Oluşturma ve tartışma ve proteinler arasında farklı grup sınıflandırılması kolaylaştırmak için bir başvuru uygulama

Özet

Bu iletişim kuralının amacı farklı proteinler arasında tutarlı terminoloji ve sınıflandırma ölçütlerini yoksun bir grup için bir referans geliştirmektir. Bu başvuru analizleri ve bir bütün olarak grup tartışma kolaylaştıracak ve kurulan adlarına ek olarak kullanılabilir.

Özet

Değişik organizmaların kullanarak farklı Labs'de inceledik ilgili proteinler zor bir bütün olarak grup görüşmek üzere ve yeni diziler uygun bağlam içine yerleştirmek için yapım bir Tekdüzen adlandırma ve sistem sınıflandırma, olmayabilir. Önemli sıra özellikleri öncelik bir referans geliştirme yapısı ilgili ve/veya faaliyet kurulan adlarına ek olarak bazı tutarlılık proteinlerin farklı bir gruba eklemek için kullanılabilir. Bu kağıt sistein-sağlamlık alpha sarmalının (CS-αβ) süper nasıl elektronik tablo yazılımı içinde oluşturulan bir referans süper varolan proteinler arasındaki ilişkileri netleştirmek yanı sıra yanı sıra yeni kolaylaştırmak göstermek için örnek olarak kullanılmıştır dizileri. Ayrıca nasıl başvurusu Filogenetik analizi geçerliliğini etkileri yaygın olarak kullanılan yazılım içinde oluşturulan sıra hizalamaları iyileştirmek için yardımcı olabilir gösterir. Bir başvurusu kullanımını büyük olasılıkla takson, yeterince moleküler analiz tarafından yakalanan değil özellikleri geniş bir yelpazede üzerinden son derece ıraksak dizileri içeren protein gruplar için yardımcı olacaktır.

Giriş

Özellikleri ve diğer proteinler için ilişki onlarda protein ad. Ne yazık ki, adları genellikle bulma zamanında atanmış olan ve araştırma devam ettikçe, büyük içerik anlayışı değişebilir. Bu bir protein bağımsız olarak birden fazla laboratuvar, adlandırma veya adı atarken kesin olması düşünülen özellikleri değişiklikleri ve artık yeterince protein ayırt adı tespit edildi, birden çok adda yol açabilir diğerlerinden.

Omurgasız defensins dejenerasyon isimlendirme ve sınıflandırma içinde iyi bir örnek sağlar. İlk omurgasız defensins böcekler rapor edilmiştir ve adı "böcek defensin" dayalı algılanan homoloji memeli defensins^1,2olarak önerilmiş. Dönem defensin hala kullanılan, şimdi açık olsa bile o omurgasız ve memeli defensins paylaşmak ortak bir atası^3,4. Türe bağlı olarak, bir omurgasız "defensin" (üç ya da dört disülfür bağları oluşturan) altı ya da sekiz katıldı ve çeşitli antimikrobiyal etkinlikler olabilir. Olarak defensins her zaman "defensins," denir değil durumu, aynı özelliklere sahip proteinler Caenorhabditis remanei⁵son zamanlarda tespit cremycins gibi karmaşık için. Buna ek olarak, omurgasız büyük defensins evrimsel omurgalı β-defensins diğer omurgasız defensins⁶ile ilgili olasılığı daha yüksektir. Buna rağmen bazen adı "hangi dizileri analizleri içinde dahil edilmesi gerektiğini belirlerken defensin olarak" araştırmacılar güveniyor.

Böcek defensins ve Akrep toksinler⁷arasındaki benzerliği yapısal çalışmalar ortaya ve CS-αβ kat daha sonra böcek defensins⁸belirleyici yapısal özelliği ilan edildi. Bu kat Akrep toksin gibi (CS-αβ) süper şu anda içeren beş ailenin yapısal sınıflandırma, proteinler (yapısal) veritabanı⁹' da tanımlar: böcek defensins, kısa Zincirli Akrep toksinler, uzun zincir Akrep toksinler, MGD-1 (üzerinden bir yumuşakça) ve bitki defensins. Bu süper son zamanlarda açıklanan CIS-defensins⁴ ve süper 3.30.30.10 CATH/genetik 3D veritabanı^10,11' deki yönergeleri ile eş anlamlıdır. Omurgasız takson, bitki ve mantarlar Haritayı bu kat içeren proteinler adlarını açıkça sistein numarası veya bağ desen, antimikrobiyal aktivite veya fiziksel özellikleri¹²ilişkili değil çeşitli çalışmalardan.

