Creazione e applicazione di riferimento per facilitare la discussione e la classificazione delle proteine in un gruppo eterogeneo

Riepilogo

L'obiettivo del presente protocollo è quello di sviluppare un riferimento per le proteine divergenti in un gruppo che non dispone di criteri coerenti per la nomenclatura e classificazione. Questo riferimento faciliterà l'analisi e la discussione del gruppo nel suo complesso e può essere utilizzato in aggiunta nomi affermati.

Abstract

Proteine correlate che sono state studiate in diversi laboratori utilizzando diversi organismi potrebbero non avere un sistema uniforme di nomenclatura e classificazione, rendendo difficile per discutere il gruppo nel suo complesso e di inserire nuove sequenze nel contesto appropriato. Lo sviluppo di un riferimento che la funzionalità importante sequenza di priorità relative alla struttura e/o attività può essere utilizzata oltre a nomi affermati per aggiungere qualche coerenza a un gruppo eterogeneo di proteine. Questa carta utilizza la superfamiglia di cisteina-stabilizzato alfa-elica (CS-αβ) come un esempio per mostrare come un riferimento generato nel software di foglio di calcolo può chiarire le relazioni tra proteine esistenti nella superfamiglia, nonché facilitare l'aggiunta di nuovi sequenze. Viene inoltre illustrato come il riferimento può contribuire a perfezionare gli allineamenti di sequenza generati in software comunemente usato, che compromette la validità delle analisi filogenetiche. L'utilizzo di un riferimento sarà probabilmente più utile per i gruppi di proteine che includono sequenze altamente divergenti da un ampio spettro di taxa, con caratteristiche che non vengono adeguatamente acquisite dalle analisi molecolari.

Introduzione

Nome di una proteina dovrebbe riflettere è caratteristiche e rapporto ad altre proteine. Purtroppo, i nomi vengono generalmente assegnati al momento della scoperta e, mentre la ricerca continua, la comprensione del contesto più ampio potrebbe cambiare. Questo può portare a più nomi se una proteina è stata identificata in modo indipendente da più di un laboratorio, ai cambiamenti nella nomenclatura o nelle caratteristiche pensate per essere definitiva quando si assegna il nome e il nome non è più sufficientemente differenziando la proteina dagli altri.

Invertebrati marini defensine forniscono un buon esempio di degenerazione nella nomenclatura e classificazione. Le defensine invertebrate prime sono state segnalate dagli insetti, e il nome "insetto defensine" è stato proposto basato sull'omologia percepita a mammiferi defensine^1,2. Il termine defensine è ancora usata, anche se è ormai chiaro che defensine invertebrate e mammiferi non condividono un antenato comune^3,4. A seconda della specie, un invertebrato "defensine" può avere sei o otto cisteine (che formano tre o quattro ponti disolfuro) e una varietà di attività antimicrobica. A complicare la situazione, proteine con le stesse caratteristiche come defensine non vengono sempre chiamate "defensine," come la cremycins recentemente identificato da Caenorhabditis remanei⁵. Inoltre, defensine grande invertebrati marini sono più probabili essere evolutivamente correlato a vertebrati β-defensine rispetto a altri invertebrati defensine⁶. Nonostante questo, i ricercatori si affidano a volte il nome "defensine" quando si determina quali sequenze devono essere inclusi nelle analisi.

Gli studi strutturali hanno rivelato la somiglianza tra insetto defensine e Scorpione tossine⁷, e la piega di CS-αβ successivamente è stata stabilita come la caratteristica strutturale di defensine insetto⁸. Questo ovile definisce la superfamiglia di scorpione tossina-come (CS-αβ) nella classificazione strutturale delle proteine (SCOP) database⁹, che attualmente include cinque famiglie: insetto defensine, catena corta Scorpione tossine, tossine dello Scorpione lungo-catena, MGD-1 (da un mollusco) e pianta defensine. Questa superfamiglia è sinonima di cis-defensine recentemente descritto⁴ e superfamiglia 3.30.30.10 in CATH/Gene database 3D^10,11. Studi da una varietà di taxa di invertebrati, piante e funghi show che i nomi delle proteine che contengono questa piega non sono chiaramente correlati al numero di cisteina o modello di incollaggio, attività antimicrobica o storia evolutiva¹².

