Phloem Sap örnekleme gelen Brassica napus 3D-sayfa Protein ve Ribonükleoprotein kompleksleri için

Özet

Burada büyük yerli protein: protein ve protein protein bileşimi çözümlemek için bir protokol mevcut: yağlı tohum tecavüzünün nükleik asit kompleksleri (B. napus) mavi birleştiren 3D polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa) yaklaşımı kullanılarak, phloem çıktı yerli (BN) tarafından kitle spektrometrik kimlik ardından iki tane denaturing sayfa.

Özet

Phloem daha yüksek bitkilerin örnekleme kez zahmetli ve önemli ölçüde bağlı olarak bitki türü. Ancak, koşullar denaturing altında Proteom çalışmaları farklı bitki türü içinde elde edilebilir. Yerli protein: protein ve protein: nükleik asit kompleksleri phloem örneklerinden henüz pek analiz, her ne kadar onlar bu özel bölümü bakım veya uzun mesafeli sinyal önemli roller oynamak. Büyük moleküler gruplar mavi yerli Jel Elektroforez (BN-sayfa) kullanarak ayrılmış olabilir. Protein bileşenleri bir sonraki Sodyum Lauryl Sülfat (SDS-sayfa) tarafından ayrılabilir. Ancak, protein benzer moleküler ağırlıkları ile ne tarafından kütle spektrometresi protein kimlik engel olabilir ortak göç eder. İki farklı denaturing Jel Elektroforez adımları ile yani Tris-Tricine-üre ve SDS-sayfa, BN-sayfa birleştirerek proteinler onların hydrophilicity/hydrophobicity göre ek ayrılması sağlar ve böylece çözünürlük ve başarı artırır protein tanımlaması. Hatta sadece onların ardından değişikliklerini farklı proteinler ayırt sağlar. Ayrıca, mavi yerel Kuzey kurutma makromoleküllerin komplekslerinde RNA bileşenlerini belirlemek için uygulanır. Bizim iletişim kuralı protein ve RNA bileşenlerini yerli protein: protein ve phloem örneklerinde meydana gelen Ribonükleoprotein (RNP) kompleksleri çözülmeye uygun olduğunu göstereceğiz. Bir mavi birleştirerek iki farklı denaturing sayfa adımlar ile yerel sayfa büyük protein kompleksleri farklı türde ayırmak için yardımcı olabilir ve ayrıca tarafından kütle spektrometresi bileşenlerinin bir artan tanıma oranı sağlar. Ayrıca, aynı anda tek protein kompleksleri içinde potansiyel olarak ilişkili nükleik asitler algılamak için sağlam bir protokoldür.

Giriş

Phloem uzun mesafe hatları daha yüksek bitkilerde organik besin tahsisi için gerekli olan, ama aynı zamanda birçok farklı işlemler önemli büyüme ve kalkınma, patojen savunma ve adaptasyon için olumsuz düzenlenmesinde katılmaktadırlar çevre koşulları. İyonlar, etki veya metabolitleri kendileri gibi küçük effectors yanı sıra oluştururlar protein ve RNA gibi son zamanlarda potansiyel sinyaller olarak ortaya çıkmıştır.

Çalışmalar proteinlerin phloem yükleme boyutu bağımlı ve dışlama boyutunda (SEL) eşlik eden hücreler (CC) bağlanma gözenek plasmodesmal birimleri tarafından kontrol olduğunu göstermiştir ve elek genellikle 10 aralığındaki öğeleri (SE) > 67 kDa^{1 , 2 , 3}. ancak, rağmen bu boyutu sınırlamaları daha büyük protein ve protein kompleksleri boyutu dışlama⁴fikri zor phloem sistemi içinde bulundu ve se CC den proteinlerin bile nonspesifik kaybı önerilen⁵ oldu .

Multiprotein gibi büyük Ribonükleoprotein kompleksleri içinde biyosentezi ve hücre⁶yapısal bütünlüğünü korumak çok önemli rol oynarlar. Phloem-mobil protein-protein ve Ribonükleoprotein kompleksleri^4,7, mevcut kanıt ama bugüne kadar onların işlevi hakkında az şey bilinmektedir. Phloem elek elemanları uzun mesafe taşımacılığı ve / veya sinyal^8,9ile protein: protein ve RNP kompleksleri karıştığı. Değişen altında çevre onların kompozisyon translocated kompleksleri fonksiyonları çözmek veya stres koşulları gereklidir. Bunu başarmak için yerel kompleksleri izole olmak zorunda ve bileşenlerinin yeterli çözünürlükte ayrılması gerekiyor.

