Сравнение эффектов электронного сигаретного пара и сигаретного дыма в романе<em&gt; In Vivo</em&gt; Система экспозиции

Резюме

Этот протокол описывает метод воздействия на грызунов электронных сигаретных паров (пары E) и сигаретного дыма. Камеры для экспозиции создаются путем модификации камер анестезии автоматизированной насосной системой, которая доставляет грызунам пары E или папиросный дым. Эта система может быть легко модифицирована для учета множества экспериментальных конечных точек.

Аннотация

Электронные сигареты (E- cigarettes ) широко используются и растут в популярности. По оценкам, более 9 миллионов взрослых регулярно их используют. Потенциальные неблагоприятные последствия воздействия паров электронных сигарет (пар E) плохо определены. В то время как было разработано несколько моделей животных, подверженных воздействию паров Е , несколько моделей выставляют грызунов для клинически значимых количеств никотина и проводят прямые сравнения с сигаретным дымом в рамках одной и той же системы экспозиции. Здесь мы представляем способ конструирования и эксплуатации камеры E - паров и камеры сигаретного дыма. Камеры изготавливаются путем оснащения камер анестезии компьютеризированной насосной системой, которая обеспечивает постоянное количество EIz: 14px; "> - пар или сигаретный дым для грызунов. Экспозиция никотина измеряется косвенно путем количественного определения уровней котинина до и после воздействия сыворотки. Эта система экспозиции может быть модифицирована для размещения различных типов электронных сигарет и табачных сигарет, а также может Использоваться для сравнения эффектов E - паров и сигаретного дыма in vivo .

Введение

С момента выхода на американский рынок в 2004 году электронные сигареты (электронные сигареты) расширились до миллиардной индустрии, и, по оценкам, почти 9 миллионов взрослых регулярно их используют ¹ . В 2014 и 2015 годах более старшеклассники использовали электронные сигареты, чем обычные сигареты ² . Растущее число пользователей электронных сигарет порождает исследовательские усилия для оценки их потенциальных неблагоприятных последствий для здоровья.

Электронные сигареты генерируют пар (называемый «пар E») путем нагревания вязкого раствора, который обычно содержит смесь воды, полиэтиленгликоля или растительного глицерина, никотина и ароматизаторов ^{3 , 4} . Было показано, что пары E содержат несколько вредных соединений, включая реакционноспособные виды кислорода (ROS), никотин, различные альдегиды и полициклические ароматические углеводороды ^{5 ,}6. Многие из этих соединений образуются в процессе испарения Э-жидкости до ингаляции ⁷ . Примечательно, что некоторые из этих вредных соединений также присутствуют в сигаретном дыме, что вызывает опасения, что использование электронных сигарет может иметь подобные неблагоприятные последствия для здоровья ⁷ .

Существует мало консенсуса в отношении воздействия на здоровье электронных сигарет. Для решения этой проблемы было разработано несколько моделей животных, подверженных воздействию пара паров ( Таблица 1 ). В этих моделях применяется целый ряд методов, таких как воздействие всего тела на пары паров и механическая вентиляция. Хотя в нынешних моделях представлены проницательные данные, лишь немногие проводят прямые сравнения с сигаретным дымом в рамках одной и той же системы экспонирования ( таблица 1 ). Кроме того, в то время как в нескольких исследованиях на людях было показано, что потребители электронных сигарет и курильщики сигарет имеют уровни котинина в сыворотке от 30 до 200 нг / мл, многие модели паров E-сигарет и сигаретного дыма выпадаютЭтот диапазон ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12} .

Здесь мы представляем метод для сравнения эффектов сигаретного дыма и воздействия паров в естественных условиях in vivo, который дает уровни котинина в сыворотке, аналогичные исследованиям на людях.

протокол

Следующий протокол был выполнен под руководством и одобрением Комитета Мичиганского Института по уходу и использованию животных (IACUC).

1. Электронная камера для сигаретно-паровой камеры

ПРИМЕЧАНИЕ. Полная камера должна быть помещена в вытяжной шкаф во время использования. Камера помещалась в лабораторную среду с контролируемой температурой и фильтрованием. Исследователи могут выбрать мониторинг таких аспектов системы, чтобы обеспечить постоянство качества воздуха в помещении. В качестве опции покрытие мониторов металлической клеткой может предотвратить вмешательство грызунов, позволяя мониторам пробовать внутреннюю камеру.

