Comparer les effets de la vapeur de cigarette électronique et de la fumée de cigarette dans un roman<em&gt; In vivo</em&gt; Système d&#39;exposition

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour exposer les rongeurs à la vapeur de cigarette électronique (vapeur d'E) et à la fumée de cigarette. Les chambres d'exposition sont construites en modifiant les chambres d'anesthésie avec un système automatisé de pompage qui délivre des vapeurs d'E ou de la fumée de cigarette aux rongeurs. Ce système peut être facilement modifié pour tenir compte de nombreux points d'extrémité expérimentaux.

Résumé

Les cigarettes électroniques ( cigarettes électroniques ) sont largement utilisées et connaissent de plus en plus de popularité. On estime que plus de 9 millions d'adultes les utilisent régulièrement. Les effets négatifs potentiels pour la santé de l'exposition électronique à la vapeur de cigarette (E-vapeur) sont mal définis. Alors que plusieurs modèles animaux d' exposition à l' E- vapeur ont été développés, quelques modèles exposent les rongeurs à des quantités cliniquement pertinentes de nicotine et font des comparaisons directes avec la fumée de cigarette dans le même système d'exposition. Ici, nous présentons une méthode pour la construction et l'exploitation d'une chambre à vapeur E et d'une chambre de fumée de cigarette. Les chambres sont construites en équipant des chambres d'anesthésie avec un système de pompage commandé par ordinateur qui fournit des quantités constantes de ELa vapeur ou la fumée de cigarette pour les rongeurs. L'exposition à la nicotine est mesurée indirectement en quantifiant les niveaux de cotinine sériques pré et post-exposition. Ce système d'exposition peut être modifié pour s'adapter à divers types de cigarettes E- et cigarettes à tabac et peut Être utilisé pour comparer les effets de l' E- vapeur et de la fumée de cigarette in vivo .

Introduction

Depuis l'entrée sur le marché américain en 2004, les cigarettes électroniques (E-cigarettes) se sont développées dans une industrie de milliards de dollars, et on estime que près de 9 millions d'adultes les utilisent régulièrement ¹ . En 2014 et 2015, plus d'étudiants du secondaire avaient utilisé des cigarettes électroniques que des cigarettes classiques ² . Le nombre croissant d'utilisateurs de cigarettes électroniques a engendré un effort de recherche pour évaluer leurs effets négatifs potentiels sur la santé.

Les cigarettes électroniques engendrent une vapeur (doublée de "E-vapor") en chauffant une solution visqueuse qui contient typiquement un mélange d'eau, de polyéthylèneglycol ou de glycérine végétale, de nicotine et d'arômes ^{3 , 4} . Il a été démontré que la vapeur d'eau contient plusieurs composés nocifs, y compris les espèces d'oxygène réactif (ROS), la nicotine, les aldéhydes divers et les hydrocarbures aromatiques polycycliques ^{5 ,}6. Beaucoup de ces composés sont formés lors du processus de vaporisation du liquide E avant l'inhalation ⁷ . Notamment, plusieurs de ces composés nocifs sont également présents dans la fumée de cigarette, ce qui soulève l'inquiétude que l'utilisation de cigarettes électroniques peut avoir des conséquences néfastes similaires sur la santé ⁷ .

Il y a peu de consensus sur les effets sur la santé des cigarettes électroniques. Pour remédier à cela, plusieurs modèles animaux d'exposition à la vapeur d'E ont été développés ( tableau 1 ). Ces modèles utilisent une variété de méthodes telles que l'exposition à l'E-vapeur du corps entier et la ventilation mécanique. Alors que les modèles actuels ont fourni des données perspicaces, peu font des comparaisons directes avec la fumée de cigarette dans le même système d'exposition ( tableau 1 ). En outre, bien que plusieurs études sur les humains aient montré que les consommateurs de cigarettes électroniques et les fumeurs de cigarettes avaient des taux de cotinine sériques entre 30 et 200 ng / mL, de nombreux modèles d'exposition à la vapeur d'E et de la fumée de cigarette tombentIde cette gamme ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12} .

