Vergleich der Effekte von elektronischen Zigarettendampf und Zigarettenrauch in einem Roman<em&gt; In vivo</em&gt; Belichtungssystem

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Nagetiere elektronischen Zigarettendampf (E-Dampf) und Zigarettenrauch auszusetzen. Die Belichtungskammern werden durch die Modifizierung von Anästhesiekammern mit einem automatisierten Pumpensystem konstruiert, das E-Dampf- oder Zigarettenrauch an Nagetiere liefert. Dieses System kann leicht modifiziert werden, um viele experimentelle Endpunkte unterzubringen.

Zusammenfassung

Elektronische Zigaretten (E- Zigaretten ) sind weit verbreitet und wachsen in der Popularität. Es wird geschätzt, dass mehr als 9 Millionen Erwachsene sie regelmäßig nutzen. Die potenziellen nachteiligen gesundheitlichen Auswirkungen der elektronischen Zigarettendampf (E-Dampf) Exposition sind schlecht definiert. Während mehrere Tiermodelle der E- Dampf-Exposition entwickelt wurden, setzen wenige Modelle Nagetiere auf klinisch relevante Mengen an Nikotin aus und machen direkte Vergleiche mit Zigarettenrauch innerhalb desselben Belichtungssystems. Hier stellen wir ein Verfahren zum Aufbau und Betrieb einer E- Dampfkammer und einer Zigarettenrauchkammer vor. Die Kammern werden durch die Ausstattung von Anästhesiekammern mit einem computergesteuerten Pumpensystem konstruiert, das gleichbleibende Mengen an E liefertIze: 14px; "> - Dampf oder Zigarettenrauch zu Nagetieren Die Nikotin-Exposition wird indirekt durch die Quantifizierung von Vor- und Nach-Expositionsserum-Cotinin-Niveaus gemessen. Dieses Belichtungssystem kann modifiziert werden, um verschiedene Arten von E- Zigaretten und Tabak-Zigaretten unterzubringen und kann Verwendet werden, um die Effekte von E- Dampf und Zigarettenrauch in vivo zu vergleichen.

Einleitung

Seit dem Eintritt in den US-Markt im Jahr 2004 haben sich elektronische Zigaretten (E-Zigaretten) in eine Milliarden-Dollar-Industrie erweitert, und es wird geschätzt, dass fast 9 Millionen Erwachsene sie regelmäßig nutzen ¹ . In 2014 und 2015 hatten mehr Gymnasiasten E-Zigaretten benutzt als herkömmliche Zigaretten ² . Die wachsende Zahl von E-Zigaretten-Nutzern hat eine Forschungsanstrengung hervorgebracht, um ihre potenziellen gesundheitlichen Auswirkungen zu bewerten.

E-Zigaretten erzeugen einen Dampf (genannt "E-Dampf") durch Erhitzen einer viskosen Lösung, die typischerweise eine Mischung aus Wasser, Polyethylenglykol oder pflanzlichem Glycerin, Nikotin und Aromen ^{3 , 4 enthält} . Es wurde gezeigt, dass E-Dampf mehrere schädliche Verbindungen enthält, einschließlich reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), Nikotin, verschiedene Aldehyde und polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe ^{5 ,}6 Viele dieser Verbindungen entstehen während des Verdampfungsprozesses von E-Flüssigkeit vor der Inhalation ⁷ . Bemerkenswert ist, dass einige dieser schädlichen Verbindungen auch in Zigarettenrauch vorhanden sind und die Besorgnis erregen, die E-Zigaretten verwenden können ähnliche gesundheitliche Folgen haben ⁷ .

Es gibt wenig Konsens über die gesundheitlichen Auswirkungen von E-Zigaretten. Um dies zu beheben, wurden mehrere Tiermodelle der E-Dampf-Exposition entwickelt ( Tabelle 1 ). Diese Modelle verwenden eine Vielzahl von Methoden wie Ganzkörper-E-Dampfbelastung und mechanische Belüftung. Während aktuelle Modelle aufschlussreiche Daten liefern, machen nur wenige Vergleiche mit Zigarettenrauch im selben Belichtungssystem ( Tabelle 1 ). Darüber hinaus, während mehrere menschliche Studien gezeigt haben E-Zigaretten Benutzer und Zigarettenraucher zu Serum-Cotinin Ebenen zwischen 30-200 ng / ml haben, viele Modelle von E-Dampf und Zigarettenrauch Exposition fallen ausIde diesen Bereich ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12} .