La mancanza di coerenza e criteri chiari rendono impegnativo per denominare e classificare le sequenze più recentemente identificati di questa superfamiglia. Un ostacolo importante al confronto di proteine in questa superfamiglia è che cisteine sono numerate rispetto ogni sequenza individuale (il prima cisteina in ogni sequenza è C1), con nessun modo per rappresentare il ruolo strutturale. Ciò significa che possono essere paragonate solo sequenze con lo stesso numero di cisteine. C'è poco sequenza conservazione tranne le cisteine che formano la piega di CS-αβ, che rende difficile allineamenti e analisi filogenetiche. Attraverso lo sviluppo di un sistema di numerazione che dà priorità caratteristiche strutturali, sequenze di superfamiglia possono essere più facilmente rispetto e allineati. Caratteristiche conservate, così come quelle che definiscono i sottogruppi, possono essere fruiti rapidamente, e nuove sequenze possono essere più facilmente collocati nel contesto appropriato.

Questo documento utilizza un software di foglio di calcolo (ad esempio, Excel) per generare un sistema per la superfamiglia CS-αβ di numerazione di riferimento. Essa mostra come questo chiarisce i confronti tra le sequenze e le applica nuove sequenze di CS-αβ identificati dai tardigradi. Utilizzando la superfamiglia CS-αβ come esempio, il protocollo è stato scritto per fornire una guida quando si utilizza sequenze di interesse; Tuttavia, non è inteso per essere specifici di questa superfamiglia o sequenze ricche di cisteina. Questo metodo sarà probabilmente più utile per i gruppi di proteine che sono state studiate in modo indipendente in taxa divergenti e/o hanno poca omologia di sequenza complessiva, con discrete caratteristiche che non possono essere facilmente riconosciuti dal software di analisi molecolare. Questo metodo richiede alcune decisioni a priori per quanto riguarda caratteristiche importanti, quindi sarà di limitata utilità se non importanti caratteristiche sono state identificate. L'obiettivo primario è quello di mostrare come una semplice visualizzazione delle relazioni di sequenza può essere raggiunto. Questo quindi può essere utilizzato per informare l'allineamento di sequenza e l'analisi, ma se l'allineamento e l'analisi sono gli obiettivi primari, un metodo di codice a barre sarebbe una valida alternativa che ha più capacità per automazione¹³. Il metodo corrente Visualizza le funzioni di ciascun peptide in una forma lineare, quindi non sarà disponibile per la visualizzazione diretta della struttura 3D.

Protocollo

1. determinare le caratteristiche di definizione del gruppo di proteine di interesse

1. Consult precedenti pubblicazioni per determinare se c'è un consenso per quanto riguarda le caratteristiche che sono necessarie per essere considerato parte del gruppo. Prendere nota di eventuali incongruenze o differenze di opinione tra gruppi di ricerca e includere caratteristiche che possono servire a distinguere un sottogruppo da altra.
2. Se la letteratura precedente non riguarda caratteristiche distintive, utilizzare sequenze che sono considerate rappresentativi del gruppo come punto di partenza per identificare caratteristiche conservate.

2. Raccogliere rilevanti sequenze

1. se le recensioni sono state scritte che comprendono le analisi di sequenze che rappresentano il gruppo, includere queste sequenze nel set di dati grezzi. Recuperare sequenze utilizzando numeri di adesione a cui fa riferimento nella letteratura e salvare in una sequenza standard di programma di editing (ad es., EditSeq nella suite Lasergene o uno dei tanti disponibili per online gratis).
2. Se il gruppo in questione è stato definito in una delle basi di dati strutturali, includere le sequenze che database vengono elencati come facenti parte del gruppo. recuperare sequenze utilizzando numeri di adesione forniti nel database e salvare in una sequenza standard di editing programma, come sopra.
   Nota: ad esempio, le sequenze classificate nella superfamiglia delle CS-αβ (Scorpione tossina-come) nel database SCOP possono essere trovate qui: http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/data/scop.b.h.c.h.html.
3. eseguire base locale Ricerche di ¹⁴ Cerca strumento (BLAST) allineamento dei database pubblici, online disponibili attraverso il centro nazionale per Biotechnology Information (NCBI) per trovare sequenze che potrebbero non essere stato incluso nella letteratura o strutturali basi di dati. Per la maggior parte risultati completi, utilizzare entrambe la proteina BLAST (blastp) e tradotto blast con programmi di query (tblastn) di proteina; Queste sono entrambe disponibili presso: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
   1. Sequenze di uso noti per essere parte del gruppo di interesse come sequenze di query. Copiare e incollare la sequenza nella casella di ricerca nella parte superiore o fornire un di identificatore numero o gi di adesione GenBank, se disponibile.
   2. Scegliere il database dal menu a discesa. Scegliere sequenze proteiche non ridondante (nr) per blastp ed espresso Tag sequenza per tblastn.
   3. Ricerca per risultati in taxa specifici nell'organismo impostazione digitando l'organismo o il nome del taxon e scegliendo dall'elenco che viene visualizzato durante la digitazione. Per aggiungere ulteriori organismi o taxa di escludere, fare clic il " + " pulsante e un altro campo apparirà. Escludere qualsiasi taxa non desiderati nella finestra di organismo digitando il nome organismo o di un taxon, selezionando dall'elenco visualizzato durante la digitazione e il controllo della " Exclude " casella sulla destra.
   4. Accedere a parametri aggiuntivi facendo clic su " i parametri dell'algoritmo " vicino alla parte inferiore della pagina. Lasciare di default a meno che non c'è una spiegazione razionale per la modifica di un parametro.
   5. Clic la " BLAST " pulsante per eseguire l'analisi; potrebbe richiedere qualche tempo per visualizzare i risultati. In generale, recuperare colpi con un valore di expect (o e-value) di " -05 " o meglio e salvare in una sequenza standard di programma di editing.
      1. Se tutti i colpi sono superiore a questa soglia, eseguire nuovamente la ricerca con un aumento del numero di sequenze di destinazione (nella sezione parametri di algoritmo) per ottenere tutte le sequenze rilevanti.
4. Se necessario, tagliare le sequenze per escludere informazioni irrilevanti (ad es., la piega di CS-αβ si applica solo al peptide maturo). Identificare peptidi di segnale e pro-peptidi per la rimozione utilizzando ProP ¹⁵ (disponibile online), o SignalP per più sofisticato segnale peptide Pronostico ¹⁶ (disponibile online).

