Создание и применение ссылку для облегчения обсуждения и классификации белков в различные группы

Резюме

Цель настоящего Протокола заключается в разработке ссылку для различных белков в группе, которой недостает согласованных критериев для классификации и номенклатуры. Эта ссылка будет способствовать анализа и обсуждения в группе в целом и может использоваться в дополнение к установленным имена.

Аннотация

Похожие белки, которые были изучены в разных лабораториях с использованием различных организмов может отсутствие единой системы номенклатура и классификация, что делает его трудным для обсуждения группы в целом и поставить новые последовательности в соответствующий контекст. Разработка ссылку, приоритеты важную последовательность функций связанных с структурой и/или активности может использоваться в дополнение к установленным имена для добавления некоторых когерентности в группу различных белков. Этот документ использует надсемейства хвоща стабилизированный альфа спираль (CS-αβ) в качестве примера показать как ссылку в таблице программного обеспечения можно уточнить взаимоотношения между существующими белки суперсемейства, а также облегчить добавление новых последовательности. Он также показывает, как ссылка может помочь уточнить выравниваний последовательности в часто используемых программного обеспечения, которое влияет на действительность филогенетических анализов. Использование ссылки, вероятно, будет наиболее полезным для групп белков, которые включают в себя весьма различные последовательности от широкого спектра таксонов, с функциями, которые должным образом не захвачен молекулярного анализа.

Введение

Белок название должно отражать характеристики и отношения с другими белками. К сожалению имена обычно назначаются во время обнаружения и, по мере исследования, понимание более широкого контекста может измениться. Это может привести к несколько имен, если белок самостоятельно был идентифицирован по более чем одной лаборатории, изменения в номенклатуре или характеристики, считается окончательным, назначая имя и на имя дифференцировать больше не достаточно белка от других.

Беспозвоночных дефензинов обеспечивают хороший пример дегенерации в номенклатуры и классификации. Первый беспозвоночных дефензинов поступили от насекомых, и название «насекомое дефенсина» было предложено основаны на предполагаемых гомологии млекопитающих дефензинов^1,2. Дефенсина термин используется до сих пор, несмотря на то, что это теперь ясно, что беспозвоночных и млекопитающих дефензинов не разделяют общий предок^3,4. В зависимости от вида беспозвоночных «дефенсина» могут иметь шесть или восемь которым (которые формируют три или четыре дисульфидными облигаций) и целый ряд антимикробной мероприятий. Чтобы осложнить ситуацию, белки с теми же характеристиками как дефензинов не всегда называют «дефензинов,» например, недавно выявленных cremycins от Caenorhabditis remanei⁵. Кроме того беспозвоночных большой дефензинов чаще эволюционно связаны с позвоночных β-дефензинов чем других беспозвоночных дефензинов⁶. Несмотря на это исследователи иногда полагаться на имя «дефенсина», при определении, какие последовательности должны быть включены в анализ.

Структурные исследования показали сходство между насекомых дефензинов и Скорпион токсинов⁷, и CS-αβ раза впоследствии был создан как структурное характерной насекомых дефензинов⁸. Этот раз определяет надсемейства (CS-αβ) токсин как Скорпион в классификации структурных белков (ГКНП) базы данных⁹, который в настоящее время включает в себя пять семей: насекомых дефензинов, короткоцепные Скорпион токсинов, длинноцепочечных Скорпион токсинов, МГД-1 (от моллюсков) и завод дефензинов. Этот надсемейства ассоциируется с недавно описан СНГ дефензинов⁴ и надсемейства 3.30.30.10 Кэт/ген 3D базы данных^10,11. Исследования из целого ряда таксона беспозвоночных, растений и грибов показать, что имена белков, которые содержат этот раз хвоща номер или шаблон склеивание, антимикробной активности или эволюционной истории¹²четко не связаны.

