만들기 및 적용 촉진 토론 및 다양 한 그룹에 있는 단백질의 분류에 대 한 참조

요약

이 프로토콜의 목표는 명명법과 분류에 대 한 일관 된 기준 부족 그룹에서 분기 단백질에 대 한 참조를 개발 하는 것입니다. 이 기준 분석과 전체적으로 그룹의 토론을 촉진 하며 설립된 이름을 사용할 수 있습니다.

초록

다양 한 유기 체를 사용 하 여 다른 실험실에서 연구 관련된 단백질 전체 그룹을 논의 하 고 적절 한 문맥에 새 시퀀스를 어렵게 명명법과 분류의 획 일 한 체계를 부족 수 있습니다. 구조에 관련 된 중요 한 시퀀스 기능을 우선 참조를 개발 하거나 활동 설립된 이름 단백질의 다양 한 그룹에 몇 가지 일관성을 추가 하려면 사용할 수 있습니다. 이 문서를 사용 하 여 알파-헬릭스 (CS αβ) 시스테인 안정 superfamily 예제로 보여 어떻게 스프레드 시트 소프트웨어에서 생성 된 참조 superfamily, 기존 단백질 사이의 관계를 명확 하 게 뿐만 아니라 수의 추가 용이 하 게 새로운 시퀀스입니다. 그것은 또한 참조 계통 발생 분석의 유효성에 영향을 일반적으로 사용 되는 소프트웨어에서 생성 하는 시퀀스 정렬 수정 하는 데 도움이 수 어떻게 보여 줍니다. 대 한 참조를 사용 하 여 가장 광범위 한 기능을 적절 하 게 캡처되지 않는 분자 분석에 의해 taxa에서에서 높은 분기 시퀀스를 포함 하는 단백질 그룹에 대 한 도움이 됩니다.

서문

단백질의 이름 특성 및 다른 단백질에 관계는 반영 해야 한다. 불행 하 게도, 이름을 발견의 때에 일반적으로 할당 하 고, 연구를 계속, 더 큰 맥락의 이해 변경 될 수 있습니다. 이 여러 이름 단백질은 독립적으로 이상의 실험실, 변화 명칭 또는 특성 이름을 할당할 때 확실 한 것으로 생각 하 고 더 이상 충분히 단백질을 차별화 하는 이름으로 식별 된 경우 발생할 수 없습니다. 다른 사람.

무척 추 동물 defensins 명명법과 분류에 변성의 좋은 예를 제공합니다. 첫 번째 무척 추 동물 defensins 곤충에서 보고 되었다 그리고는 이름 "곤충 defensin" 포유류 defensins^1,2에 인식된 상 동에 따라 제안 했다. 아직도 사용 되는 용어 defensin, 비록 그것은 이제 분명 그 무척 추 동물 및 포유류 defensins 공통 조상^3,4를 공유 하지 않습니다. 수 종에 따라 "defensin"는 무척추동물 6 또는 8 개의 시스테인 (3 개 또는 4 개의 이황화 결합을 형성) 하 고 항균 성 활동의 다양 한 있을 수 있습니다. 하 꼬마 remanei⁵에서 최근 확인 된 cremycins 같은 상황, 같은 특성을 가진 단백질 이라고 defensins 하지 항상 "defensins," 복잡 했다. 또한, 무척 추 동물 큰 defensins 진화론 척추 β-defensins 보다 다른 무척 추 동물 defensins⁶에 관련 된 더 높습니다. 그럼에도 불구 하 고, 연구자는 때때로 이름 "defensin" 분석에 포함 되어야 하는 순서를 결정할 때에 의존 합니다.

구조 연구 곤충 defensins와 전갈 독 소⁷, 사이의 유사성 그리고 CS-αβ 배 이후 곤충 defensins⁸의 구조적 특성을 정의로 설립 되었다. 이 배는 구조 분류의 단백질 (SCOP) 데이터베이스⁹, 현재 다섯 가족을 포함 전갈 독 소 같은 (CS αβ) superfamily 정의: 곤충 defensins, 짧은 체인 전갈 독, 긴 체인 전갈 독 소, MGD-1 (연체 동물), 그리고 식물 defensins. 이 superfamily 최근 설명된 cis defensins⁴ 와 Superfamily 3.30.30.10 선배/유전자 3D 데이터베이스^10,11에 동의어 이다. 무척 추 동물 taxa, 식물 및 균 류 쇼는이 배를 포함 하는 단백질의 이름을 명확 하 게 관련이 없는 시스테인 번호 또는 결합 패턴, 항균 성 활동, 또는 진화 역사¹²의 다양 한에서 연구.