3. Generare un riferimento in un foglio di calcolo basato sulle importanti caratteristiche che sono state identificate

1. identificare le caratteristiche di definizione del gruppo di interesse. Ad esempio, utilizzare la piega di CS-αβ definitivamente stabilita dalla struttura soluzione dell'insetto defensine A da terraenovae Phormia ( Figura 1) ⁸.
   1. Questa piega include un motivo più piccolo chiamato la cisteina-stabilizzato elica (CSH) ¹⁷; identificare questo motivo da un CXXXC (dove X è qualsiasi aminoacido) a Monte di un CXC che formano due ponti disolfuro ( Figura 1 , tinta linee rosa).
      Nota: Per completare il motivo CS-αβ, un terzo ponte disolfuro è formato da altre cisteine inseriti prima di ogni metà del motivo della CSH ( Figura 1, rosa linee tratteggiate).
2. Entrare in questi la definizione di funzionalità in un foglio di calcolo. Vedere la Figura 2.
   1. Utilizzo di colonne per le funzionalità conservate e per rappresentare gli spazi tra queste caratteristiche. Mantenere le colonne sufficientemente ampie per inserire numeri e garantire che essi hanno una larghezza costante. Impostare la larghezza utilizzando il " formato | Larghezza della colonna " funzione ( Figura 2, freccia rosa).
   2. Utilizzare le righe per i nomi di sequenza.
   3. Quando una sequenza ha la caratteristica, compilare la casella utilizzando la funzione di riempimento ( Figura 2, quadrato rosa). Per la spaziatura tra funzionalità, immettere il numero di aminoacidi nella casella tra e lasciarlo vuoto. Ad esempio, utilizzando l'insetto defensine sequenza dà un riferimento che include sei cisteine, con distanze definite tra C2 e C3 e fra C5 e C6.
3. Aggiungere sequenze rappresentative che sono state precedentemente stabilite come membri del gruppo con sede a banche dati strutturali e la letteratura.
   Nota: ad esempio, la letteratura precedente e il database SCOP identificare diversi gruppi per l'inclusione: insetto defensine, catena corta Scorpione tossine, tossine dello Scorpione lungo-catena, MGD-1, pianta defensine, nematode ABFs, drosomycins da Drosophila, e macins. La letteratura identifica anche una sequenza batterica con solo quattro cisteine che potrebbe rappresentare l'antenato di questa superfamiglia ¹⁸. L'aggiunta di queste sequenze aumenta il numero di cisteine nel riferimento da sei a dieci, ma mantiene l'allineamento delle caratteristiche strutturali importanti ( Figura 3).
   1. Per aggiungere una funzionalità che è in grado di definire un sottogruppo delle sequenze (per esempio, una supplementare cisteina), utilizzare il " inserto " funzione ( Figura 3, freccia rosa).
   2. Se ci sono caratteristiche mancanti da una determinata sequenza, lasciare la casella vuota e si combinano con le caselle che rappresentano intermedi aminoacidi. Se necessario, unire le celle utilizzando la funzione Unisci e centra ( Figura 3, scatola rosa).
4. Continua aggiungere sequenze ai gruppi per ottenere una migliore immagine della variazione in ogni gruppo della superfamiglia del più grande. Riassumere le caratteristiche di gruppo per facilitare i confronti ( Figura 4).
   1. Quando varia il numero di amminoacidi tra le funzioni principali, utilizzare un trattino per indicare un intervallo, ad esempio 6-12 (6-12 aminoacidi) e da una barra per indicare sia / o, ad esempio 7/10 (7 o 10 aminoacidi).
   2. Scegliere un modo di annotare le caratteristiche di sequenze che possono essere rilevanti, ma non si verificano abbastanza spesso per includere nel riferimento. Ad esempio, poiché cisteine sono importanti in questa superfamiglia, etichetta altre cisteine ( Figura 4, scatole rosa).
5. Aggiungere newlsequenze y-identificato al foglio di calcolo utilizzando le sequenze stabilite come guida. Ad esempio, l'aggiunta di sequenze da tardigradi (giallo) Mostra che le sequenze di tardigrade cadano in diversi gruppi della superfamiglia ( Figura 5 Mostra sintesi anziché una riga per ogni sequenza per motivi di spazio).
6. Mostrano la variabilità all'interno di un gruppo tassonomico riordinando le righe ( Figura 6).