Hierin präsentieren wir eine Methode zum Vergleich der Effekte von Zigarettenrauch und E-Dampf-Exposition in vivo , die Serum-Cotinin-Niveaus ähnlich wie Humanstudien ergibt.

Protokoll

Das folgende Protokoll wurde unter der Anleitung und Genehmigung des University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt.

1. Elektronische Zigaretten-Dampf-Kammer-Montage

HINWEIS: Die gesamte Kammer sollte während des Gebrauchs in eine Dunstabzugshaube gestellt werden. Die Kammer hier war in einer temperaturgesteuerten und gefilterten Laborumgebung untergebracht. Die Ermittler können sich dafür entscheiden, solche Aspekte des Systems zu überwachen, um die Kohärenz der Raumluftqualität zu gewährleisten. Als Option kann die Abdeckung der Monitore mit einem Metallkäfig eine Nagetier-Manipulation verhindern, während die Monitore die Innenraumumgebung abtasten können.

1. Erwerben Sie eine Anästhesiekammer mit luftdichtem, abnehmbaren Deckel mit einem Volumen von 20 L.
2. Unter Verwendung einer Spannsäge, die mit einer Klinge ausgestattet ist, die zum Schneiden des Materials geeignet ist, schneiden Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 10,2 cm in den Deckel der Kammer von ungefähr 7,6 cm von der hinteren Kante desKammer.
3. Setzen Sie die verstellbare Entlüftung in das Loch ein und montieren Sie sie mit jedem Abdichtungsklebstoff.
   HINWEIS: Sicherstellen, dass die Klebemasse nicht für die Nagetiere in der Kammer zugänglich ist, da sie die Versiegelung kauen können. Um dieses mögliche Problem zu vermeiden, wenden Sie die Abdichtung an die Außenseite der Kammerwand an, um die Entlüftung zu montieren.
4. Schneiden Sie Silikonschlauch in zwei 15-cm-Segmente und befestigen Sie die Enden auf beiden Seiten eines T-Verbinders.
   HINWEIS: Silikonschlauch hat das Potenzial, mit einigen Komponenten von E-Dampf oder Zigarettenrauch zu reagieren. So können Forscher die Verwendung von nicht reaktiven Schläuchen in Erwägung ziehen.
5. Fädeln Sie die beiden Silikonrohre durch vorne liegende Löcher in der Nähe der Vorderseite des Kammerdeckels, so dass sich der T-Verbinder in der Kammer befindet. Achten Sie darauf, dass der Schlauch am Deckel mit Kleber oder Klebeband befestigt ist.
6. Verbinden Sie die freien Enden des Silikonschlauches mit den Ausgangsenden von zwei Mikro-Luftpumpen. Pumpen sollten am Deckel der Kammer mit Doppel-Einseitiges Klebeband oder Abdichtung.
   HINWEIS: Die Länge des Schlauches, der mit dem Ausgangsende der Pumpe verbunden ist, sollte kurz sein, um die Menge der Dampfansammlung auf der Innenseite des Rohres während des Gebrauchs zu begrenzen.
7. Mit einem neuen Silikonschlauch befestigen Sie ein Ende an der Eingangsseite einer der Luftpumpen (Pumpe A in Abbildung 1 ) und schneiden Sie dieses Rohr auf ca. 4 cm Länge. Hier wird die elektronische Zigarette während der Verwendung in der Kammer eingesetzt. Vergewissern Sie sich, dass der Durchmesser des Tubus eine angenehme Passung um das Ende des E-Cigs ermöglicht.
8. Mit einem neuen Silikonrohr befestigen Sie ein Ende mit der Eingangsseite der anderen Luftpumpe (Pumpe B in Abbildung 1 ). Diese Pumpe bringt Raumluft in die Kammer ein. Als solches muss das Ende des Rohres außerhalb der Dunstabzugshaube platziert werden. Die Länge dieses Rohres ist nicht kritisch, sollte aber so kurz wie möglich sein, um den Luftstromwiderstand zu begrenzen.
9. Innerhalb der Kammer befestigen zwei kleine Haken mit doppelseitigem Kleber, um Oxyg zu haltenEn und Kohlenmonoxid-Gasmonitoren.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der elektronischen Zigaretten-Dampfkammer.
Die Kammer ist in Abzugshaube (nicht abgebildet) untergebracht. Raumluftpumpe (Pumpe B) führt Raumluft von außerhalb der Dunstabzugshaube in die Kammer kontinuierlich bei 2 l / min ein. E-Zigarettenpumpe (Pumpe A) puffert 133 mL E-Dampf über 4 s, mit einem 30 s Restintervall. E-Dampf- und Raumluftmischung vor dem Einpumpen in die Kammer. Gasmonitoren messen kontinuierlich Kohlenmonoxid (CO) und Sauerstoff (O ₂ ) -Konzentrationen innerhalb der Kammer. E-Dampf wird passiv durch Entlüftung in Dunstabzug geschöpft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Zigaretten-Rauchkammer-Montage