일관성 및 명확한 기준의 부족 이름을 지정 하 고 새로 식별 된 시퀀스가이 superfamily 분류에 도전 할. 단백질이이 superfamily에 비교 하는 주요 장애물은 시스테인 각 개별 시퀀스 (각 시퀀스의 첫 번째 시스테인은 C1), 구조 역할에 대 한 계정 수 없습니다와 관련 하 여 매겨집니다. 즉, 시스테인의 동일한 수만 시퀀스를 비교할 수 있습니다. 정렬 및 계통 발생 분석을 어렵게 만드는 CS-αβ 배를 형성 하는 시스테인 이외의 작은 순서 보존이입니다. 구조 기능을 우선순위 번호 매기기 시스템을 개발 하 여 superfamily 시퀀스 수 있습니다 더 쉽게 비교 되며 정렬. 보존된 기능으로 정의 하는 하위 그룹은 신속 하 게 구상 될 수 있다 그리고 새로운 시퀀스 보다 쉽게 적절 한 상황에 놓일 수 있다.

이 문서 번호 시스템 CS-αβ superfamily에 대 한 참조를 생성 하는 스프레드시트 소프트웨어 (예: Excel)을 사용 합니다. 그것은 방법을 보여 줍니다이 시퀀스 간의 비교를 명확히 식별 tardigrades에서 새로운 CS-αβ 시퀀스에 적용 됩니다. CS-αβ superfamily를 사용 하 여 예를 들어, 프로토콜 작성 되었습니다 관심;의 시퀀스를 사용 하 여 지침을 제공 그러나, 그것은 아닙니다이 superfamily 또는 시스테인-부자 시퀀스에 특정. 이 방법은 다른 taxa에서 독립적으로 연구 되어 있다 작은 전반적인 순서 상 동, 분자 분석 소프트웨어에 의해 쉽게 인식 될 수 있습니다 개별 특성을 있는 단백질의 그룹에 대 한 가장 유용 하 게 됩니다. 이 방법은 중요 한 기능이 없는 확인 하는 경우 제한 된 유틸리티의 것 중요 한 기능에 관한 몇 가지 선험적으로 결정을 필요 합니다. 기본 목표는 순서 관계의 간단한 시각화를 얻을 수 있는 방법을 보여주는 것입니다. 이 시퀀스 정렬 분석, 정보를 사용할 수 있습니다 하지만 정렬 및 분석 기본 목표는, 만약 바코드 메서드 자동화¹³에 대 한 더 많은 용량을가지고 적당 한 대체 될 것 이라고. 현재 메서드는 3 차원 구조의 직접 시각화에 대 한 도움이 되지 않을 것 이다 그래서 선형 형태로 각 펩 티 드의 기능을 표시 합니다.

프로토콜

1. 관심의 단백질 그룹의 정의 기능 결정

1. 상담 그룹의 일부로 간주 하는 데 필요한 기능에 관한 합의 인지 확인 하려면 이전 간행물. 불일치 사항이 나 연구 그룹 간의 의견 차이 숙지 하 고 다른 한 하위 그룹을 차별화 하 역할 수 있는 특성을 포함.
2. 이전 문학 특성 정의 해결 하지 않습니다 경우 사용 보존된 기능을 식별 하는 출발점으로 그룹의 대표자 이라고 여겨진다 시퀀스.