Tutarlılık ve açık ölçütleri eksikliği yeniden adlandırıp yeni tanımlanan dizileri bu süper sınıflandırmak zor yapmak. Proteinler bu süper karşılaştırmak için büyük bir engel olduğunu katıldı (her sıradaki ilk sistein C1 ise) her bireysel dizisi, yapısal rol için hesap yolu ile ilgili olarak numaralandırılır. Bu yalnızca diziler aynı sayıda katıldı ile karşılaştırılabilir anlamına gelir. İşte küçük sıra koruma dışında hizalamaları ve Filogenetik analizi zor yapar CS-αβ kat şekillendirme katıldı. Yapısal özellikleri öncelik bir numaralandırma sistemini geliştirerek, üst sıraları daha kolay karşılaştırıldığında hizalanmış ve. Hızlı bir şekilde korunmuş özellikleri yanı sıra bu alt gruplar, tanımlama görselleştirildiği ve yeni diziler daha kolay uygun bağlam içine yerleştirilebilir.

Bu kağıt numaralandırma sistemi için CS-αβ süper bir başvuru oluşturmak için bir elektronik tablo yazılımı (Örneğin, Excel) kullanır. Nasıl bu dizileri arasındaki karşılaştırmaları açıklar ve tardigrades tanımlanan yeni CS-αβ diziler uygulandığı gösterir. CS-αβ süper örnek olarak kullanarak, protokol dizileri ilgi kullanırken bir kılavuz sağlamak için yazılmıştır; Ancak, o bu süper veya sistein zengini diziler özgü olmak üzere tasarlanmamıştır. Bu yöntem büyük olasılıkla bağımsız olarak farklı özellikleri araştırılmış ve/veya kolayca moleküler analiz yazılımı tarafından tanınmayabilir ayrı özelliklere sahip küçük genel sıra homoloji sahip proteinler grupları için en yararlı olacaktır. Hiçbir önemli özellikleri tespit edilmiştir Eğer sınırlı yarar olur, böylece bu yöntem önemli özellikleri, bir temanın bazı kararlar gerektirir. Birincil hedefi nasıl basit bir görsel öğe sırası ilişkilerin elde edilebilir göstermektir. Bu daha sonra dizi hizalaması ve analiz bilgilendirmek için kullanılabilir ama hizalama ve çözümleme birincil hedefleri ise, bir barkod yöntem otomasyon¹³için daha fazla kapasiteye sahip uygun bir alternatif olacaktır. 3D yapısı doğrudan görselleştirme için yararlı olmayacaktır böylece geçerli yöntem her peptid özellikleri doğrusal bir formda görüntüler.

Protokol

1. faiz Protein grup tanımlama özelliklerini belirlemek

1. bir fikir birliği grubunun bir parçası olarak kabul için gerekli olan özellikleri ile ilgili olup olmadığını belirlemek için önceki yayınları danışmak. Herhangi bir tutarsızlık veya araştırma grupları arasında görüş farklılıkları dikkate almak ve bir alt grubu diğerinden ayırt etmek için hizmet verebilir özellikleri içerir.
2. Önceki edebiyat belirleyici özellikleri gidermez, grubun temsilcisi korunmuş olan özellikleri bulmak için başlangıç noktası olarak kabul edilen dizileri kullanın.