Yüksek molekül ağırlıklı kompleksleri phloem dan izole etmek için yeterli kalite ve miktar sap örneklerini almak için ilk gerekli olduğunu. Phloem örnekleme için kullanılan teknik faiz bitki türü üzerinde bağlıdır. Phloem su elde etmek için üç ana yöntem mevcut ¹⁰: böcek stylectomy¹¹, EDTA kolaylaştırdı reaksiyon¹²ve spontan reaksiyon¹³.

Phloem örnekleri Arabidopsis thaliana (A. thaliana), laboratuvarlar dünya çapında, büyük modeli fabrikasında sadece EDTA kolaylaştırdı reaksiyon veya yaprak biti stylectomy^14,15tarafından elde edilebilir. Her iki yöntem son derece seyreltik phloem sap veya çok düşük örnek tutarlar için yol. EDTA kolaylaştırdı reaksiyon da kontaminasyon için eğilimli ve gerçek phloem kompozisyon¹⁶gösterebilir değil. Spontan phloem reaksiyon nereye çıktığını bitki parçalar keserek kolayca toplanan^{13,17,18olabilir phloem sap spontan bir emisyon için cucurbits, lupine veya avize, gibi tür bitki sınırlıdır, 19}. Son zamanlarda phloem analiz için uygun modeli sistemi olarak yağlı tohum tecavüz (Brassica napus) kurulmuş, ondan beri onun ' A. thaliana yakın akrabası ve birkaç microliters in phloem su için gösterilen küçük insizyon elde edilebilir yüksek saflıkta^4,8,20olması. Ayrıca, B. napus genom sırası 2014²¹yılında yayımlanmıştır.

Yaprak biti stylectomy dışında doku örnekleme sitesinde çevreleyen zarar açıklanan tüm phloem toplama yöntemleri içerir ve phloem sap bileşimi yaralanma yanıt olarak değişebilir. Bu nedenle phloem örnekleri, ne olursa olsun uygulanmış örnekleme kalitesini kontrol etmek için esastır. Toplanan phloem sap, örneğin belirlenmesi RNase etkinliği^22,23, RT-PCR ile astar Rubisco^8,24karşı veya şeker analizi tarafından kalite kontrolü için farklı yöntem vardır kompozisyon⁸.

Yalıtmak ve protein kompleksleri ayırmak için farklı yöntemler uygulanabilir, boyutu dışlama Kromatografi, sukroz yoğunluğu ultrasantrifüj veya örnek filtrasyon farklı molekül ağırlığı kesim ile membranlar yoluyla dahil olmak üzere off. Ancak, bu yaklaşımların yüksek çözünürlüklü izin vermez. İlk Schägger ve arktarafından açıklanan mavi yerel sayfa (BN SAYFALIK) olarak adlandırılan teknik. ²⁵, çözünürlük açısından üstün. Bu şekilde büyük yerli protein kompleksleri çeşitli organelleri veya hücresel lysates ve onların göreceli zenginliği^26,27moleküler ağırlıkları belirlemek için kullanıldı.

Daha fazla protein kompleksleri karmaşık bileşimi aydınlatmak için koşullar, karmaşık bileşenleri tam demontaj için önde gelen denaturing altında tek tek bileşenleri ayırmak gereklidir. Bu ikinci boyutu SDS-sayfa ^28,29 veya isoelectric (yardımcı) odaklanan ikinci bir boyuta göre ardından SDS-sayfa³⁰ third dimension ve sonraki tanımlaması daha yüksek çözünürlük elde etmek için elde edilebilir Kütle spektrometresi kullanılarak proteinler.

Bu protokol için saf phloem sap B. napus bitkilerden örnekleme ve protein kompleksleri BN-sayfa Tris-Tricine-üre-sayfa ve SDS-sayfa ile birleştiren bir 3D elektroforetik yaklaşım kullanarak böyle phloem örneklerinden analizini açıklar. Ayrılmış protein karmaşık bileşenleri daha sonra kütle spektrometresi kullanılarak tanımlanır. Buna ek olarak, biz mavi yerel Kuzey büyük RNP kompleksleri⁴' te, RNA'ların algılanmasını sağlayan bir yöntem olarak kurutma tanıtmak yaklaşımının uygulanabilirliği genişletme.