Отсутствие последовательности и четких критериев сделать это сложно назвать и классифицировать недавно выявленные последовательности в этом надсемейства. Основным препятствием для сравнения белков в этом надсемейства — что которым нумеруются в отношении каждой индивидуальной последовательности (первый цистеина в каждой последовательности-C1), с никоим образом с учетом структурной роли. Это означает, что только последовательности с тем же числом, по которым можно сравнить. Существует мало сохранения последовательности помимо которым, образуя CS-αβ раза, что затрудняет рядов и филогенетический анализ. Путем разработки системы нумерации, которая определяет приоритеты структурные особенности, надсемейства последовательности может быть более легко по сравнению и выровнены. Сохранение функций, а также определения подгруппы, могут быть визуализированы быстро, и новой последовательности могут быть более легко помещены в соответствующий контекст.

Этот документ использует программное обеспечение электронной таблицы (например, Excel) для создания ссылка номерной системе для CS-αβ надсемейства. Он показывает, как это разъясняется сравнений между последовательностями и применяет его к новой последовательности CS-αβ определены от тихоходок. CS-αβ надсемейства используя в качестве примера, протокол был написан для обеспечения руководства при использовании последовательности интерес; Однако он не предназначен конкретно для этого надсемейства или хвоща богатых последовательностей. Этот метод, вероятно, будет наиболее полезным для групп белков, которые исследовали независимо в различных таксонов и/или имеют мало общего гомологии последовательности, с дискретной характеристиками, которые не могут быть легко признаны молекулярный анализ программного обеспечения. Этот метод требует некоторых априорных решения относительно важных особенностей, поэтому он будет иметь ограниченную полезность если не важные функции были определены. Основная цель заключается в том, чтобы показать, как простой визуализации последовательности отношений может быть достигнуто. Это может затем использоваться для информирования выравнивание последовательностей и анализа, но если выравнивание и анализ являются основными целями, штрих-код метода будет подходящей альтернативой, которая имеет больше возможностей для автоматизации¹³. Текущий метод отображает особенности каждого пептида в линейной форме, поэтому он не будет полезным для прямой визуализации 3D структуры.

протокол

1. определить функции определения группы протеин интереса

1. Consult предыдущих публикаций определить, если есть консенсус относительно особенностей, которые необходимо считать частью группы. Принять к сведению любые несоответствия или расхождения во мнениях между исследовательскими группами и включают в себя характеристики, которые могут служить для различения одной подгруппы от другой.
2. Если предыдущие литература не определяющие характеристики, использовать последовательности, которые считаются представитель группы как отправной точки для определения сохранены функции.

2. Сбор соответствующих последовательностей

1. Если Отзывы написали что включают анализ последовательностей, которые представляют группы, включают эти последовательности в наборе сырья. Извлечение последовательности с помощью присоединения цифры, указанные в литературе и сохранить в стандартной последовательности программы редактирования (например, EditSeq в Lasergene люкс или один из многих доступных для Бесплатные онлайн).
2. Если этой группы был определен в одном из структурных баз данных, включают последовательности, база данных списки извлечения последовательности с помощью присоединения номеров, предоставленных в базе данных как часть группы. и сохранить в стандартной последовательности редактирования Программа, как указано выше.
   Примечание: например, последовательности, классифицированы в надсемейство CS-αβ (Скорпион токсин как) в базе данных "ГКНП" можно найти здесь: http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/data/scop.b.h.c.h.html.
3. выполнять основные местные Выравнивание инструмент поиска (взрыв) ¹⁴ Поиск общественного, онлайн баз данных, доступных через Национальный центр биотехнологии информации (NCBI) чтобы найти последовательностей, которые могут не были включены в литературе или структурных баз данных. Для наиболее полные результаты, использовать оба белка взрыва (blastp) и перевод взрыв с белком запросов (tblastn) программы; они будут доступны на: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
   1. Использования последовательности известно для быть частью группы интерес как последовательности запроса. Скопируйте и вставьте последовательность в поле поиска в верхней части или предоставить GenBank присоединения номер или gi идентификатор, если таковые имеются.
   2. Выберите базу данных из раскрывающегося меню. Выберите без избыточности белковых последовательностей (nr) для blastp и выразил последовательности теги для tblastn.
   3. Поиск для достижения результатов в конкретных таксонов в организме, установки, введя организма или таксон имя и выбрав из списка, который появляется при вводе. Чтобы добавить дополнительные организмов или таксонов исключить, нажмите кнопку " + " появятся кнопки и другое поле. Исключить любые нежелательные таксонов в поле организма, введя имя организма или Таксон, выбор из списка, который появляется во время ввода и проверки " исключить " поле справа.
   4. Доступ к дополнительным параметрам, нажав на " параметры алгоритма " вблизи в нижней части страницы. Оставьте по умолчанию, если нет оснований для изменения параметра.
   5. Нажмите " взрыва " кнопку, чтобы запустить анализ, это может занять некоторое время для того чтобы появиться результаты. В общем, получить хиты с ожидать значение (или e значение) " -05 " или лучше и сохранить в стандартной последовательности программы редактирования.
      1. Если все хиты выше этого порога, повторите поиск с увеличение числа последовательности (в разделе Параметры алгоритма) для получения всех соответствующих последовательностей.
4. При необходимости обрезать последовательности, чтобы исключить ненужную информацию (например, CS-αβ раз применяется только к зрелой пептида). Определить сигнал пептидов и про пептиды для удаления с помощью ProP ¹⁵ (доступно онлайн), или SignalP для более сложного сигнала пептид предсказание ¹⁶ (доступно онлайн).