2. 수집 관련 시퀀스

1. 리뷰 작성 되었습니다 하는 경우는 대표 하는 그룹 시퀀스의 분석을 포함, 원시 데이터 집합에서이 시퀀스를 포함. 가입 번호는 문학에서 참조를 사용 하 여 시퀀스를 검색 하 고 편집 프로그램 표준 순서로 저장 (예: EditSeq Lasergene 제품군 이나 많은 수 중에서 무료 온라인).
2. 문제의 그룹 구조 데이터베이스 중 하나에 정의 된 경우 데이터베이스 목록 승인 번호는 데이터베이스에 제공 된를 사용 하 여 검색 시퀀스 그룹의 일부분인으로 시퀀스를 포함 하 고 표준 시퀀스 편집에서 저장 위의 프로그램.
   참고: 예를 들어 시퀀스 SCOP 데이터베이스에 CS-αβ (전갈 독 소 같은) superfamily 분류 찾을 수 있습니다 여기: http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/data/scop.b.h.c.h.html.
3. 수행 기본 로컬 맞춤 검색 도구 (폭발) ¹⁴ 검색 공개, 온라인 데이터베이스 국립 센터에 대 한 생물 공학 정보 (NCBI) 찾을 수 없습니다 포함 된 문학에서 시퀀스를 통해 사용할 수 또는 구조 데이터베이스입니다. 에 대 한 가장 완료 결과, 단백질 폭발 (blastp)를 사용 하 여 번역 폭발 단백질 쿼리 (tblastn) 프로그램; 이들은 둘 다에서 유효 하다: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
4. 쿼리 시퀀스로 관심 그룹의 일부가 될 것으로 알려져 사용 시퀀스
   . 복사 및 순서는 상단에 검색 상자에 붙여 넣습니다 또는 사용 가능한 경우 은행 승인 번호 또는 gi 식별자를, 제공.
   1. 는 드롭다운 메뉴에서 데이터베이스를 선택합니다. Blastp에 대 한 비중복 단백질 시퀀스 (nr)을 선택 하 고 tblastn에 대 한 시퀀스 태그를 표현.
   2. 유기 체 또는 taxon 이름 입력 하 고 목록에서 선택 하 여 설정 하는 유기 체에 특정 taxa에 결과 대 한 검색에 입력 하는 동안 나타납니다. 추가 유기 체 또는 제외 하는 taxa를 추가 하려면 클릭 합니다 있는 " + " 단추 및 다른 필드에 표시 됩니다. 유기 체 또는 taxon 이름, 입력, 그리고 확인 하는 동안 표시 되는 목록에서 선택을 입력 하 여 유기 체 상자에서 모든 원치 않는 taxa를 제외는 " 제외 " 오른쪽 상자에.
   3. 클릭 하 여 추가 매개 변수를 액세스 " 알고리즘 매개 변수 "는 페이지의 하단 근처. 기본 매개 변수 변경에 대 한 근거는 두고.
   4. 클릭은 " 폭발 " 분석 실행 버튼, 결과 표시를 위한 시간이 좀 걸릴 수 있습니다. 일반적으로, 안타는 기대 가치 (또는 e-값)의 검색 "-05 " 또는 더 나은 및 편집 프로그램 표준 시퀀스에 저장.
      1. 모든 안타가이 임계값 위에 있다면, 모든 관련 시퀀스를 (알고리즘 매개 변수 섹션)에서 대상 시퀀스의 수를 증가 함께 검색을 다시 실행.
5. 필요한 경우 트림 없는 정보 (예를 들어, CS-αβ 배 성숙한 펩 티 드에만 적용)을 제외 하는 시퀀스. 신호 펩 티 드와 소품 ¹⁵를 사용 하 여 제거에 대 한 프로-펩 티 드 식별 (사용 가능한 온라인), 또는 더 정교한 신호 펩 티 드 예측 ¹⁶ SignalP (사용 가능한 온라인).