HINWEIS: Nahezu jede Marke oF Zigarette kann mit diesem System verwendet werden, aber standardisierte Forschung Zigaretten wie die University of Kentucky 1R6F Research Zigarette sind kostengünstig, zuverlässig und am besten für diese Anwendung.

1. Folgen Sie den Schritten 1.1 - 1.6, & Schritt 1.9.
2. Mit einem neuen Silikonrohr befestigen Sie ein Ende an der Zigarettenbeleuchtungseinrichtung und das andere Ende der Eingangsseite der Luftpumpe (Pumpe A in Abbildung 2 ). Die Zigarettenbeleuchtungseinrichtung sollte während des Gebrauchs in die Dunstabzugshaube und außerhalb der Kammer gelegt werden.
   Hinweis: Der Bau der Zigarettenbeleuchtungsanlage erfordert Kenntnisse der Metallbearbeitung und der Elektrotechnik. Während eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Bau nicht hier gegeben wird, siehe ergänzende Materialien für Pläne.
3. Mit einem neuen Silikonschlauch ein Ende an die andere Luftpumpe anschließen (Pumpe B in Abbildung 2 ). Diese Pumpe bringt Raumluft in die Kammer ein, so dass das Ende des Rohres außerhalb der Dunstabzugshaube platziert werden muss. Aufrechtzuerhalten
4. Schneiden Sie mehrere 5 mm breite vertikale Schlitze in der Vorderwand der Kammer, und montieren Sie einen Computer-Lüfter auf der Außenseite der Kammer, so dass es diese Öffnung bedeckt. Vergewissern Sie sich, dass die Vorderseite des Lüfters der Kammer zugewandt ist, so dass der Lüfter durch diese Öffnung Luft in die Kammer bläst.

Abbildung 2. Schematische Darstellung der Zigarettenrauchkammer.
Raumluftpumpe (Pumpe B) führt Raumluft von außerhalb der Dunstabzugshaube in die Kammer kontinuierlich bei 2 l / min ein. Die Pumpe A zieht die Zigarette für 40 s mit einer Geschwindigkeit von 2 l / min und 20 s später der Computerfan evakuiert die Kammer über 3 min. Rauch- und Raumluftmischung vor dem Einpumpen in die Kammer. Gasmonitoren messen kontinuierlich Kohlenmonoxid (CO) und Sauerstoff (O ₂ ) Kammerkonzentrationen. Rauch ist durch Entlüftung in Dunstabzugshaube erschöpft.Ftp_upload / 55672 / 55672fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Mikrocontroller Montage und Software

1. Kontrollieren Sie das Pumpsystem der E-Zigaretten-Dampfkammer und der Zigarettenrauchkammer durch separate Mikrocontroller. Laden Sie die Software des Mikrocontrollers herunter und laden Sie die in den S upplementary Materials enthaltenen Betriebscodes hoch . Der elektronische Zigaretten-Dampf-Code führt die Raumluftpumpe kontinuierlich aus und aktiviert die E-Zigarettenpumpe für eine Laufzeit von 4 s alle 30 s. Der Zigarettenrauchcode läuft die Raumluftpumpe kontinuierlich, aktiviert die Zigarettenpumpe für 40 s und aktiviert den Computerlüfter 20 s nach dem Stopp der Zigarettenpumpe. Der Lüfter schaltet sich nach 3 Minuten ab.
   Hinweis: Der Zeitpunkt der Pumpen und des Ventilators kann nach Bedarf angepasst werden. Referenzhersteller Anweisungen zum Hochladen relevanter Codes an den Mikrocontroller.
2. Zu montierenLe der Mikrocontroller, verbinden Zip Drähte, Dioden, Resisters und Kondensatoren mit dem Brotbrett, wie in Abbildung 3 dargestellt, und befestigen Sie Alligator-Clip Drähte an die entsprechenden Luftpumpen (und Computer-Lüfter für Zigarettenrauchkammer). Haus der Mikrocontroller außerhalb der Dunstabzugshaube, wenn möglich.