Protokol

1. örnekleme ve B. napus SAP'den phloem hazırlanması bitkiler ^4,8,20

1. Örnekleme phloem sap için iyi sulanan 8-hafta-yaşlı kullanın B. napus polen contaminations önlemek için bu gösteri sadece ilk çiçekli bitkiler.
2. Bir şırınga iğnesi kullanın (Ø 0.8 mm) ve punctate önümüzdeki birkaç kez kaynaklanıyor. Birkaç diğer önümüzdeki kaynaklanıyor ve yeterli phloem sap (şekil 2a) elde etmek için diğer bitkiler üzerinde yineleyin.
   Not: karmaşık analiz için phloem sap en az 600 µL ile başlatmak için önerilir. 4-5 bitkiler phloem sap 200 ila 700 µL arasında ortaya çıkarır.
3. Filtre kağıdı ile yaralı sitelerden ilk damla yok etmek. Bu damlalar esas olarak yaralı doku çevreleyen yüksek oranda kirlenmiş malzeme içeren ve atılacak gerekiyor.
4. Pipetting tarafından aşağıdaki damla toplamak ve toplanan çıktı önceden soğutulmuş konik 1,5 mL tepki tüp buz bir soğutma sistemi kullanarak-20 ° C'de depolayın.
5. Yok daha fazla damla oluşumu gözlemlenebilir ama 1 saat daha uzun kadar toplama devam. Bu yordamı, toplanan phloem sap önemli kaybı olmadan iki gün sonra tekrar edilebilir.
   Not: Toplanan phloem sap hemen kullanılabilir veya ilerideki analizleri için-80 ° C'de depolanan. -80 ° C depolama için şok-tepki tüp sıvı azot kıpırdama.
6. Phloem örnek yaklaşık 1/6^inci santrifüj yoğunlaştırıcıları (MWCO) 10.000 Dalton (Da) kesilmiş bir molekül ağırlığı ile kullanarak ilk birim için konsantre. Konsantre örnek 4 ° C ve 20.000 x g toz parçacıkları kaldırmak en az 15 dakika santrifüj kapasitesi.
   Not: Phloem sap toplama önemli bir protein kaybına yol açmaz.
7. Daha sonraki karmaşık analiz için adım 3.1 ile devam edin.

2. ters transkriptaz PCR (RT-PCR) ^4,8,20 ile phloem sap saflık kontrolü

1. --Dan phloem su sıvı madde için standart bir RNA ayıklama yöntemini kullanan toplam RNA izole (örneğin TRIzol veya fenol kloroform çıkarma isopropanol yağış sulu faz ve adımları göre yıkama etanol tarafından takip üreticinin iletişim kuralı).
   Dikkat: Fenol kloroform zehirlidir. Uygun bireysel koruma araçları ile bir örtünün altında çalışır. Ayıklanan RNA etanol-80 ° C'de altı aya kadar saklanabilir.
2. Dnaz ile sindirim tarafından DNA'ın kirlilik ben (1 u/µg) için 45 dk 37 ° C'de ve enzim için son bir konsantrasyon 5 mm EDTA ekleyerek devre dışı bırakın ve örnek için 10 dk. 75 ° C'de kuluçkaya.
3. Saf RNA almak için arındırmak ve örnek bir arıtma adım (RNA Temizleme kitleri, üreticinin yönergelerine göre kullanarakörneğin ) tarafından konsantre ol.
4. Ters transkriptaz PCR (RT-PCR) cDNA sentezi için 150 kullanarak cDNA sentez kiti ile gerçekleştirmek ng saf RNA'ın üretici tarafından açıklandığı gibi protokol.
   Not: CDNA-20 ° C'de daha fazla kullanılmasını kadar saklanır.
5. CDNA 5 µL yuvası özel transkript yükseltmek ve özel Jel Elektroforez tarafından kontrol için üretici tarafından belirtildiği gibi standart bir PCR reaksiyon için şablon olarak kullanın. Phloem örnekleri saflığı örneğin rubisco küçük alt birimi, thioredoxin h ve polen kat protein (Şekil 1b, Tablo 1) için primerler kullanılarak onaylayın.