1. Приобретите камеру анестезии с воздухонепроницаемой съемной крышкой объемом 20 л.
2. Используя зажимную пилу, оснащенную лезвием, подходящим для разрезания материала, вырезать отверстие в отверстии в камере камеры диаметром 10,2 см примерно на 7,6 см от заднего краякамера.
3. Вставьте регулируемое отверстие в отверстие и установите на место с помощью любого клея-герметика.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Убедитесь, что клейкая замазка недоступна для грызунов в камере, так как они могут жевать затыкание. Чтобы предотвратить эту возможную проблему, нанесите герметик на внешнюю сторону стенки камеры, чтобы смонтировать вентиляционное отверстие.
4. Отрежьте силиконовые трубки в два сегмента по 15 см и прикрепите их к каждой стороне Т-образного соединителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Силиконовые трубки могут взаимодействовать с некоторыми компонентами электронного пара или сигаретного дыма. Таким образом, исследователи могут рассмотреть возможность использования нереактивных труб.
5. Пропустите обе силиконовые трубки через отверстия в передней части крышки камеры, чтобы Т-образный соединитель находился внутри камеры. Убедитесь, что трубка закреплена на крышке с помощью клея или герметика.
6. Соедините свободные концы силиконовой трубки с выходными концами двух микронасосов. Насосы должны быть установлены на крышке камеры с двойным уплотнением,Односторонняя клейкая лента или конопатить.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Длина трубки, подключенной к выходному концу насоса, должна быть короткой, чтобы ограничить количество сбора паров на внутренней поверхности трубы во время использования.
7. С новой силиконовой трубкой присоедините один конец к входной стороне одного из воздушных насосов (насос А на рис. 1 ) и отрежьте эту трубку примерно до 4 см в длину. Это - то, где электронная сигарета будет вставлена ​​во время использования камеры. Убедитесь, что диаметр трубки позволяет плотно прилегать к кончику электронной сигареты.
8. С новой силиконовой трубкой присоедините один конец к входной стороне другого воздушного насоса (Насос B на рисунке 1 ). Этот насос подает комнатный воздух в камеру. Таким образом, конец трубки должен быть расположен вне вытяжного колпака. Длина этой трубки не критична, но должна быть как можно меньше, чтобы ограничить сопротивление воздушного потока.
9. Внутри камеры прикрепите два небольших крючка с двухсторонним клеем для хранения кислородаEn и газовые мониторы окиси углерода.

Рисунок 1. Схема электронной сигаретно-паровой камеры.
Камера размещена в вытяжном шкафу (не показан). Комнатный воздушный насос (Насос B) подает комнатный воздух снаружи вытяжного шкафа в камеру непрерывно со скоростью 2 л / мин. Насос E-cig (Насос A) продувает 133 мл E-пара в течение 4 с с интервалом покоя 30 секунд. Е-пары и воздушная смесь в помещении перед закачкой в ​​камеру. Газовые мониторы непрерывно измеряют концентрации моноксида углерода (CO) и кислорода (O ₂ ) внутри камеры. E-пар пассивно истощается через вентиляционное отверстие в вытяжном шкафу. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Сборка дымовой камеры сигареты

ПРИМЕЧАНИЕ. Фактически любая марка oF сигарета может использоваться с этой системой, однако стандартизированные исследовательские сигареты, такие как Исследовательская сигарета 1P6F Университета Кентукки, являются экономически эффективными, надежными и лучшими для этого применения.

1. Выполните шаги с 1.1 по 1.6 и шаг 1.9.
2. С новой силиконовой трубкой присоедините один конец к устройству освещения сигарет, а другой конец - к стороне входа воздушного насоса (насос А на рисунке 2 ). Прикуриватель должен быть помещен в вытяжной шкаф и вне камеры во время использования.
   Примечание: Конструкция устройства для освещения сигарет требует знания технологии изготовления металла и электротехники. Хотя пошаговое руководство по строительству здесь не приводится, см. Дополнительные материалы для планов.
3. С новой силиконовой трубкой присоедините один конец к другому воздушному насосу (Насос B на рисунке 2 ). Этот насос подает комнатный воздух в камеру, таким образом конец трубы должен быть помещен вне вытяжного колпака. >
4. Вырежьте несколько вертикальных прорезей шириной 5 мм в передней стенке камеры и установите компьютерный вентилятор снаружи камеры так, чтобы он закрывал это отверстие. Убедитесь, что передняя часть вентилятора обращена к камере так, чтобы вентилятор вдувал воздух в камеру через это отверстие.