3. Создать ссылку в таблицы, основанные на важные что были определены особенности

1. выявить определяющие характеристики группы интересов. Например, используйте CS-αβ складки окончательно установленным структуры решения насекомых дефенсина A Phormia terraenovae ( рис. 1) ⁸.
   1. Этот раз включает в себя меньше мотив под названием хвоща стабилизированный спирали (CSH) ¹⁷; идентифицировать этот мотив, CXXXC (где X — любое аминокислоты) вверх по течению от КЭС, которые формируют двумя дисульфидными облигаций ( Рисунок 1 , сплошной линии розовый).
      Примечание: Для завершения CS-αβ мотив, третий дисульфидными облигаций формируется из дополнительных которым помещен перед каждой половины CSH мотив ( рис. 1, пунктирные линии розовый).
2. Ввести эти определения функции в электронную таблицу. Смотрите Рисунок 2.
   1. Использование столбцов для сохраненных функций и для представления пробелов между этими функциями. Держите достаточно широким, чтобы соответствовать чисел и убедитесь, что они имеют постоянной ширины столбцов. Задайте ширину с помощью " формат | Ширина столбца " функции ( рис. 2, розовыми стрелками).
   2. Использовать строки для имен последовательности.
   3. Когда последовательность имеет свою особенность, заполните поле с помощью функции заполнения ( рис. 2, розовый площади). Для интервалов между функциями, введите количество аминокислот в поле между и оставить незаполненной. Например, использование насекомых дефенсина последовательности дает ссылку, которая включает в себя шесть которым, с определенного расстояния между C2 и C3 и C5 и C6.
3. Добавить представителя последовательностей, которые были ранее созданы как членов группы на основе структурных баз данных и литературы.
   Примечание: например, предыдущие литературы и базу ГКНП определить несколько групп для включения: насекомых дефензинов, короткоцепные Скорпион токсинов, длинноцепочечных Скорпион токсинов, МГД-1, завод дефензинов, нематода ABFs, drosomycins от дрозофилы, и macins. Литературе также определяет последовательность бактериальной с которым лишь четыре, которые могут представлять предок этого надсемейства ¹⁸. Добавление этих последовательностей увеличивает количество которым в ссылке от шести до десяти, но поддерживает выравнивание важных структурных особенностей ( рис. 3).
   1. Для добавления функции, которая может определить подгруппа последовательности (например, дополнительные цистеин), используйте " Вставка " функции ( рис. 3, розовыми стрелками).
   2. Если есть функции, отсутствующие в определенной последовательности, оставьте поле незаполненными и объединить его с коробки, представляющих промежуточные аминокислоты. При необходимости, объединить ячейки, используя функцию слияния и центр ( рис. 3, розовый ящик).
4. Продолжать Добавление последовательности к группам получить более полную картину вариации в каждой группе больших надсемейства. Суммировать характеристики группы для облегчения сравнения ( рис. 4).
   1. Когда меняется количество аминокислот между основными функциями, используйте дефис для обозначения диапазона, например, 6-12 (6-12 аминокислоты) и косую черту для обозначения либо / или, например, 7/10 (7 или 10 аминокислот).
   2. Выбрать способ добавления заметок к функции последовательностей, которые могут иметь отношение, но не повторялись достаточно часто включить в ссылку. К примеру, с которым важны в этом надсемейства, этикетка дополнительные которым ( рис. 4, розовый коробки).
5. Добавить Боровеy определены последовательности в электронную таблицу, используя в качестве руководства в установленной последовательности. Например, Добавление последовательности от тихоходок (желтый) показывает, что tardigrade последовательности делятся на несколько различных групп надсемейства ( рис. 5 показывает резюме вместо строки в последовательность для целей космической).
6. Показать изменчивости в пределах таксономические группы Перестановка строк ( рис. 6).