3. mavi yerel sayfa ^4,25,26,31

1. Ya kendi kendine döktü yerli degrade jelleri açıklandığı gibi başka bir yerde²⁷ veya ticari Bis-Tris degrade jelleri kullanın.
2. En az 20-30 µg yoğun protein örneği iyi jel üzerine başına triplicates yük.
3. 4 ° C ve 150 V jel çalışmasını Örnek 1/3^rd jel (yaklaşık 20-30 dk, şekil 3a) geçti kadar koyu mavi katot tampon B ve anot tampon (Tablo 2) kullanarak.
   Not: Kuzey kurutma için bir tek jel lane, süre 3D sayfa ve kütle spektrometresi daha az bol protein konsantre olmaya en çok on jel şerit aynı gruptan birleştirmek için önerilen protein kompozisyon analizi için yeterlidir.
4. Çalıştır duraklatmak ve ışık mavi katot ile Satım koyu mavi katot tampon B B/10 (Tablo 2) tampon ve Çalıştır devam. Mavi açık dışarı jel (ca. 120 ile 180 dk, şekil 3a) elute başladığında Çalıştır jel bitirmek.
   Not: Bitmiş mavi yerli jel en az bir hafta için 4 ° C'de muhafaza edilebilir. Uzun süreli depolama bantları diffüz yol açabilir ve kaçınılmalıdır. Koyu mavi arabellek B yeniden kullanılabilir.

4. isteğe bağlı: Mavi yerel Kuzey kurutma ⁴ kullanarak RNA tespiti

1. Farklı bantları kesip veya tüm jel şeritli mavi yerli jel gelen kullanın onları yarı kuru 3,5 mA/cm² 60 dk için kurutma tarafından bir naylon membran transfer ve membran (şekil 4a) üzerinde bir kalem ile alt ve üst jel sınır işareti.
2. Kurutma sonra membran DEPC tedavi su ile yıkayıp kurulayın arasında iki filtreyi bildiri.
3. UV-zenginlikte membran ile 120.000 µJ/cm² polietilenin gerçekleştirmek (85 Crosslinker Malzemeler tablokullanıyorsanız s).
4. Membran hibridizasyon fırında (şekil 4a) 68 ° C'de 60 dk için hibridizasyon arabellek (ticari veya kendi kendine yapılan) 6 mL ile önceden melezlemek.
5. Hibridizasyon arabellek 3'-biotinylated sondalar 4 µL içeren bir ek 1 mL ekleyin (100 nM).
6. Membran ile probe gecede, 68 ° C fırında 37 ° C'ye soğutma kuluçkaya
7. Membran unspecifically bağlı probları kaldırmak için oda sıcaklığında 5 min için 2 x SSC ve % 0.1 SDS içeren bir arabellek ile yıkayın.
   Dikkat: SDS tahrişleri neden olabilir. SDS ve çözümler içeren SDS ile çalışırken eldiven ve önlük giymek.
8. 3'-biotinylated sondalar tespiti membran örneğin Streptavidin-HRP-eşlenik ve luminol ile hassas bir chemiluminescent reaksiyon (şekil 4a) kaynaklanan bir horseradish peroksidaz (HRP) substrat olarak gerçekleştirin.

5. ikinci Boyut: Tris-Tricine-üre sayfa ^4,28

1. Mavi yerli jel tek grup tüketim. Paralel şerit karmaşık proteinleri (şekil 5) daha fazla konsantrasyon ulaşmak için çalıştırmak örnekleri grup birleştirin.
   Not: 4 ° C'de daha fazla kullanılmasını kadar tek tepki tüplerde eksize gruplarından saklanabilir
2. % 12 Tris-Tricine-üre jel dökmek (kalınlığı 1 mm, 6.8 cm x 8,6 cm (genişlik x uzunluk)). 10 mL jel çözeltisi A ayıran jel (Tablo 2), için hazırlamak pour iki cam levha ve yerleşimi ile isopropanol arasında. Ve 4 mL jel ve 10 de tarak Ekle üzerine jel çözeltisi B (Tablo 2) yığın jel için transfer polimerizasyon tamamlandıktan sonra isopropanol çıkarın.
   Dikkat: Unpolymerized Akrilamid Nörotoksik olabilir ve TEMED Eğer inhale zararlıdır. Her zaman bireysel koruma araçları giymek ve bir başlık altında çalışma.
3. Eksize jel bantları 1,5 mL tepki tüp içine aktarmak ve SDS örnek arabellek için denge jel adet (şekil 5, Tablo 2) x 2 1 mL ekleyin.
   1. Örnekleri, oda sıcaklığında (95 ° C) bir Isıtma blok veya bir mikrodalga kaynar önce 10 min için kuluçkaya ve başka bir 15 dakika oda sıcaklığında tekrar örnekleri kuluçkaya.
   2. Aynı kompleks bir tek jel cebine temsil eden birkaç dengelenmiş jel adet yığını.
   3. Anot ve katot arabellekleri koşma vasıl 150 V 45-60 dk kullanarak Elektroforez gerçekleştirmek ve bütün jel lane tüketim.
4. Asidik arabellek (100 mM Tris, 100 mM Asetik asit) içinde 20 dk için kesme şerit kuluçkaya ve 125 mm Tris-HCl, pH 6.8 için başka bir 20 dk (şekil 5) equilibrate.