Nous présentons ici une méthode pour comparer les effets de la fumée de cigarette et de l'exposition à la vapeur d'E in vivo qui donne des taux de cotinine sériques similaires aux études chez l'homme.

Protocole

Le protocole suivant a été effectué sous la direction et l'approbation du Comité d'aide et d'aide aux animaux institutionnels de l'Université du Michigan (IACUC).

1. Ensemble électronique de la chambre de la cigarette-vapeur

REMARQUE: La chambre complète doit être placée dans une hotte pendant l'utilisation. La chambre ici était logée dans un environnement de laboratoire contrôlé par la température et filtré. Les enquêteurs peuvent choisir de surveiller ces aspects du système afin d'assurer la cohérence de la qualité de l'air ambiant. En option, le recouvrement des moniteurs avec une cage en métal peut empêcher la manipulation des rongeurs tout en permettant aux moniteurs d'échantillonner l'environnement intérieur de la chambre.

1. Acquérir une chambre d'anesthésie avec couvercle amovible étanche à l'air avec un volume de 20 L.
2. À l'aide d'une scie à gabarit équipée d'une lame appropriée pour couper le matériau, couper un trou de 10,2 cm de diamètre dans le couvercle de la chambre à environ 7,6 cm du bord arrière de lachambre.
3. Insérez l'évent réglable dans le trou et montez-le avec un adhésif de calfeutrage.
   REMARQUE: Assurez-vous que le calfeutrage adhésif n'est pas accessible aux rongeurs dans la chambre, car ils peuvent mâcher le calfeutrage. Pour éviter ce problème possible, appliquez le calfeutrage à l'extérieur du mur de la chambre pour monter l'évent.
4. Coupez les tubes en silicone dans deux segments de 15 cm, et fixez les extrémités de chaque côté d'un connecteur en T.
   REMARQUE: Les tubes en silicone ont le potentiel de réagir avec certains composants de la vapeur d'eau ou de la fumée de cigarette. Ainsi, les enquêteurs peuvent envisager d'utiliser des tubes non réactifs.
5. Enfilez les deux tubes de silicone à travers des trous pré-prématurés près de l'avant du couvercle de la chambre de sorte que le connecteur en T soit à l'intérieur de la chambre. Assurez-vous que le tube est fixé sur le couvercle avec un calfeutrage adhésif ou un ruban électrique.
6. Connectez les extrémités libres du tube en silicone aux extrémités de sortie de deux micro-pompes à air. Les pompes doivent être montées sur le couvercle de la chambre avec double-Sur le ruban adhésif ou le calfeutrage.
   REMARQUE: la longueur de la tubulure connectée à l'extrémité de sortie de la pompe devrait être courte pour limiter la quantité de collecte de vapeur sur la surface intérieure du tube pendant son utilisation.
7. Avec un nouveau tube en silicone, attachez une extrémité au côté d'entrée d'une des pompes à air (pompe A de la figure 1 ) et coupez ce tube à environ 4 cm de longueur. C'est là que la cigarette électronique sera insérée pendant l'utilisation de la chambre. Assurez-vous que le diamètre du tube permet un ajustement serré autour de la fin de l'e-cig.
8. Avec un nouveau tube en silicone, attachez une extrémité au côté d'entrée de l'autre pompe à air (pompe B de la figure 1 ). Cette pompe introduira l'air ambiant dans la chambre. En tant que tel, la fin du tube doit être placée à l'extérieur de la hotte aspirante. La longueur de ce tube n'est pas critique, mais devrait être aussi courte que possible pour limiter la résistance au flux d'air.
9. À l'intérieur de la chambre, fixez deux petits crochets avec un adhésif double face pour maintenir l'oxygèneEn mono et monoxyde de carbone.