3. 중요 한 기능을 발견 했다를 기반으로 하는 스프레드시트에 대 한 참조를 생성

1. 식별 관심 그룹의 특성을 정의. 예를 들어 A Phormia terraenovae ( 그림 1) ⁸에서 defensin 곤충의 솔루션 구조에 의해 결정적으로 설립 CS-αβ 배를 사용 하 여.
   1. 시스테인 안정 나선형 (CSH) ¹⁷ 라는 작은 주제를 포함 하는이 배;이 모티브 CXXXC (여기서 X는 어떤 아미노산)에 의해 식별 두 개의 이황화 결합을 형성 하는 CXC의 업스트림 ( 그림 1 , 고체 라인 핑크).
      참고: CS αβ 모티브를 완료 하려면 3 이황화 결합 형성 된다 추가 시스테인 CSH 모티브 ( 그림 1, 핑크 라인을 점선)의 각 반 앞에서.
2. 입력 스프레드시트에 기능을 정의 하십시오. 그림 2를 참조 하십시오.
3. 보존된 기능에 대 한 이러한 기능 사이의 공간을 나타내는 데 사용 열
   . 숫자에 맞게를 갖도록 그들은 일관 된 폭을 충분히 넓게 열 유지. 사용 하 여 너비 설정에 " 형식 | 열 너비 " 기능 ( 그림 2, 분홍색 화살표).
   1. 시퀀스 이름에 대 한 행을 사용 하 여.
   2. 시퀀스 기능이 때 상자 채우기 함수 ( 그림 2, 핑크 스퀘어)를 사용 하 여 입력 합니다. 기능 사이의 간격에 대 한 사이 상자에 아미노산의 수를 입력 하 고 두고 칠하지. 예를 들어 시퀀스 defensin 곤충을 사용 하 여 정의 된 간격 그리고 c 5와 C6 C2 및 c 3 사이 6 시스테인 포함 된 참조를 제공.
4. 이전에 설립 된 대표적인 시퀀스 구조 데이터베이스와 문헌에 근거 하는 그룹의 구성원으로 추가.
   참고: 예를 들어 이전 문학과 SCOP 데이터베이스 식별 포함에 대 한 여러 그룹: 곤충 defensins, 짧은 체인 전갈 독, 긴 체인 전갈 독 소, 초파리에서 drosomycins, 선 충 류 ABFs, 식물 defensins, MGD-1 및 macins입니다. 문학 또한 4 시스테인이 superfamily ¹⁸의 상위를 나타내는 수 있는 세균성 시퀀스를 식별 합니다. 이러한 시퀀스 추가 시스테인 10 6에서 참조의 수를 증가 하지만 중요 한 구조적 기능 ( 그림 3)의 맞춤을 유지 합니다.
   1. 시퀀스 (예를 들어 추가 시스테인)의 하위 그룹을 정의할 수 있는 기능을 추가 하려면 사용 된 " 삽입 " 기능 ( 그림 3, 분홍색 화살표).
   2. 경우 주어진된 순서에서 누락 칠하지 상자 기능과 개입 아미노산을 나타내는 상자와 결합. 필요한 경우 병합 병합 및 센터 기능 ( 그림 3, 핑크 상자)를 사용 하 여 셀.
5. 계속 큰 superfamily의 각 그룹에 있는 변이의 더 나은 사진의 얻을을 시퀀스 그룹을 추가 합니다. 그룹 특성 비교 ( 그림 4)을 촉진 하기 위하여 요약.
   1. 주요 기능 사이의 아미노산의 수는 변화 한다 때 6-12 (6 ~ 12 아미노산), 그리고 중 하나를 나타내는 데 슬래시 같은 범위를 표시 하는 하이픈을 사용 / 또는, 7/10 (7 또는 10 아미노산) 등.
   2. 참조에 포함할 관련 될 수 있지만 자주 발생 하지 않습니다 있는 시퀀스의 기능에 주석을 추가 하는 방법을 선택 합니다. 예를 들어 시스테인이이 superfamily에 중요 한 이기 때문에, 레이블 추가 시스테인 ( 그림 4, 핑크 상자).
6. Newl 추가y 식별 가이드로 설립된 시퀀스를 사용 하 여 스프레드시트를 시퀀스. 예를 들어 tardigrades (노란색)에서 시퀀스를 추가 tardigrade 시퀀스 ( 그림 5는 공간을 위해 순서 당 행 대신 요약) superfamily의 몇 가지 다른 그룹으로가 보여줍니다.
7. 행 ( 그림 6)를 다시 배열 하 여 분류학 그룹 내의 다양성 쇼.

4. 아미노산 정렬 수정에 대 한 참조를 사용 하 여

참고: 여러 시퀀스 정렬에 사용할 수 있는 많은 프로그램이 있다 하지만이 데모 분자 진화 유전학 분석 (MEGA6)를 사용 합니다 ¹⁹ 그것은 무료로 다운로드 할 수 있기 때문에.