6. üçüncü Boyut: SDS-sayfa ^4,32

1. Jel Laemmli³² göre ayıran bir % 15 SDS dökün (kalınlığı: 1.5 mm, 6.8 cm x 8,6 cm (genişlik x uzunluk)) (Tablo 2) ve ince bir tabaka halinde % 4 jel yukarıdaki istifleme ekleyin.
   Dikkat: SDS, Akrilamid ve TEMED zehirli ve zararlı. Bir başlık altında iş ve kişisel koruyucu donanımları.
2. Dengelenmiş jel lane SDS jel üzerine transfer ve jel bromophenol mavi (şekil 5) izleme ile desteklenmiş arabellek çalışan 1 x SDS % 0,5 (w/w) özel ile kaplayın.
3. Arabellek önceden jel yükleme özel mikrodalga ile çalışan SDS kaynatın.
4. Moleküler ağırlık tek bileşenlerinin tahmin etmek için bir protein marker çalıştırmak, özel katılaşmış kadar jel bir ucunda filtre kağıt yerleştirin veya genellikle IPG jeller için kullanılan özel bir tarak kullanın.
5. Jel 150 V 60 dk ve leke için çalıştırılacak jel ile kolloidal Coomassie, gümüş leke veya herhangi bir diğer yöntemi daha sonraki kitle spektrometrik analiz için uygun boyama.
6. Matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma gibi kitle spektrometrik yaklaşımlar kullanarak görünür protein noktalar analiz zaman uçuş (MALDI-TOF) veya LC-MS/MS kütle spektrometresi.
   Not: Zaten olarak açıklanan³³boyama kolloidal Coomassie kullanmak için önerilir. Bizim ellerde daha az bol protein yeterince Boyanabilen ve makul veri kalitesiyle bir kitle spektrometrik analiz sağlar.

Sonuçlar

Burada protein: protein analizi sağlayan bir protokol mevcut yanı sıra protein: RNA kompleksleri Brassica napusphloem örnekleri içinde. İş akışını şekil 1' de gösterilmiştir. B. napus diğer canlılar bir büyük avantajı nispeten kolay phloem örnek koleksiyon önümüzdeki kök küçük delikler imkanı vardır. Bu saf phloem örneklerini nispeten büyük miktarda almak için sağlar. Phloem örnekleme zaman, her zaman contaminations için örneğin RT-PCR⁸tarafından kontrol etmek için tavsiye edilir. Saf phloem örnekten elde edilen bir temsilcisi sonuç Şekil 2' de tasvir edilir. Sinyal rubisco ve polen kat protein için görünmelidir ise sigara-kirlenmiş phloem örnekleri thioredoxin h, görünür bir bantını göstermelidir. Rubisco küçük alt birim bir denetim yaprakları, örnekleri olarak hizmet verebilir önümüzdeki kaynaklanıyor olsa veya polen. Polen kat protein transkript sadece çiçek tomurcuk örneklerinde görünür gerekirken onun mRNA farklı tür, phloem içinde bulundu beri Thioredoxin h tüm örnekleri, tespit olmalıdır. Contaminations phloem örnekleme tam çiçekli bitkiler (polen kat protein) veya delikler örnekleme phloem gelen ilk damlacıkları düzgün atılır değil gerçekleştirildiğinde oluşabilir (rubisco).

BN-sayfa önce phloem sap konsantre zorunluluğu vardır. 20-30 µg protein iyi kullanarak, en az dört büyük protein karmaşık bant B. napus phloem sap, çok düşük BN sayfa sonra görünür hale gelir veya çok yüksek konsantrasyonda kompleksleri (şekil 3) net bir ayrım izin vermiyor. Bu aynı kompleks bir tek cep daha da aşağı akım işleme ve sonraki kitle spektrometrik kimlik tek her karmaşık gelen proteinler konsantre için ikinci boyut jel içine temsil eden birkaç jel bantları yüklemek için tavsiye edilir.