4. Utilizzare il riferimento per perfezionare gli allineamenti dell'amminoacido

Nota: ci sono molti programmi che possono essere utilizzati per allineamenti multipli di sequenza, ma questa dimostrazione verrà utilizzata l'analisi di genetica evolutiva molecolare (MEGA6) ¹⁹ perché è disponibile per il download gratuito.

1. Scaricare e installare il software.
2. Inizia un nuovo allineamento in MEGA selezionando " Edit/Build allineamento " sotto la scheda allineamento selezionare " creare un nuovo allineamento " nella finestra che viene visualizzata e fare clic su " OK. " quindi selezionare " proteina. "
3. Selezionare " inserire sequenza dal File " nella " modifica " menu per importare le sequenze.
   Nota: Sequenze dovrà essere in formato FASTA per l'importazione in MEGA. Colori di sfondo che riflettono tipi diversi aminoacidi vengono utilizzati per impostazione predefinita, ma questa opzione può essere disattivata sotto il " Display " menu.
4. Una volta che tutte le sequenze sono inserite, fare clic sull'icona di braccio flessione e poi " allineare proteina " per allineare le sequenze utilizzando l' algoritmo di muscolo ²⁰.
   Nota: È disponibile anche ClustalW.
   1. Se fa clic su un messaggio che dice che nulla è stato selezionato pop up e chiede di selezionare tutto, " OK. "
   2. Nota: verrà visualizzata una finestra che permette di modificare alcuni parametri, ma devono essere modificate solo non c'è motivo per farlo. Questa analisi utilizza un sottoinsieme delle sequenze analizzate in un precedente libro ¹².
5. Controllare immediatamente l'allineamento basato su caratteristiche importanti; si noti che la barra in alto sopra le sequenze mostrerà tutte le colonne dove l'aminoacido è completamente conservano (*). Vedi Figura 7. Vedere che l'allineamento iniziale Mostra solo tre le quattro cisteine conservate ( Figura 7, scatole rosa); guardando giù la colonna, la sequenza AlCRP è chiaramente non allineati ( Figura 7, freccia rosa).
6. Per sbarazzarsi del grande divario tra il I e il C conservata, evidenziare i trattini e premere il " Elimina " chiave. Non si evidenzia alcuna aminoacidi, o verranno eliminati anche.
7. Di aminoacidi per il diritto di spostare, evidenziare e premere la barra spaziatrice
   1. Nota che il AlCRP ha ora le cisteine strutturali allineate e che l'ultima C del motivo della CXXXC è conservato durante l'allineamento ( Figura 8). Regolare l'allineamento come necessario assegnare priorità le caratteristiche più importanti delle sequenze.