4. Используйте ссылку для уточнения аминокислоты рядов

Примечание: существует множество программ, которые могут быть использованы для множественных выравниваний последовательности, но эта демонстрация будет использовать молекулярный анализ эволюционной генетики (MEGA6) ¹⁹ потому что он доступен для бесплатного скачивания.

1. Скачать и установить программное обеспечение.
2. Начать новое выравнивание в MEGA, выбрав " выравнивание изменить/создать " под вкладку Выравнивание выберите " создать новое выравнивание " в поле, который появляется и нажмите " ОК. " выберите " белка. "
3. Выберите " вставка последовательности из файла " в " редактирования " меню для импорта последовательностей.
   Примечание: Последовательности будет нужно быть FASTA формат для импорта в мега. Цвета фона, которые отражают различные аминокислоты типы используются по умолчанию, но эта опция может быть отключена при " дисплей " меню.
4. После того, как введены все последовательности, нажмите значок сгибание рук и затем " выравнивания белка " для выравнивания последовательностей с использованием алгоритма мышц ²⁰.
   Примечание: ClustalW также доступен.
   1. Если сообщение о том, что ничего не был отдельных СОЗ и просит, чтобы выделить все, нажмите " ОК. "
   2. Примечание: откроется окно, которое позволяет изменять некоторые параметры, но они должны быть изменены только есть причина для этого. Этот анализ использует подмножество последовательностей, анализируются в предыдущем документ ¹².
5. Проверить выравнивание на основе важных особенностей; Обратите внимание, что верхняя панель выше последовательности покажет какие-либо столбцы где аминокислота является полностью сохранены (*). Смотреть Рисунок 7. Увидеть, что первоначальный выравнивание показывает только три из четырех сохранившихся которым ( рис. 7, розовый коробки); Глядя вниз по столбцу, AlCRP последовательность, явно неправильно ( рис. 7, розовыми стрелками).
6. Избавиться от большого разрыва между I и сохранены C, тире и нажмите клавишу " удалить " ключ. Не выделять все аминокислоты, или они будут также удалены.
7. Аминокислоты справа, выделите и нажмите пространство бара
   1. Обратите внимание, что AlCRP теперь имеет структурные которым согласованы и что последний C CXXXC мотив сохраняется на протяжении всего выравнивание ( рис. 8). Настроить выравнивание при необходимости уделять приоритетное внимание наиболее важных особенностей последовательностей.