Phloem makromoleküllerin kompleksleri bireysel bileşenlerini belirlemek için biz ilk BN SAYFALIK bir ikinci boyut Tris-Tricine-üre ile kombine ve bir üçüncü bir ayrılık tek protein elde etmek için SDS-sayfa boyut. Burada, yüksek çözünürlüklü bir ayrılık nedeniyle de üre ve SDS-sayfa jelleri farklı protein geçiş davranışları görülebilir. Genellikle, proteinler için tek bir kompleks ait jel arasında çapraz bir çizgi görünür. Proteinler sınırının altında daha hidrofilik olanlar²⁸ (şekil 5, şekil 6) temsil ise proteinler bu çizginin üzerinde artan bir hydrophobicity var.

RNP kompleksleri karakterizasyonu için BN Kuzey kurutma gerçekleştirmek için BN-sayfa jel bir parçası kullanılır. Bütün sokağın üstüne bir naylon membran ve çapraz UV radyasyon kurutma sonra RNA RNA özgü probları şekil 4' te gösterildiği gibi kullanarak görüntülenmeyecektir. Burada belirli bir tRNA sadece belirli bir kompleks mevcuttur gösterilir. Bu tRNA-bağlama kompleks protein bileşenleri yukarıda açıklanan 3D jel yaklaşım kullanarak daha fazla araştırılması. Kitle spektrometrik analizi bu tesis ne BN Kuzey Blot tarafından bulundu tRNA bağlama etkinliği onaylar özellikle tRNA ligazlar içerir gösterdi.

Şekil 1: iş akışı Ribonükleoprotein kompleksleri analiz yağlı tohum tecavüz phloem sap. Örnekleme ve phloem örnekleri hazırlanması sonra BN-sayfa yerel kompleksleri ayırmak için gerçekleştirilir. Böyle BN-sayfa jelleri nükleik asitler BN Kuzey Blot tarafından paralel analizi ve kütle spektrometresi tarafından kompleksleri protein bileşenlerinin tanımlaması izin verir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: örnekleme ve saflık kontrolü B. napusözlerinin phloem. 8-10 haftalık yağlı tohum tecavüz bitkiler steril bir şırınga iğnesi ile önümüzdeki kök delinme sonra çıktı bir pipet ile toplanır ve RT-PCR gerçekleştirilen phloem örnekleri saflığı onaylamak için bir buz gibi tepki tüp için (a) transfer, thioredoxin h, rubisco küçük alt birim ve polen kat protein özel doku örneklerinde (b) transkriptaz olmadan RT-PCR transkript yükseltecek denetimi (-) olarak gerçekleştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: BN-sayfa. Mavi yerel sayfa şematik gösterim konsantre phloem örnekleri ile B. napus. (a) 15-20 µL in konsantre phloem su ile degrade protein jel yükleme sonra BN-sayfa 1 x koyu mavi katot arabellek B 150 V 20-30 dk soğuk bir odada ile gerçekleştirilir. Daha sonra arabellek karşı 1 x ışık mavi katot tampon B/10 değiştirilir ve sayfa açık çalışır jel dışında çalışan koyu mavi kadar 150 V 120-180 dakika bitti. BN-sayfa jelleri dört farklı yüksek molekül ağırlıklı kompleksleri temsil eden dört farklı bant göster. (b) (c) çok az veya çok fazla (d) phloem proteinler yükleniyor bireysel kompleksleri görünürlüğünü azaltır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: BN Kuzey Blot. BN Blot yöntemi Kuzey şematik gösterimi. (a) bir lane BN sayfasının naylon membran yarı kuru Blot tarafından aktarılır. UV-çapraz ve öncesi hibridizasyon sonra membran biotinylated hibridizasyon fırında 3'-son gece boyunca olan RNA belirli problar (burada metiyonin tRNA özgü sonda), ile inkübe. Ücretsiz probları adımları yıkayarak kaldırılır ve RNA tespiti streptavidin-HRP eşlenik ve luminol tarafından yapılmaktadır. Bu yaklaşımı kullanarak, biz BN sayfasından karmaşık IV metionin içerir gözlenen tRNA. (b) lekeli Coomassie jel ve tRNA leke geçiş farklılıkları önlemek için paralel olarak çalıştır iki farklı jel şeritli benzer. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: 3D-sayfa. 3D-sayfa yaklaşım şematik gösterimi. Aynı kompleks birkaç grup BN-sayfa jel eksize, arabellek yüklenirken inkübe ve ikinci boyutu Tris-Tricine-üre-sayfa bir kuyunun içine aktarılır. Elektroforez sonra bütün jel şerit kesip, asidik asit arabellekte yıkanmış, equilibrated ve % 15 SDS-sayfa jel yerleştirilir. Üçüncü boyut sayfa sonra lekeli ve kütle spektrometresi tarafından analiz Coomassie ayrılmış proteinlerdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6: temsilcisi sonuçlar 3D-sayfa sonra. İlk boyut BN-sayfa içinde birkaç kompleksleri ortaya çıktı. Protein bileşenleri daha fazla bir diyagonal nokta şeklinde sonuçlanan iki sonraki denaturing sayfaları tarafından ayrılmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Sonda	Sıra
Thioredoxin h	İleri: CTCAAGGCAGCCAAAGAATC geriye doğru: ATGGCCTGAACATCGAACTC
Rubisco küçük bir zincir	İleri: TTCACCGGCTTGAAGTCATC geriye doğru: CCGGGTACTCCTTCTTGCAT
Polen kat protein BRU77666	İleri: TCAGAACTGGAGCTTCAACG geriye doğru: TTCCTTAATGGCCTCAGTGG

