동안 담배 펌프를 작동 시키며 담배 펌프가 정지 한 후 20 초 동안 컴퓨터 팬을 작동시킵니다. 팬은 3 분 동안 작동 후 차단됩니다.
   참고 : 필요에 따라 펌프 및 팬의 타이밍을 조정할 수 있습니다. 관련 코드를 마이크로 컨트롤러에 업로드하는 방법에 대한 제조업체 지침을 참조하십시오.
2. 조립하기마이크로 컨트롤러에서 그림 3 과 같이 브레드 보드에 지퍼 와이어, 다이오드, 레지스터 및 커패시터를 연결하고 악어 클립 와이어를 해당 공기 펌프 (및 담배 연기 챔버의 컴퓨터 팬)에 연결합니다. 가능한 경우 흄 후드 외부에 마이크로 컨트롤러를 설치하십시오.

그림 3. 마이크로 컨트롤러의 회로도.
공기 펌프 및 팬 타이밍을 작동시키는 마이크로 컨트롤러 및 빵 보드의 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 동물

1. 몸무게 450-520 g의 성인 쥐를 사용하십시오.
2. 노출 유형 ( 예 : 전자 담배, 담배 연기, 실내로 펌핑 된 실내 공기)에 따라 그룹화 된 쥐.
3. 이 시점에서 pr노출 기준으로 주사기를 사용하여 꼬리 정맥에서 EDTA 코팅 튜브에서 500 μL의 혈액을 수집하여 기준 혈청 코티닌 농도를 측정합니다.
4. 혈액 검체를 4 ℃에서 30 분간 20,000 xg으로 회전시키고 혈청을 채취합니다. 이 과정에서 샘플이 얼음 위에서 차가워 지는지 확인하십시오.
5. 제조자 프로토콜에 따라 수집 된 혈청 샘플에서 코티닌에 대한 분석. 나중에 사용할 수 있도록 샘플을 -80 ℃에서 보관할 수도 있습니다.

5. 전자 담배 실내 조작

1. 70 % 에탄올로 챔버의 내부를 닦은 다음 탈 이온수로 세척하고 챔버가 완전히 건조 될 때까지 공기를 건조시킵니다 (약 30 분).
2. 가스 모니터를 보정하고 전체 모니터를 챔버 내부의 벽에 장착하십시오.
3. 챔버 안에 쥐를 놓으십시오. 최대 3 마리의 동물을 동시에 노출시킬 수 있습니다.
4. 전자 담배가 적절한 전자 액으로 완전히 충전되었는지 확인하고 전자 담배를 삽입하십시오입력 튜브에 넣는다. 90 분 노출 기간 동안 전자 담배 배터리 및 E 액체 레벨이 적절한 지 확인하는 것이 중요합니다.
5. 공기 펌프를 켜고 타이머를 시작하십시오.
6. 노출 중 가스 모니터를 관찰하여 챔버에> 20 % O ₂ 및 0ppm CO가 있는지 확인하십시오.
   참고 : 산소 수준이 떨어지면 챔버가 잘 환기되지 않거나 산소 모니터가 적절히 보정되지 않을 수 있습니다.
7. 노출 시간이 90 분에 도달하면 전자 담배를 꺼내고 가스 펌프를 계속 가동하여 남아있는 증기를 배출시킵니다. 또한 환기를 촉진하기 위해 챔버의 상단을들 수 있습니다.
8. 증기가 제거되면 쥐를 제거하고 챔버를 청소하십시오.
9. 실험 프로토콜의 결론에 노출 후 약 1 H 각 쥐에서 꼬리 정맥에서 500 μL 혈액을 수집합니다.
10. 혈청을 분리하고 코티닌에 대한 분석을 위해 4.4 - 4.5 단계를 수행하십시오.