Figure 1. Schéma de la chambre électronique de la cigarette-vapeur.
La chambre est logée dans une hotte aspirante (non représentée). La pompe à air ambiante (pompe B) introduit l'air ambiant de l'extérieur de la hotte dans la chambre en continu à 2 L / min. La pompe E-cig (pompe A) gonfle 133 ml de vapeur d'eau en 4 s, avec un intervalle de repos de 30 s. E-vapeur et mélange d'air ambiant avant d'être pompé dans la chambre. Les moniteurs de gaz mesurent continuellement les concentrations de monoxyde de carbone (CO) et d'oxygène (O ₂ ) dans la chambre. La vapeur d'eau est épuisée passivement par l'évent dans la hotte aspirante. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

2. Ensemble de chambre à fumée de cigarette

REMARQUE: Pratiquement toute marque oLa cigarette peut être utilisée avec ce système, mais les cigarettes de recherche standardisées telles que la cigarette de recherche 1R6F de l'Université du Kentucky sont rentables, fiables et les meilleures pour cette application.

1. Suivez les étapes 1.1 à 1.6, et étape 1.9.
2. Avec un nouveau tube en silicone, attachez une extrémité à l'appareil d'éclairage des cigarettes et l'autre extrémité au côté d'entrée de la pompe à air (pompe A de la figure 2 ). Le dispositif d'éclairage des cigarettes doit être placé à l'intérieur de la hotte et à l'extérieur de la chambre pendant l'utilisation.
   Remarque: La construction du dispositif d'éclairage des cigarettes nécessite une connaissance de la fabrication du métal et de l'électrotechnique. Bien qu'un guide étape par étape sur la construction ne soit pas donné ici, voir les documents supplémentaires pour les plans.
3. Avec un nouveau tube en silicone, attachez une extrémité à l'autre pompe à air (pompe B de la figure 2 ). Cette pompe introduira l'air ambiant dans la chambre, de sorte que la fin du tube doit être placée à l'extérieur de la hotte aspirante. >
4. Couper plusieurs fentes verticales de 5 mm de largeur dans la paroi avant de la chambre, et monter un ventilateur d'ordinateur à l'extérieur de la chambre afin qu'il recouvre cette ouverture. Assurez-vous que l'avant du ventilateur est tourné vers la chambre de sorte que le ventilateur enfonce l'air dans la chambre à travers cette ouverture.

Figure 2. Schéma de la chambre de fumée de cigarette.
La pompe à air ambiante (pompe B) introduit l'air ambiant de l'extérieur de la hotte dans la chambre en continu à 2 L / min. La pompe A s'inspire d'une cigarette allumée pendant 40 s avec une vitesse de 2 L / min et 20 s plus tard, le ventilateur de l'ordinateur évacue la chambre pendant 3 min. La fumée et le mélange d'air ambiant avant d'être pompés dans la chambre. Les moniteurs de gaz mesurent continuellement les concentrations de la monoxyde de carbone (CO) et de l'oxygène (O ₂ ). La fumée est épuisée par l'évacuation dans la hotte aspirante.Ftp_upload / 55672 / 55672fig2large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

3. Assemblage et logiciel du microcontrôleur

1. Contrôler le système de pompage de la chambre de vapeur E-cigarette et de la fumée de cigarette par des microcontrôleurs séparés. Téléchargez le logiciel du microcontrôleur et téléchargez les codes d'exploitation fournis dans les matériels complémentaires . Le code électronique de la vapeur de cigarette exécutera la pompe à air ambiante en continu et activera la pompe à cigarette électronique pendant 4 s de durée toutes les 30 s. Le code de la fumée de cigarette exécutera la pompe à air ambiante en continu, activer la pompe à cigarettes pendant 40 s, et activer le ventilateur 20 s après l'arrêt de la pompe à cigarette. Le ventilateur s'éteindra après avoir couru pendant 3 min.
   Remarque: La synchronisation des pompes et du ventilateur peut être ajustée au besoin. Instructions du fabricant de référence sur la façon de télécharger les codes pertinents sur le microcontrôleur.
2. AssembLe microcontrôleur, connectez les fils zip, les diodes, les résistances et les condensateurs à la planche à pain, comme indiqué sur la figure 3, et fixez les fils d'alligator-clip aux pompes à air correspondantes (et ventilateur d'ordinateur pour chambre de fumée de cigarette). Entreposer le microcontrôleur à l'extérieur de la hotte aspirante si possible.