Tablo 1: phloem örnek saflık kontrolü için kullanılan astar. Phloem örnek saflık onaylamak için astar rubisco küçük bir zincir, thioredoxin h ve polen kat protein için özel cDNA amplifikasyon için kullanılabilir.

Arabellekleri ve çözümleri	İçerik		Yorum
koyu mavi katot arabellek B	15 mM Bis-Tris pH 7,0 50 mM Tricine %0,02 (w/v) Coomassie mavi G250		tarifi Fiala vd. 17 uyarlanmıştır pH 7,0 için ayarlanması gereken Arabellek 10 x stok olarak yapılabilir
hafif mavi katot arabellek B/10	15 mM Bis-Tris pH 7,0 50 mM Tricine %0,002 (w/v) Coomassie mavi G250		Arabellek katot katot arabellek Coomassie olmadan B önbellekle sulandrarak hazır olun
anot arabellek	50 mM Bis-Tris pH 7,0		Arabellek 10 x hisse senedi çözüm olarak hazırlanan
SDS örnek arabellek x 2	125 mM Tris-HCl pH 6.8 %4 SDS % 20 gliserol 0,2 M DTT %0,02 (w/v) bromophenol mavi
Aktarım arabellek 1 x TBE arabellek	89 mM Tris pH 7,6 89 mM Borik asit 2 mM EDTA		TBE tampon yapılan ve 5 x veya 10 x hisse senetleri depolanan. Kullanım RNase free deiyonize su için önemlidir.
SSC arabellek x 2	300 mM NaCl 30 mM Na3sitrat pH 7,0
3 x jel arabellek	3 M Tris 1 M HCl %0,3 SDS pH 8.45		Schägger 19 adapte tarifi
Tris-Tricine jel çözüm A	10 mL için: % 30 Akrilamid-bisacrylamide (29:1) 3.34 mL 6 M üre 3 x jel arabellek 3.34 mL % 70 gliserol 1.4 mL GKD2O 10 mL için eklemek % 10 APS 40 ΜL TEMED 4 ΜL		6 M üre ağırlık ve 3 x jel arabellek, Akrilamid-bisacrylamide çözüm ve % 70 gycerol ekleyin. Üre solubilize için bir su banyosunda 60 ° c ısı. GKD2O 10 mL, % 10 ekleyin APS ve nihayet TEMED polimerizasyon için.
Tris-Tricine jel çözüm B	6 mL için: % 30 Akrilamid-bisacrylamide (29:1) 0.8 mL 6 M üre 3 x jel arabellek 1,5 mL GKD2O 6 mL için eklemek % 10 APS 45 ΜL TEMED 4.5 ΜL		6 M üre ağırlık ve 3 x jel tampon ve Akrilamid-bisacrylamide çözüm ekleyin. Üre solubilize için bir su banyosunda 60 ° c ısı. GKD2O 10 mL, % 10 ekleyin APS ve nihayet TEMED polimerizasyon için.
Tris-Tricine çalışan arabellek (anot) x 1	100 mM Tris 22.5 mM HCl pH 8,9		Schägger 19 adapte tarifi
Tris-Tricine çalışan arabellek (katot) x 1	100 mM Tris 100 mM Tricine % 1 SDS pH 8,25		Schägger 19 adapte tarifi
Asidik arabellek	100 mM Tris 100 mM Asetik asit
%4 SDS yığın jel	2 mL için: GKD2O 1.4 mL % 30 Akrilamid-bisacrylamide (37.5:1) 0.33 mL 1 M Tris pH 6.8 0.25 mL % 10 SDS 20 ΜL % 10 APS 20 ΜL TEMED 2 ΜL
Jel ayıran % 15 SDS	10 mL için: GKD2O 2.3 mL % 30 Akrilamid-bisacrylamide (37.5:1) 5 mL 1.5 M Tris pH 8,8 2.5 mL % 10 SDS 100 ΜL % 10 APS 100 ΜL TEMED 4 ΜL
SDS çalışan arabellek x 1	25 mM Tris 192 mM glisin %0.1 SDS
Çözüm boyama Coomassie	%5 (w/v) alüminyum sülfat-(14-18)-hidrat % 10 (v/v) etanol (% 96) %2 (v/v) dezenfektan maddeler (% 85) %0,02 (w/v) Coomassie parlak mavi G-250
ULTRAhyb vericiyi hibridizasyon arabellek			Ambion, yaşam teknolojileri