2. İlgili serilerini toplamak

Eğer değerlendirmeleri bu yazılı
1. analizleri grubunu gösteren diziler arasında bu dizilere ham veri kümesi içerir. Literatürde başvurulan katılım sayıları kullanarak dizileri almak ve düzenleme programı standart bir sıralama kaydetmek (Örneğin, EditSeq Lasergene oda veya bir çok için kullanılabilir ücretsiz online).
2. Söz konusu grup yapısal veritabanları birinde tanımlanmışsa al dizileri veritabanında sağlanan Katılım sayıları kullanarak grup. parçası olmak olarak veritabanını listeler dizileri içerir ve bir standart sıralama düzenleme kaydedin program, yukarıdaki gibi.
   Not: Örneğin, CS-αβ (Akrep toksin gibi) süper SCOP veritabanındaki kategorize dizileri burada bulunabilir: http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/data/scop.b.h.c.h.html.
3. gerçekleştirmek temel Yerel Genel, online veritabanları literatürde dahil edilmemiş dizileri bulamadı biyoteknoloji bilgi (NCBI) için Ulusal Merkezi aracılığıyla veya yapısal hizalama arama aracı (patlama) ¹⁴ arama işlemleri veritabanları. İçin en komple sonuçlar, her iki protein patlama (blastp) kullanma ve patlama protein sorgu (tblastn) programları ile; tercüme Bu elde edilebilir vasıl her ikisi de vardır: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
   1. Bilinen sorgu sırası olarak faiz grubun parçası olmak kullanım dizileri. Ve sıra en üstündeki arama kutusuna yapıştırın veya varsa bir GenBank katılım numarası veya gi tanımlayıcı sağlamak.
   2. Veritabanı açılır menüden seçin. Gereksiz protein dizileri (nr) blastp seçin ve tblastn için sıra etiketleri dile getirdi.
   3. Arama sonuçlarında belirli özellikleri canlı organizma veya takson adı yazıp listeden seçerek ayarlama için yazarken görüntülenir. Ek organizmalar veya dışlamak için özellikleri eklemek için tıklatın " + " düğme ve başka bir alan-ecek gözükmek. İstenmeyen herhangi bir takson organizma kutusuna yazarak ve denetimi sırasında görüntülenen listeden seçerek organizma veya takson adını yazarak dışlamak " çıkar " sağ taraftaki kutuya.
   4. Erişim ek parametreler yanında tıkırtı üstünde " algoritma parametreleri " yakın: sayfanın altındaki. Bir parametrenin değiştirilmesi için bir gerekçe değilse varsayılan bırakın.
   5. Tıklama " patlama " analizi çalıştırmak için düğme; görünür sonuçlar için biraz zaman alabilir. Genel olarak, sayısı bir bekliyoruz değeri (veya e-değer) ile almak " -05 " veya daha iyi ve düzenleme programı standart bir sıralama içinde kaydedin.
      1. Tüm sayısı bu eşiğin varsa, arama (bölümündeki algoritma parametreleri) hedef sıralarının artan bir sayıyla ilgili tüm serilerini almak için yeniden çalıştırın.
4. Gerekirse, ilgisiz bilgiler (CS-αβ kat olgun peptid geçerlidir Örneğin,) dışlamak için sıralarını kırpmak. Sinyal peptidler ve pro-peptidler ProP ¹⁵ kullanarak kaldırma için tanımlamak (kullanılabilir çevrimiçi), veya SignalP daha gelişmiş sinyal peptid tahmin ¹⁶ (elde edilebilir online).