Abbildung 3. Schematische Darstellung des Mikrocontrollers.
Schematische Darstellung von Mikrocontroller und Brotbrett zum Betrieb der Zeitmessung von Luftpumpen und Ventilator. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

4. Tiere

1. Verwenden Sie erwachsene Ratten mit einem Gewicht von 450 - 520 g.
2. Gruppenratten nach Belichtungsart ( zB elektronische Zigarette, Zigarettenrauch, Raumluft in Kammer gepumpt).
3. Zu diesem Zeitpunkt prZur Belichtung sammeln Sie 500 μl Blut in EDTA-beschichteten Röhrchen aus der Schwanzvene mit einer Spritze, um die Baseline-Serum-Cotinin-Konzentration zu messen.
4. Blutproben bei 20.000 xg für 30 min bei 4 ° C abspülen und Serum sammeln. Stellen Sie sicher, dass Proben während des gesamten Prozesses auf Eis gekühlt werden.
5. Nach dem Herstellerprotokoll wurde der Assay für Cotinin in den gesammelten Serumproben untersucht. Proben können auch bei -80 ° C für spätere Verwendung gespeichert werden.

5. Betrieb der elektronischen Zigarettenkammer

1. Reinigen Sie das Innere der Kammer mit 70% Ethanol, dann mit entionisiertem Wasser und lassen Sie die Luft trocknen, bis die Kammer vollständig trocken ist (oder etwa 30 min).
2. Kalibrieren Sie Gasmonitore und montieren Sie den gesamten Monitor an der Wand innerhalb der Kammer.
3. Legen Sie Ratten in die Kammer. Beachten Sie, dass bis zu drei Tiere gleichzeitig ausgesetzt werden können.
4. Stellen Sie sicher, dass die E-Zigarette vollständig mit ausreichend E-Flüssigkeit aufgeladen ist und legen Sie die E-Zigarette einIn das Eingangsrohr Es ist entscheidend, dass die E-Zigaretten-Batterie und die E-Flüssigkeitsspiegel während der gesamten Dauer der 90-minütigen Exposition ausreichend sind.
5. Schalten Sie die Luftpumpen ein und starten Sie den Timer.
6. Bei der Belichtung die Gasmonitore beachten, um sicherzustellen, dass die Kammer> 20% O ₂ und 0 ppm CO enthält.
   Hinweis: Wenn der Sauerstoffgehalt sinkt, kann die Kammer nicht gut belüftet sein oder der Sauerstoffmonitor darf nicht entsprechend kalibriert werden.
7. Sobald die Belichtungszeit 90 min erreicht hat, entfernen Sie die E-Zigarette und fahren Sie weiter mit den Gaspumpen, um den restlichen Dampf zu entlüften. Zusätzlich kann die Oberseite der Kammer angehoben werden, um die Belüftung zu beschleunigen.
8. Sobald der Dampf geklärt ist, entfernen Sie die Ratten und reinigen Sie die Kammer.
9. Sammle 500 μl Blut aus der Schwanzvene von jeder Ratte ca. 1 h nach der Exposition am Ende des experimentellen Protokolls.
10. Befolgen Sie die Schritte 4.4 - 4.5, um das Serum zu isolieren und auf Cotinin zu untersuchen.