Figure 3. Schéma du microcontrôleur.
Schéma de microcontrôleur et panneaux de pain pour fonctionner le temps des pompes à air et du ventilateur. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

4. Animaux

1. Utiliser des rats adultes pesant 450 à 520 g.
2. Rats en groupe selon le type d'exposition ( p. Ex. , Cigarette électronique, fumée de cigarette, air ambiant pompé dans la chambre).
3. À cette époque prPar rapport à l'exposition, collecter 500 μL de sang dans des tubes revêtus d'EDTA de la veine de la queue en utilisant une seringue pour mesurer la concentration initiale de la cotinine sérique.
4. Faire tourner les échantillons de sang à 20 000 xg pendant 30 min à 4 ° C et collecter le sérum. Assurez-vous que les échantillons sont refroidis sur glace tout au long de ce processus.
5. Suivant le protocole du fabricant, dosage de la cotinine dans les échantillons de sérum recueillis. Les échantillons peuvent également être stockés à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.

5. Fonctionnement de la chambre de cigarette électronique

1. Nettoyez l'intérieur de la chambre avec de l'éthanol à 70%, puis avec de l'eau désionisée et laissez sécher à l'air jusqu'à ce que la chambre soit complètement sèche (ou environ 30 minutes).
2. Calibrez les moniteurs de gaz et montez le moniteur entier sur le mur à l'intérieur de la chambre.
3. Placez les rats à l'intérieur de la chambre. Notez que jusqu'à trois animaux peuvent être exposés simultanément.
4. Assurez-vous que la cigarette électronique est complètement chargée avec un E-liquide adéquat et insérez la cigarette EDans le tube d'entrée. Il est essentiel de s'assurer que la batterie E-cigarette et les niveaux de liquide E sont adéquats pendant toute la durée de l'exposition de 90 min.
5. Allumez les pompes à air et démarrez la minuterie.
6. Pendant l'exposition, observer les moniteurs de gaz pour s'assurer que la chambre contient> 20% O ₂ et 0 ppm CO.
   Remarque: Si les niveaux d'oxygène tombent, la chambre peut ne pas être bien ventilée ou le moniteur d'oxygène peut ne pas être correctement calibré.
7. Une fois que le temps d'exposition a atteint 90 min, retirez la cigarette électronique et continuez à faire fonctionner les pompes à gaz pour évacuer les vapeurs restantes. En outre, le haut de la chambre peut être levé pour accélérer la ventilation.
8. Une fois la vapeur dégagée, retirer les rats et nettoyer la chambre.
9. Recueillir 500 μL de sang de la veine de queue de chaque rat environ 1 heure après l'exposition à la fin du protocole expérimental.
10. Suivre les étapes 4.4 à 4.5 pour isoler le sérum et l'analyse de la cotinine.