3. Bir elektronik tabloyu alan önemli özellikleri olduğunu tespit edildi üzerinde bir başvuru oluşturmak

1. Grup ilgi belirleyici özelliklerini belirlemek. Örneğin, A Phormia terraenovae ( şekil 1) ⁸ defensin böcek çözüm yapısını tarafından kesin olarak kurulan CS-αβ kat kullanın.
   1. Bu kat içeren sistein-sağlamlık helix (CSH) ¹⁷ denilen daha küçük bir motif; bu motifi (X nerede herhangi bir amino asit) CXXXC tarafından tanımlamak iki disülfür bağları oluşturmak bir CXC, ters yönde ( Resim 1 , sağlam pembe çizgiler).
      Not: CS-αβ motifi tamamlamak için üçüncü bir disülfür bağ üzerinden ek katıldı CSH motifi ( şekil 1,) pembe çizgiler noktalı her yarı önce yerleştirilir oluşur.
2. Bunlar bir elektronik tabloya özellikleri tanımlama girin. Bkz: Şekil 2.
   1. Kullanım sütunları korunmuş özellikleri ve bu özellikler arasında boşluk göstermek için. Sütun numaraları uygun ve tutarlı bir genişliğe sahip olduğunuzdan emin olmak için geniş tutun. Genişliği kullanarak " Format | Sütun genişliğini " işlev ( Şekil 2, pembe ok).
   2. Satırları için sıra adlar kullanın.
   Ne zaman belgili tanımlık şekil, bir sıra vardır
   3. dolgu ( Şekil 2, pembe kare) işleviyle kutusuna doldurun. Özellikler arasındaki boşluğu için amino asitler kutusunda girin ve doldurulmamış bırakın. Örneğin, sıra defensin böcek kullanarak tanımlanmış aralıkları ve C5 ve C6 C2 C3 arasında ile altı katıldı içerir bir referans verir.
3. Daha önce kurulmuş temsilcisi dizileri yapısal veritabanları ve edebiyat dayalı grubunun üyeleri olarak ekleyin.
   Not: Örneğin, önceki edebiyat ve yapısal veritabanı eklenmesi için çeşitli gruplar tanımlamak: böcek defensins, kısa Zincirli Akrep toksinler, uzun zincir Akrep toksinler, MGD-1, bitki defensins, Yuvarlak solucanlar ABFs, Drosophila, drosomycins ve macins. Edebiyat da bu süper ¹⁸ atası gösterebilir sadece dört katıldı ile bakteriyel bir dizi tanımlar. Bu DNA dizileri ekleyerek katıldı altı on ref'teki sayısını artırır ama önemli yapısal özellikleri ( şekil 3) hizalamasını korur.
   1. Bir alt sıraları (örneğin, ekstra bir sistein) tanımlamak büyük olasılıkla bir özellik eklemek için kullanın " Ekle " işlev ( şekil 3, pembe ok).
   Verilen diziden eksik özellikleri doldurulmamış kutusunu boş bırakın ve aradan geçen amino asitler temsil eden kutuları ile birleştirmek varsa
   2. . Gerekirse, Birleştir ve Ortala özelliğini ( şekil 3, pembe kutu) kullanarak hücreleri birleştirme.
4. Daha büyük süper her grupta varyasyonun daha iyi bir görüntü elde etmek için devam serileri gruplara ekleme. Karşılaştırmalar ( şekil 4) kolaylaştırmak için Grup özelliklerini özetlemek.
   1. Amino asitler Başlıca özellikler arasında sayıda değişiklik gösterdiğinde, 6-12 (6-12 amino asitler) ve göstermek için eğik çizgi gibi bir aralık belirtmek için bir tire işareti kullanın / veya 7/10 (7 veya 10 amino asitler) gibi.
   2. Şekil-in uygun olmayabilir, ancak yeterince sık meydana gelmez dizileri içinde başvuru eklemek için ek açıklama eklemek için bir yol seçin. Katıldı bu süper önemli olduğundan, örneğin, ek katıldı ( şekil 4, pembe kutuları) etiket.
5. Newl Ekley-tespit dizileri için bir kılavuz olarak kurulan dizileri kullanarak elektronik tablo. Örneğin, tardigrades (sarı) dizileri ekleyerek tardigrade dizileri ( şekil 5 gösterir alan amaçlar için sıra başına bir satır yerine özetleri) süper çeşitli farklı gruplar içine düşmek gösterir.
6. Göstermek değişkenlik taksonomik grup içindeki satır ( şekil 6) yeniden düzenleyerek.

4. Rafine Amino asit hizalamaları referansı kullanın

Not: birden fazla sıra hizalamaları için kullanılan birçok program bulunmaktadır, ancak bu gösteri moleküler evrim genetik analiz (MEGA6) kullanır ¹⁹ ücretsiz indirmek kullanılabilir çünkü.