6. 담배 담배 챔버 작동

1. 5.1 - 5.3 단계를 수행하십시오.
2. 가열 요소에 대해 궐련의 끝 부분과 함께 궐련 조명 장치에 궐련을 삽입하십시오.
3. 담배 꽁초가 연기가 날 때까지 (약 5 초) 담배 조명 장치를 켜십시오.
4. 담배가 켜지면 펌핑 시스템을 켜고 타이머를 시작한 후 담배가 완료 될 때까지 (약 40 초) 화상을 관찰합니다.
5. 담배가 타 버린 후에는 조심스럽게 사용 된 담배를 집게로 담배 조명 장치에서 제거하십시오.
6. CO 수준이 1000ppm 이상으로 상승하지 않으며 O2 수준이 20 % 미만으로 떨어지지 않도록하십시오. 컴퓨터 팬 타이밍과 지속 시간은 일산화탄소 축적을 방지하는 데 중요합니다.
7. 4 분 후 펌핑 시스템을 끄고 래트가 담배 연기에 90 분 (또는 약 23 개피) 씩 노출 될 때까지 단계 6.2로 돌아갑니다.
   참고 : 일산화탄소 수준 담배 꽁초 다음 4 분ning이 400ppm 이하로 떨어지면 일산화탄소가 챔버에 축적되기 시작할 수 있습니다.
8. 노출이 완료되면 펌핑 시스템을 켜두고 잔류 연기를 환기 시키십시오. 일산화탄소가 100ppm 이하로 떨어지면 실험실에서 쥐를 제거합니다. 이것은 5-10 분이 소요됩니다.
9. 쥐를 제거하고 챔버를 청소하십시오.
10. E - 담배와 실험 프로토콜의 결론에 노출 후 약 1 시간 후 꼬리 정맥에서 500 μL 혈액을 수집합니다.
11. 혈청을 분리하고 코티닌에 대한 분석을 위해 4.4 - 4.5 단계를 수행하십시오.

결과

일산화탄소 및 산소 모니터링

전자 기상 노출 동안 산소 농도는 20 % 이하로 떨어지지 않았으며 노출 동안 CO 농도는 감지되지 않았습니다. 담배 연기 노출 동안 가스 모니터는 산소 농도가 20 % 이상으로 유지됨을 나타냅니다. 일산화탄소 농도는 1,000ppm을 초과하지 않았다 ( 그림 4 ).

토론

여기에서는 설치류를 E-vapor 및 담배 연기에 제어 된 방식으로 노출시키는 챔버를 구성하는 방법을 설명합니다 ( 그림 6 ). E - 담배 챔버의 건설은 상용 노출 시스템 ^{14 , 15 , 16에} 비해 상대적으로 간단하고 저렴합니다. 챔버를 만드는 데 필요한 부품과 도구는 온라인으로 상용 공급 업체에서 쉽게 이용할 수 있습니?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
blu PLUS Rechargeable Kit	blu eCigs	N/A
1R6F Reference Cigarettes	Center for Tob Ref  Prod UK	N/A
Lexan Anesthesia Chamber 20 L	Jorgensen Laboratories	JOR265
Arduino UNO	Arduino	2877
Diode Rectifier - 1 A; 50 V	Spark Fun	COM-08589
Resistor 10 KOhm 1/6th W PTH - 20 pack	Spark Fun	COM-11508
Electrolytic Decoupling Capacitors - 100 uF/25 V	Spark Fun	COM-00096
Solderless Plug-in BreadBoard	BusBoard Prototype Systems	BB400
Alligator-Clip Wires	BusBoard Prototype Systems	CA-M-20
ZipWire	BusBoard Prototype Systems	ZW-MM-10
Standard Fan 80 ST2	Cooler Master	R4-S8R-20AK-GP
ARIC 4" adjustable vent	Bestlouver	N/A
ToxiPro  Carbon Monoxide (CO) Monitor	Honeywell Analytics	54-00-10316
ToxiPro Oxygen (O2) Monitor	Honeywell Analytics	54-45-90-VD
ToxiPro IQ Express Docking Station	Honeywell/Sperian Biosystems	54-46-9100
Command Wall Hook Small Wire 6-Pack	3M	N/A
Micro Water/Air Pump	Xiamen Conjoin Electronics	CJWP40-A12A1
1/4" Silicon Tubing	NewAge	2801470-100
T Connector	Bel-Art Scienceware	F196060000
Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA	Becton, Dickinson and Company	367841
Cotinine ELISA kit	Calbiotech	CO096D