Рисунок 2. Схема сигаретно-дымовой камеры.
Комнатный воздушный насос (Насос B) подает комнатный воздух снаружи вытяжного шкафа в камеру непрерывно со скоростью 2 л / мин. Насос A притягивает зажженную сигарету в течение 40 секунд со скоростью 2 л / мин, а через 20 секунд компьютерный вентилятор эвакуирует камеру в течение 3 минут. Смесь дыма и воздуха в помещении перед закачкой в ​​камеру. Газовые мониторы непрерывно измеряют концентрацию в камере окиси углерода (CO) и кислорода (O ₂ ). Дым выдыхается через вентиляционное отверстие в вытяжной шкаф.Ftp_upload / 55672 / 55672fig2large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Сборка и программное обеспечение микроконтроллера

1. Контролировать систему откачки паров и сигаретной дымовой камеры E-cigarette отдельными микроконтроллерами. Загрузите программное обеспечение микроконтроллера и загрузите рабочие коды, приведенные в дополнительных материалах S. Электронный код пачки сигарет будет непрерывно запускать комнатный воздушный насос и активировать E-сигаретный насос в течение 4 с каждые 30 секунд. Код дыма от сигареты будет постоянно запускать воздушный насос помещения, активировать сигаретный насос на 40 секунд и активировать вентилятор компьютера через 20 секунд после остановки сигаретного насоса. Вентилятор отключится после работы в течение 3 мин.
   Примечание: Время срабатывания насосов и вентилятора можно отрегулировать по мере необходимости. Ссылочные инструкции изготовителя о том, как загрузить соответствующие коды в микроконтроллер.
2. Для сборкиПодключите проводы к зажимам, диоды, резисторы и конденсаторы на хлебную доску, как показано на рисунке 3, и присоедините провода крокодила к соответствующим воздушным насосам (и вентилятор компьютера для камеры дымовых сигарет). По возможности, разместите микроконтроллер вне вытяжного колпака.

Рисунок 3. Схема микроконтроллера.
Схема микроконтроллера и хлебной доски для работы таймеров воздушных насосов и вентиляторов. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Животные

1. Взрослые крысы весом 450 - 520 г.
2. Групповые крысы в ​​зависимости от типа воздействия ( например , электронная сигарета, сигаретный дым, комнатный воздух, закачанный в камеру).
3. На этот раз prВ целях облучения собрать 500 мкл крови в пробирках с покрытием ЭДТА из хвостовой вены с использованием шприца для измерения концентрации котинина в сыворотке в сыворотке крови.
4. Отбирать образцы крови при 20 000 мкг в течение 30 мин при 4 ° С и собирать сыворотку. Убедитесь, что пробы охлаждают на льду в течение всего этого процесса.
5. В соответствии с протоколом производителя, анализ на котинин в образцах сыворотки собран. Образцы также могут храниться при -80 ˚C для последующего использования.

5. Управление электронной сигаретной камерой

1. Очистите внутреннюю часть камеры 70% -ным этанолом, затем деионизированной водой и дайте высохнуть на воздухе, пока камера полностью не высохнет (или около 30 мин).
2. Откалибруйте газовые мониторы и смонтируйте весь монитор на стене внутри камеры.
3. Поместите крыс внутрь камеры. Обратите внимание, что одновременно можно выставлять до трех животных.
4. Убедитесь, что электронная сигарета полностью заряжена адекватной электронной жидкостью и вставьте электронную сигаретуВо входную трубку. Крайне важно обеспечить адекватность уровней заряда E-cigarette и уровня E-жидкости в течение 90-минутной экспозиции.
5. Включите воздушные насосы и включите таймер.
6. Во время экспозиции наблюдайте за газовыми мониторами, чтобы убедиться, что в камере содержится> 20% O ₂ и 0 ppm CO.
   Примечание. Если уровень кислорода падает, камера может быть плохо вентилируема или кислородный монитор не может быть соответствующим образом откалиброван.
7. Как только время экспозиции достигнет 90 минут, снимите электронную сигарету и продолжайте работу газовых насосов, чтобы выпустить оставшийся пар. Кроме того, верхняя часть камеры может быть поднята для ускорения вентиляции.
8. Как только пар очистится, снимите крыс и очистите камеру.
9. Соберите 500 мкл крови из хвостовой вены от каждой крысы примерно через 1 ч после воздействия при завершении экспериментального протокола.
10. Выполните шаги 4.4 - 4.5 для выделения сыворотки и анализа на котинин.