1. Yazılımı yükleyip.
2. Seçerek yeni bir uyum içinde MEGA başlamak " Düzenle/Yapı Hizalama " da Hizala sekmesini altında " yeni bir hizalama oluşturmak " kutusunda görünür ve'ı tıklatın " Tamam. " sonra seçin " Protein. "
3. Seçin " dosya eklemek serisinden " içinde " düzenleme " menü dizileri alınacak.
   Not: Dizileri MEGA içe aktarma işlemi için FASTA biçiminde olması gerekir. Arka plan renklerini yansıtan farklı amino asit türleri varsayılan olarak kullanılır, ancak bu seçenek altında devre dışı bırakılabilir " ekran " menü.
4. Tüm dizileri girildikten sonra flexing kol simgesini tıklatın ve sonra " hizalamak Protein " ²⁰ kas algoritması kullanarak dizileri hizalamak için.
   Not: İlogenetik de mevcuttur.
   1. Hiçbir şey seçili pops kadar yapılmış ve tüm, seçmek sorar bildiren tıklatırsanız " Tamam. "
   2. Not: Bu bir pencere açar bir bazı parametreleri değiştirmek izin veren, ancak yalnızca değiştirilmesi gerekir bunu yapmak için bir neden. Bu analiz bir alt kümesini bir önceki kağıt ¹² ' analiz dizileri kullanır.
5. Kontrol hizalamayı esaslı üzerinde önemli özellikleri; dizileri yukarıda üst çubuğu amino asit tamamen nerede tüm sütunları gösterir Not korunmuş (*). Bkz: Şekil 7. İlk hizalama sadece üç dört korunmuş katıldı ( Şekil 7, pembe kutuları); gösterir görmek sütun boyunca, AlCRP sırası açıkça yanlış hizalanmış ( Şekil 7, pembe ok) bakıyor.
Ben arasında geniş boşluk kurtulmak için
6. ve tireleri ve basın vurgulamak korunmuş C " Sil " anahtar. Herhangi bir amino asitler vurgulamak değil, ya da onlar-ecek var olmak silmek de.
7. Amino asitler sağa taşımak, vurgulamak ve boşluk çubuğu tuşuna basın için
   1. Not AlCRP şimdi hizalanmış yapısal katıldı vardır ve CXXXC motifi dün C hizalama ( şekil 8) korunmuş. Sıralarının en önemli özellikleri öncelik vermek için gereken hizalamayı ayarlayın.