1. 다운로드 하 고 소프트웨어를 설치 합니다.
2. 선택 하 여 메가에서 새로운 맞춤 시작 " 편집/빌드 맞춤 " 맞춤 탭 선택에서 " 새로운 맞춤 만들 " 나타나고 클릭 상자에서 " 확인. " 다음 선택 " 단백질. "
3. 선택 " 파일에서 삽입 순서 "에 " 편집 " 시퀀스를 가져올 메뉴.
   참고: 시퀀스 메가로 가져오기 위한 FASTA 형태로 될 해야 합니다. 다른 아미노산 종류를 반영 하는 배경 색상은 기본적으로 사용 되지만이 옵션에서 해제할 수 있습니다는 " 표시 " 메뉴.
4. 중 유연 팔 아이콘을 클릭 하 여 모든 시퀀스를 입력 한 다음 " 정렬 단백질 " 근육 알고리즘 ²⁰를 사용 하 여 시퀀스를 정렬 하.
   참고: ClustalW 사용할 수 이기도합니다.
   1. 아무것도를 선택한 아빠 되었습니다 하 고 모두를 선택 하 라는 메시지가 클릭 " 확인. "
   2. 참고: 창이 열립니다 하는 몇 가지 매개 변수를 변경할 수 있도록 하지만 그들은 변경만 해야 그렇게 할 이유가. 이 분석은 이전 종이 ¹²에 분석 하는 시퀀스의 하위 집합을 사용.
5. 체크 맞춤 중요 한 기능에 따라, 시퀀스 위의 메뉴 표시줄 아미노산은 완전히 하는 모든 열 표시 됩니다 참고 보존 (*). 참조 그림 7. 초기 정렬 표시만 3 4 개의 보존된 시스테인 ( 그림 7, 핑크 상자); 참조 열 아래를 내려다 보면서, AlCRP 순서는 명확 하 게 고르지 ( 그림 7, 분홍색 화살표).
6. I 사이 큰 격차의 제거를 대시 고 보도 강조 보존 c는 " 삭제 " 키. 어떤 아미노산을 강조 하지 마십시오 또는 또한 삭제 됩니다.
7. 이동 오른쪽 아미노산, 강조 하 고는 스페이스바를 눌러
8. 메모는 AlCRP 이제 정렬 구조 시스테인은 CXXXC 모티브의 마지막 C 맞춤 ( 그림 8)에 걸쳐 보존은
   . 시퀀스의 가장 중요 한 기능을 우선 순위를 필요에 따라 맞춤 조정.