6. Управление камерой сигареты с табаком

1. Выполните шаги 5.1 - 5.3.
2. Вставьте сигарету в сигаретное осветительное устройство с концом сигареты о нагревательные элементы.
3. Включите устройство освещения сигарет до тех пор, пока окурок не начнет тлеть (около 5 с).
4. Как только сигарета зажигается, включите насосную систему, запустите таймер и дождитесь окончания горения сигареты (около 40 с).
5. Как только сигарета сожжена, осторожно выньте использованную сигарету из сигаретного осветительного прибора пинцетом.
6. Убедитесь, что уровни CO не превышают 1000 ppm, а уровни O ₂ не опускаются ниже 20%. Время и длительность вентилятора компьютера имеют решающее значение для предотвращения накопления оксида углерода.
7. Через 4 минуты выключите насосную систему и вернитесь к шагу 6.2, пока крысы не будут подвергнуты воздействию табачного дыма в течение 90 минут (или приблизительно 23 сигареты).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Уровни моноксида углерода через 4 мин после сигаретного бораNing должен опускаться ниже 400 ppm, иначе оксид углерода может начать накапливаться в камере.
8. Когда экспозиция будет завершена, продолжайте оставлять систему накачки, чтобы проветрить остаточный дым. Когда угарный газ падает ниже 100 ppm, удаляют крыс из камеры. Это займет 5-10 минут.
9. Снимите крыс и очистите камеру.
10. Соберите 500 мкл крови из хвостовой вены примерно через 1 ч после облучения при завершении экспериментального протокола, как и в случае с E-сигаретами.
11. Выполните шаги 4.4 - 4.5 для выделения сыворотки и анализа на котинин.

Результаты

Мониторинг окиси углерода и кислорода

Концентрация кислорода не падала ниже 20% во время воздействия пара паром, а концентрация СО оставалась не поддающейся обнаружению в течение всей экспозиции. Газовые мониторы во время воздействия с...

Обсуждение

Здесь мы описываем способ построения камер, которые контролируют грызунов с помощью паров и сигаретного дыма ( рис. 6 ). Конструкция камеры для электронной сигареты относительно проста и недорога по сравнению с коммерческими системами экспозиции ^{14 ,}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
blu PLUS Rechargeable Kit	blu eCigs	N/A
1R6F Reference Cigarettes	Center for Tob Ref  Prod UK	N/A
Lexan Anesthesia Chamber 20 L	Jorgensen Laboratories	JOR265
Arduino UNO	Arduino	2877
Diode Rectifier - 1 A; 50 V	Spark Fun	COM-08589
Resistor 10 KOhm 1/6th W PTH - 20 pack	Spark Fun	COM-11508
Electrolytic Decoupling Capacitors - 100 uF/25 V	Spark Fun	COM-00096
Solderless Plug-in BreadBoard	BusBoard Prototype Systems	BB400
Alligator-Clip Wires	BusBoard Prototype Systems	CA-M-20
ZipWire	BusBoard Prototype Systems	ZW-MM-10
Standard Fan 80 ST2	Cooler Master	R4-S8R-20AK-GP
ARIC 4" adjustable vent	Bestlouver	N/A
ToxiPro  Carbon Monoxide (CO) Monitor	Honeywell Analytics	54-00-10316
ToxiPro Oxygen (O2) Monitor	Honeywell Analytics	54-45-90-VD
ToxiPro IQ Express Docking Station	Honeywell/Sperian Biosystems	54-46-9100
Command Wall Hook Small Wire 6-Pack	3M	N/A
Micro Water/Air Pump	Xiamen Conjoin Electronics	CJWP40-A12A1
1/4" Silicon Tubing	NewAge	2801470-100
T Connector	Bel-Art Scienceware	F196060000
Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA	Becton, Dickinson and Company	367841
Cotinine ELISA kit	Calbiotech	CO096D