5. Сравнение групп определены с помощью ссылки на результаты филогенетических анализов

1. от предварительных рядов, определить, какие последовательности должны быть включены в филогенетический анализ, за небольшое количество последовательностей, этот шаг может ненужным.
   1. Сохранить файл выравнивания, который включает в себя все последовательности, но филогенетический анализ, удалите избыточные последовательности ( рис. 9, розовый коробки шоу пары избыточных последовательностей).
   2. Если набор данных включает в себя большое количество последовательностей, запустите предварительный анализ и выбор представителей групп, всегда образуют клада.
2. Определить лучшие модели замены аминокислот.
   1. Экспорт выравнивание в мега формате (на вкладке данные).
   2. Перейти к меню модели и выберите " найти лучший ДНК/белок модель. " выберите сохраненный файл и открыть его, откроется окно, которое имеет несколько параметров, которые могут быть изменены.
   3. Использовать параметры по умолчанию, если нет причин менять их. Нажмите кнопку " вычислить " чтобы начать анализ.
3. Запуск анализа максимального правдоподобия (мл) в мега.
   1. Выберите " конструкции/испытания максимальная вероятность дерево " от меню филогении.
   2. Выбрать модель решимости быть лучше всего подходят для данных из шага 5.2 (результат даст моделью замещения, а также лучшие " среди сайтов " параметр).
   3. 1000 выбрать загрузочный реплицирует для получения меры поддержки для дерева,.
   4. Нажмите " вычислить " для запуска анализа; МЕГА имеет " Обозреватель дерева " для визуализации дерева.
4. Запустить байесовский анализ в MrBayes с открытым исходным кодом ²¹.
   Примечание: MrBayes инструкция доступна также с этого сайта. Это призвано обеспечить основные шаги и не полное руководство по Байесу филогенетический анализ.
   1. Экспорт мега выравнивание в формате PAUP (Nexus) в ту же папку, как в программе MrBayes.
   2. Открыт MrBayes и тип " exe файла " (например, " exe Alignment.nex ").
   3. Укажите параметры модели и анализа. Выберите модель, указанной на шаге 5.2 или выбрать " смешанного " параметр, который будет попробовать различные модели и сообщить частоты модели на деревьях с лучших апостериорные вероятности (надпись aamodelpr = смешанные). Тип " showmodel " сообщить текущие параметры модели и " помочь mcmc " чтобы показать текущие настройки параметров, с кратким объяснением каждого из.
   4. Установить количество поколений с помощью " mcmcp ngen = " команда (1 миллион типичной).
   5. Тип " mcmc " чтобы начать анализ.
   6. После завершения количество поколений, программа спросит для добавления нескольких поколений. Если средняя стандартное отклонение частоты Сплит является менее чем 0.1, введите без. Если это выше 0,1, анализа должно быть позволено продолжать, или некоторые параметры должны быть изменены (см. инструкцию).
   7. Использования " sumt " команда для создания дерева файлов.
   8. После того, как анализ завершен и формируется консенсус дерево, дерево может рассматриваться в FigTree (доступные сети).
5. Сравнения на деревья, чтобы увидеть, если методы создают последовательные результаты.
   Примечание: Некоторые последовательности не предоставляют много информации: деревья не могут быть наилучшим образом решены и филиалы могут иметь минимальную поддержку ( Рисунок 10).
6. Сравнить деревья для групп, выявленных с помощью ссылки, чтобы увидеть, если эти группы поддержки филогенетический анализ.

Результаты

На рисунке 4показаны группы последовательностей в CS-αβ надсемейства, сообщили в литературе. Цистеин комбинаций, основанные на нумерации для каждой последовательности предложить пять основных групп (Таблица 1, средний столбец). Группа 1 имеет ш?...

Обсуждение

Критерии для именования белка в группе должно быть ясно, но это не всегда так. Последовательности, которые имеют CS-αβ складывать были изучены в многих лабораториях с использованием различных организмов, в результате в различных системах номенклатуры, а также различные уровни квалифика...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BLAST webpage			https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
EditSeq (Lasergene suite)	DNASTAR		https://www.dnastar.com/t-allproducts.aspx
Excel 2013	Microsoft
FigTree			http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/
MEGA			www.megasoftware.net
MrBayes			http://mrbayes.sourceforge.net/
SCOP database			http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/