5. Confrontare i gruppi identificati utilizzando il riferimento con risultati da analisi filogenetiche

1. da allineamenti preliminari, determinare quali sequenze devono essere inclusi in un'analisi filogenetica; per un piccolo numero di sequenze, questo passaggio può essere inutili.
   1. Mantenere un file di allineamento che include tutte le sequenze, ma per un'analisi filogenetica, rimuovere sequenze ridondanti ( Figura 9, rosa caselle Visualizza paia di sequenze ridondanti).
   2. Se il set di dati include un gran numero di sequenze, eseguire un'analisi preliminare e selezionare rappresentanti di gruppi che da sempre formano un clade.
2. Determinare il miglior modello di sostituzione dell'amminoacido.
   1. Esportare l'allineamento in formato MEGA (sotto la scheda dati).
   2. Vai al menu modelli e selezionare " trovare migliori DNA/proteine modello. " scegliere il file appena salvato e aprirlo; verrà aperta una finestra con alcuni parametri che possono essere cambiati.
   3. Utilizzare i parametri predefiniti, a meno che non c'è un motivo per cambiarli. Fare clic su " calcolare " per iniziare l'analisi.
3. Eseguire un'analisi di massima verosimiglianza (ML) in MEGA.
   1. Scegli " costrutto/Test massima probabilità albero " dal menu Phylogeny.
   2. Scegliere il modello determinato a essere la soluzione migliore per i dati dal passaggio 5.2 (l'output darà il modello di sostituzione, nonché la migliore " tariffe tra siti " parametro).
   3. 1.000 scegliere bootstrap replica per ottenere delle misure di sostegno per l'albero.
   4. Clic " calcolare " per eseguire l'analisi; MEGA ha un " Tree Explorer " per visualizzare la struttura ad albero.
4. Eseguire un'analisi bayesiana in MrBayes software open-source ²¹.
   Nota: Un manuale di MrBayes è disponibile anche da questo sito. Questo è destinato a fornire passaggi di base e non è una guida completa per lo svolgimento di analisi filogenetica bayesiana.
   1. Esportare l'allineamento di MEGA in formato microscopio (Nexus) nella stessa cartella come il programma di MrBayes.
   2. Aperto MrBayes e tipo " exe nomefile " (ad es., " exe Alignment.nex ").
   3. Specificare i parametri di modello e di analisi. Scegliere il modello specificato nel passaggio 5.2 o scegliere il " misto " impostazione che cercherò di vari modelli e segnalare la frequenza del modello tra gli alberi con le migliori probabilità a posteriori (prset aamodelpr = misto). Tipo " showmodel " per segnalare le impostazioni del modello attuale e " aiutare mcmc " per mostrare le impostazioni correnti, con una breve spiegazione di ognuno.
   4. Impostare il numero di generazioni utilizzando il " mcmcp ngen = " comando (1 milione è tipico).
   5. Tipo " mcmc " per iniziare l'analisi.
   6. Quando il numero di generazioni è stata completata, il programma vi chiederà di aggiungere più generazioni. Se la deviazione standard media delle frequenze di Spalato è meno di 0,1, digitare no. Se è sopra 0.1, l'analisi dovrebbe essere consentita per continuare, o alcuni parametri devono essere modificati (vedere il manuale).
   7. Uso il " Simone " comando per generare i file albero.
   8. Dopo l'analisi è completa e viene generato un albero di consenso, l'albero può essere visualizzata in FigTree (disponibile online).
5. Confrontare gli alberi per vedere se i metodi generano risultati coerenti.
   Nota: Alcune sequenze non forniscono un sacco di informazioni: gli alberi non possono essere ben risolti e i rami possono avere supporto minimo ( Figura 10).
6. Confrontare alberi ai gruppi identificati utilizzando il riferimento per vedere se questi gruppi di sostegno l'analisi filogenetiche.

Risultati

Gruppi di sequenze nella superfamiglia delle CS-αβ segnalato nella letteratura sono mostrati in Figura 4. Gli abbinamenti di cisteina basati sulla numerazione per ogni sequenza suggeriscono cinque gruppi di base (tabella 1, colonna centrale). Il gruppo 1 ha sei cisteine che da bisolfuro di tre legami e include sequenze da insetti, aracnidi, molluschi, nematodi e funghi. Gruppi 2, 3 e 4 hanno 8 cisteine che formano quattro ponti disolfuro. G...

Discussione

I criteri per la denominazione di una proteina all'interno di un gruppo dovrebbero essere chiari, ma questo non è sempre il caso. Sequenze che hanno il CS-αβ piegare sono state studiate in molti laboratori utilizzando una varietà di organismi, risultante in diversi sistemi di nomenclatura, nonché a diversi livelli di caratterizzazione. Tentando di imporre una completamente nuova nomenclatura non è ragionevole e si tradurrebbe in una grande quantità di confusione durante la consultazione letteratura precedente. Un ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BLAST webpage			https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
EditSeq (Lasergene suite)	DNASTAR		https://www.dnastar.com/t-allproducts.aspx
Excel 2013	Microsoft
FigTree			http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/
MEGA			www.megasoftware.net
MrBayes			http://mrbayes.sourceforge.net/
SCOP database			http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/