5. Grupları tespit kullanımını filogenetik analiz sonuçları ile başvurusundan karşılaştırma

1. ön hizalamaları, hangi dizileri için küçük bir numara sıralarının; bir Filogenetik analizi dahil edilmesi gereken belirlemek için bu adımı olabilir gereksiz olacak.
   1. Tüm dizileri içeren bir hizalama dosyayı tutmak, ancak gereksiz dizileri bir Filogenetik analizi için kaldırmak ( Şekil 9, pembe kutuları Haritayı çift gereksiz dizileri).
   2. Serileri, çok sayıda veri kümesi içeriyorsa, ön analizler ve gruplardan seçin temsilcileri her zaman bir clade form.
2. En iyi amino asit ikame modeli belirlemek.
   1. Hizalama (Veri sekmesinin altında) MEGA formatında dışa.
   2. Modelleri menüsüne gidin ve seçin " bulmak en iyi DNA/Protein modeli. " az önce kaydettiğiniz dosyayı seçin ve aç; bu değiştirilebilir bazı parametreler içeren bir pencere açar.
   Onları değiştirmek için bir neden olmadığı sürece
   3. varsayılan parametrelerini kullanın. ' I tıklatın " hesaplamak " çözümlemesi'ni başlatmak için.
3. MEGA içinde maksimum olabilirlik (ML) analizler.
   1. Seç " yapı/Test maksimum olabilirlik ağaç " Phylogeny menüsünden.
   2. Model kararlı adım 5.2 veri için en uygun olmak seçin (çıkış yanı sıra en iyi oyuncu değişikliği modeli verecek " gore siteler arasında " parametre).
   3. 1.000 seçin önyükleme çoğaltır önlemleri ağaç için destek elde etmek için.
   4. Tıklama " hesaplamak " analiz; çalıştırmak için MEGA vardır bir " ağacı Explorer " ağaç görselleştirmek için.
4. MrBayes açık kaynak yazılım ²¹ ' Bayesian analizler.
   Not: MrBayes el kitabı da bu siteden kullanılabilir. Bu temel adımlar sağlamak amacıyla hazırlanmıştır ve Bayesian filogenetik analiz için kapsamlı bir rehber değil.
   1. MrBayes programın bulunduğu klasöre MEGA hizalama PAUP (Nexus) formatında verilecek.
   2. Açık MrBayes ve türü " exe dosya adı " (Örneğin, " exe Alignment.nex ").
   3. Model ve analiz parametrelerini belirtin. 5.2. adımda belirtilen her iki modeli seçin veya seçim " karışık " çeşitli modelleri denemek ayarı ve en iyi posterior olasılıklar ağaçlarıyla modelinde sıklığını rapor (prset aamodelpr = karışık). Türü " showmodel " geçerli modeli ayarlarını rapor etmek ve " mcmc yardımcı " her biri kısa bir açıklama ile geçerli parametre ayarları göstermek için.
   4. Kullanarak nesil sayısı ayarla " mcmcp ngen = " komutu (1 milyon tipik).
   5. Türü " mcmc " çözümlemesi'ni başlatmak için.
   6. , Nesil sayısı tamamlandığında daha fazla nesiller eklemek program sorar. Split Frekanslar ortalama standart sapması 0,1 daha az ise, hayır yazın. 0,1 olduğunu, analiz devam etmek için izin gerektiğini veya bazı parametreleri (el kitabına bakın) değiştirilmelidir.
   7. Kullanım " sumt " ağacı dosyaları oluşturmak için komut.
   8. Analizleri tamamlandıktan sonra bir fikir birliği ağacı oluşturulur, ağaç-ebilmek var olmak görüş içinde FigTree (elde edilebilir online).
5. Yöntemleri tutarlı sonuçlar elde görmek için ağaçlar karşılaştırın.
   Not: Bazı dizileri bir sürü bilgi sağlamaz: ağaçlar de çözülmüş olabilir onu da dallar en az destek ( şekil 10).
6. Karşılaştırmak ağaçlar başvurusu Filogenetik analizi bu gruplar destekleyip desteklemediğini görmek için kullanarak tanımlanan gruplar için.

Sonuçlar

Literatürde bildirilen CS-αβ süper serileri grupları şekil 4' te gösterilmiştir. Her sıra için numaralandırmasına bağlı sistein eşlendirme beş temel gruplar (Tablo 1, orta sütunda) öneririm. Grup 1, üç disülfür üzerinden Tahvil ve böcekler, arachnids, yumuşakçalar, nematodlar ve mantarlar dizileri içeren altı katıldı vardır. Grup 2, 3 ve 4 dört disülfür bağları oluştururlar 8 katıldı var. Grup 2 böcek, ...

Tartışmalar

Bir grup içindeki bir protein adlandırma için ölçütleri açık olmalıdır, ancak bu her zaman böyle değildir. CS-αβ kat var dizileri organizmalar çeşitli kullanarak, farklı adlandırma sistemlerinde kaynaklanan yanı sıra karakterizasyonu düzeyleri değişen birçok laboratuvarlarda inceledik. Tamamen yeni bir adlandırma kabul ettirmeye çalışırken makul değildir ve karışıklık büyük bir önceki edebiyat danışmanlık zaman neden olur. Bir başvuru sistemi numaralandırma bir protein adına ek ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BLAST webpage			https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
EditSeq (Lasergene suite)	DNASTAR		https://www.dnastar.com/t-allproducts.aspx
Excel 2013	Microsoft
FigTree			http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/
MEGA			www.megasoftware.net
MrBayes			http://mrbayes.sourceforge.net/
SCOP database			http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/