6. Fonctionnement de la chambre de cigarette au tabac

1. Suivez les étapes 5.1 à 5.3.
2. Insérez la cigarette dans un appareil d'éclairage des cigarettes, avec la fin de la cigarette contre les éléments chauffants.
3. Allumez le dispositif d'éclairage de la cigarette jusqu'à ce que la cigarette commence à brûler (environ 5 s).
4. Une fois que la cigarette est allumée, allumez le système de pompage, démarrez la minuterie et observez la combustion des cigarettes jusqu'à environ 40 s.
5. Une fois que la cigarette a brûlé, retirez soigneusement la cigarette épuisée de l'appareil d'éclairage des cigarettes avec une pince.
6. Assurez-vous que les niveaux de CO ne dépassent pas 1000 ppm et que les niveaux de O ₂ ne tombent pas en dessous de 20%. Le temps et la durée du ventilateur informatique sont essentiels pour prévenir l'accumulation de monoxyde de carbone.
7. Après 4 minutes, éteignez le système de pompage et revenez à l'étape 6.2 jusqu'à ce que les rats soient exposés à la fumée de tabac pendant 90 minutes (ou environ 23 cigarettes).
   REMARQUE: les niveaux de monoxyde de carbone 4 min après la frappe de cigaretteNe devrait pas dépasser 400 ppm, sinon le monoxyde de carbone peut commencer à s'accumuler dans la chambre.
8. Lorsque l'exposition est terminée, continuer à laisser le système de pompage pour ventiler la fumée résiduelle. Lorsque le monoxyde de carbone tombe en dessous de 100 ppm, retirez les rats de la chambre. Cela devrait prendre de 5 à 10 min.
9. Retirer les rats et nettoyer la chambre.
10. Recueillir 500 μL de sang de la veine de la queue environ 1 h après l'exposition à la fin du protocole expérimental comme avec les cigarettes électroniques.
11. Suivre les étapes 4.4 à 4.5 pour isoler le sérum et l'analyse de la cotinine.

Résultats

Surveillance du monoxyde de carbone et de l'oxygène

Les concentrations d'oxygène ne sont pas inférieures à 20% pendant l'exposition à la vapeur d'électrons et les concentrations de CO demeurent indétectables tout au long de l'exposition. Les moniteurs de gaz pendant l'exposition à la fumée de cigarette ont indiqué que la concentration d'oxygène était restée supérieure à 20%. Les concentr...

Discussion

Nous décrivons ici une méthode pour construire des chambres qui exposent les rongeurs à la vapeur d'E et à la fumée de cigarette de manière contrôlée ( figure 6 ). La construction de la chambre E-cigarette est relativement simple et peu coûteuse par rapport aux systèmes d'exposition commerciale ^{14 , 15 , 16} . Les pièces et les outils nécessaires à la construction de la chambre sont facileme...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
blu PLUS Rechargeable Kit	blu eCigs	N/A
1R6F Reference Cigarettes	Center for Tob Ref  Prod UK	N/A
Lexan Anesthesia Chamber 20 L	Jorgensen Laboratories	JOR265
Arduino UNO	Arduino	2877
Diode Rectifier - 1 A; 50 V	Spark Fun	COM-08589
Resistor 10 KOhm 1/6th W PTH - 20 pack	Spark Fun	COM-11508
Electrolytic Decoupling Capacitors - 100 uF/25 V	Spark Fun	COM-00096
Solderless Plug-in BreadBoard	BusBoard Prototype Systems	BB400
Alligator-Clip Wires	BusBoard Prototype Systems	CA-M-20
ZipWire	BusBoard Prototype Systems	ZW-MM-10
Standard Fan 80 ST2	Cooler Master	R4-S8R-20AK-GP
ARIC 4" adjustable vent	Bestlouver	N/A
ToxiPro  Carbon Monoxide (CO) Monitor	Honeywell Analytics	54-00-10316
ToxiPro Oxygen (O2) Monitor	Honeywell Analytics	54-45-90-VD
ToxiPro IQ Express Docking Station	Honeywell/Sperian Biosystems	54-46-9100
Command Wall Hook Small Wire 6-Pack	3M	N/A
Micro Water/Air Pump	Xiamen Conjoin Electronics	CJWP40-A12A1
1/4" Silicon Tubing	NewAge	2801470-100
T Connector	Bel-Art Scienceware	F196060000
Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA	Becton, Dickinson and Company	367841
Cotinine ELISA kit	Calbiotech	CO096D