5. 그룹 식별 사용 하 여 계통 발생 분석에서 결과 함께 참조 비교

1. 예비 정렬에서 어떤 시퀀스, 시퀀스의 작은 숫자에 대 한 계통 발생 분석에 포함 되어야 하는 것을 확인,이 단계 수 있습니다 필요한 수.
   1. 모든 시퀀스를 포함 하는 맞춤 파일 유지 하지만 계통 발생 분석에 대 한 시퀀스를 중복 제거 (중복 시퀀스 그림 9, 분홍색 상자 표시 쌍).
   2. 데이터 집합 시퀀스의 많은 수를 포함 하는 경우 예비 분석을 실행 하 고 그룹 선택 대표는 항상 한 clade를 형성.
2. 최고의 아미노산 대체 모델 결정.
   1. 메가 형식 (아래 데이터 탭) 맞춤 수출.
   2. 모델 메뉴에가 고 선택 " 찾을 최고의 DNA/단백질 모델. ";에 그냥 저장 하는 파일을 선택 하 고 열이 변경할 수 있는 몇 가지 매개 변수가 있는 창이 열립니다.
   3. 그들을 변경 하는 이유가 없다면 기본 매개 변수를 사용 합니다. 클릭 " 계산 " 분석 시작.
3. 최대 가능성 (ML) 분석을 실행 하는 메가에.
   1. 선택 " 구문/테스트 최대 가능성 트리 " 계통 메뉴에서.
   2. 모델 결정 단계 5.2에서에서 데이터에 대 한 최적 선택 (대체 모델 뿐만 아니라 최고 출력 줄 것 이다 " 사이트 중 " 매개 변수).
   3. 선택 1000 부트스트랩 트리에 대 한 지원의 측정을 얻기 위해 복제.
   4. 클릭 " 계산 " 분석;을 실행 하려면 메가 한 " 트리 탐색기 " 트리 시각화 하.
4. 베이지안 분석을 실행 하는 MrBayes 오픈 소스 소프트웨어 ²¹.
   참고: MrBayes 설명서는 또한 사용할 수 있는이 사이트에서. 이 기본 단계를 제공 하기 위한 것입니다 그리고 베이지안 계통 발생 분석에 포괄적인 가이드를 하지 않습니다.
   1. PAUP (넥서스) 형태로 메가 맞춤 MrBayes 프로그램으로 같은 폴더에 수출.
   2. 오픈 MrBayes 유형과 " exe 파일 이름 " (예를 들어, " exe Alignment.nex ").
   3. 모델 및 분석 매개 변수를 지정합니다. 단계 5.2에서에서 지정한 어느 모델을 선택 하거나 선택 하는 " 혼합 " 다양 한 모델을 시도 하 고 최고의 후부 및 확률 나무에 모델의 주파수를 보고 설정 (prset aamodelpr = 혼합). 유형 " showmodel " 모델의 현재 설정을 보고 하 고 " mcmc 도움이 " 각각의 간략 한 설명과 함께 현재 매개 변수 설정을 보여.
   4. 설정 사용 하 여 세대의 수는 " mcmcp ngen = " 명령 (1 백만 전형적인).
   5. 유형 " mcmc " 분석 시작.
   6. 세대 수가 완료 되 면, 프로그램이 더 많은 세대를 추가 하려면 묻습니다. 분할 주파수의 평균 표준 편차를 사용 하 여 0.1 보다 작으면, 아니요를 입력 합니다. 경우 0.1 이상, 분석 계속가 수 또는 (설명서 참조) 몇 가지 매개 변수를 변경 해야 합니다.
   7. 사용은 " sumt " 트리 파일을 생성 하는 명령을.
   8. 분석이 완료 되 고 합의 트리 생성, 후 나무 기관에서 볼 수 있습니다 (사용 가능한 온라인).
5. 메서드 생성 일관 된 결과 보러 나무 비교.
   참고: 일부 시퀀스 정보를 많이 제공 하지 않습니다: 나무 잘 해결 되지 않을 수 있습니다 및 지점 최소 지원 ( 그림 10)를 할 수 있습니다.
6. 나무 계통 발생 분석 지원이 그룹을 참조 하는 참조를 사용 하 여 식별 하는 그룹을 비교.

결과

문학에서 보고 된 CS-αβ superfamily 시퀀스의 그룹은 그림 4에 나와 있습니다. 시스테인 쌍 각 시퀀스에 대 한 번호 매기기에 따라 다섯 가지 기본 그룹을 (표 1가운데 열) 것이 좋습니다. 그룹 1은 3 개의 이황화에서 채권 및 곤충, 거미, 연체 동물, 선 충, 그리고 곰 팡이에서 시퀀스를 포함 하는 6 개의 시스테인. 그룹 2, 3, 및 4는 4 개의 이황?...

토론

그룹 내에서 단백질을 명명에 대 한 기준 명확 해야 하지만 이것은 항상 사실이 아니다. CS-αβ 접어 있는 시퀀스는 다양 한 유기 체를 사용 하 여, 명명법의 다른 시스템에 결과 뿐만 아니라 다양 한 수준의 특성화의 많은 실험실에서 연구 되었습니다. 완전히 새로운 명명법을 부과 하려고 무리 하다 고 이전 문학을 컨설팅 할 때 혼란의 큰 거래 귀 착될 것입니다. 번호 시스템 참조는 superfamily 상대?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BLAST webpage			https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
EditSeq (Lasergene suite)	DNASTAR		https://www.dnastar.com/t-allproducts.aspx
Excel 2013	Microsoft
FigTree			http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/
MEGA			www.megasoftware.net
MrBayes			http://mrbayes.sourceforge.net/
SCOP database			http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/