6 Betrieb der Tabak-Zigarettenkammer

1. Folgen Sie den Schritten 5.1 - 5.3.
2. Setzen Sie die Zigarette in die Zigarettenbeleuchtung ein, mit dem Ende der Zigarette gegen die Heizelemente.
3. Schalte die Zigarettenbeleuchtungseinrichtung ein, bis der Zigarettenstumpf zu schwelen beginnt (ca. 5 s).
4. Sobald die Zigarette angezündet ist, schalten Sie das Pumpsystem ein, starten Sie den Timer und beobachten Sie die Zigarettenbrand bis zur Fertigstellung (ca. 40 s).
5. Sobald die Zigarette verbrannt ist, entfernen Sie vorsichtig die Zigarette aus der Zigarettenbeleuchtung mit Pinzette.
6. Stellen Sie sicher, dass die CO-Werte nicht über 1000 ppm ansteigen und die O ₂ -Stufen nicht unter 20% fallen. Computer-Ventilator-Timing und Dauer ist kritisch bei der Vermeidung von Kohlenmonoxid-Akkumulation.
7. Nach 4 min das Pumpsystem ausschalten und in Schritt 6.2 zurückkehren, bis die Ratten für 90 min (oder etwa 23 Zigaretten) dem Tabakrauch ausgesetzt sind.
   HINWEIS: Kohlenmonoxid-Niveaus 4 min nach Zigaretten-BurSollte unter 400 ppm fallen, sonst kann sich Kohlenmonoxid in der Kammer ansammeln.
8. Wenn die Belichtung abgeschlossen ist, verlassen Sie das Pumpsystem weiter, um Restrauch zu belüften. Wenn Kohlenmonoxid unter 100 ppm fällt, entfernen Sie Ratten aus der Kammer. Dies dauert 5 - 10 min.
9. Ratten entfernen und die Kammer reinigen.
10. Sammle 500 μl Blut aus der Schwanzvene ca. 1 h nach der Exposition am Ende des experimentellen Protokolls wie bei den E-Zigaretten.
11. Befolgen Sie die Schritte 4.4 - 4.5, um das Serum zu isolieren und auf Cotinin zu untersuchen.

Ergebnisse

Kohlenmonoxid und Sauerstoffüberwachung

Die Sauerstoffkonzentrationen sanken während der E-Dampf-Exposition nicht unter 20% und die CO-Konzentrationen blieben während der gesamten Exposition unauffindbar. Gasmonitoren während der Zigarettenrauchbelastung zeigten, dass die Sauerstoffkonzentration über 20% blieb. Die Kohlenmonoxidkonzentrationen betrugen nicht mehr als 1.000 ppm (Abbildung 4 ).

Diskussion

Hier beschreiben wir eine Methode zum Bau von Kammern, die Nagetiere E-Dampf und Zigarettenrauch kontrolliert aussetzen (Abbildung 6 ). Der Aufbau der E-Zigarettenkammer ist relativ einfach und kostengünstig im Vergleich zu den kommerziellen Belichtungssystemen ^{14 , 15 , 16} . Die Teile und Werkzeuge, die zum Bau der Kammer benötigt werden, sind von kommerziellen Lieferanten online verfügbar. Ebenso ist der B...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
blu PLUS Rechargeable Kit	blu eCigs	N/A
1R6F Reference Cigarettes	Center for Tob Ref  Prod UK	N/A
Lexan Anesthesia Chamber 20 L	Jorgensen Laboratories	JOR265
Arduino UNO	Arduino	2877
Diode Rectifier - 1 A; 50 V	Spark Fun	COM-08589
Resistor 10 KOhm 1/6th W PTH - 20 pack	Spark Fun	COM-11508
Electrolytic Decoupling Capacitors - 100 uF/25 V	Spark Fun	COM-00096
Solderless Plug-in BreadBoard	BusBoard Prototype Systems	BB400
Alligator-Clip Wires	BusBoard Prototype Systems	CA-M-20
ZipWire	BusBoard Prototype Systems	ZW-MM-10
Standard Fan 80 ST2	Cooler Master	R4-S8R-20AK-GP
ARIC 4" adjustable vent	Bestlouver	N/A
ToxiPro  Carbon Monoxide (CO) Monitor	Honeywell Analytics	54-00-10316
ToxiPro Oxygen (O2) Monitor	Honeywell Analytics	54-45-90-VD
ToxiPro IQ Express Docking Station	Honeywell/Sperian Biosystems	54-46-9100
Command Wall Hook Small Wire 6-Pack	3M	N/A
Micro Water/Air Pump	Xiamen Conjoin Electronics	CJWP40-A12A1
1/4" Silicon Tubing	NewAge	2801470-100
T Connector	Bel-Art Scienceware	F196060000
Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA	Becton, Dickinson and Company	367841
Cotinine ELISA kit	Calbiotech	CO096D