Tablo 2: çözümler ve arabellek tarifleri. Liste-in tüm arabellekleri ve çözümleri 3D-sayfa analizi için gerekli.

Hayır nokta.	MW obs. [kDa]	Kimlik		Organizma	Hayır katılım.	MW [kDa]	Maskot puanı
CIV_1	130	Sözde hastalık direnci protein At4g19050		B. napus	CDX78917	131.1	110
CIV_2	130	Sözde hastalık direnci protein At4g19050		B. napus	CDX78917	131.1	89
CIV_3	100	Isı şok 70 kDa protein 14 gibi		B. napus	XP_013748865	89.9	113
CIV_4	90	Ökaryotik uzama faktör 2 Hücre bölünmesi kontrol protein 48 homolog A		B. napus B. napus	CDX90241 CDY41316.1	89,5 89,5	111 197
CIV_5	85	Isı şok protein 90-2-gibi		B. rapa	XP_009132342	79,8	172
CIV_6	80	Treonin--tRNA ligaz Glisin--tRNA ligaz		B. oleracea B. napus	XP_013599115 CDY43195	81,5 80.8	110 88
CIV_7	70	Isı şok protein 70 kDa Lizin - tRNA ligaz benzeri		B. oleracea B. napus	XP_013685267 XP_013747530	67,8 69.9	230 150
CIV_8	65	Myrosinase Aspartat--tRNA ligaz 2 Asparagine--tRNA ligaz 1		B. napus B. napus B. napus	ABQ42337 XP_013670803 XP_013729126	60.6 61.6 63,5	183 141 153
CIV_9	60	Myrosinase		B. napus	ABQ42337	60.6	164
CIV_10	55	Adenosylhomocysteinase 2 gibi		B. rapa	XP_009135865	53.1	139
CIV_11	55	Uzama faktör 1-alfa 1-gibi		B. oleracea	XP_013586115	51,9	161
CIV_12	50	Sistin liyaz CORI3 gibi		B. napus	XP_013653143	48.1	237
CIV_13	44	Sistin liyaz CORI3 gibi		B. rapa	XP_009108611	48.3	213
CIV_14	38	Fruktoz-bisphosphate aldolaz		B. rapa	XP_009115993	38.4	226
CIV_15	45	Sistin liyaz CORI3 gibi		B. rapa	XP_009108611	48.3	219
CIV_16	45	Sistin liyaz CORI3		B. rapa	CDY69765	46.9	209
CIV_17	38	Fruktoz-bisphosphate aldolaz		B. rapa	XP_009115993	38.4	124
CIV_18	18	Peptit-prolyl CIS-trans izomeraz CYP18 3 gibi		B. napus	XP_009101932	18,3	128
CIV_19	45	Sistin liyaz CORI3 gibi		B. rapa	XP_009108611	48.3	177

Tablo 3: tanımlanan protein bileşenler karmaşık IV. Birkaç tRNA ligazlar ve daha fazla protein tRNA bağlayıcı kompleksi içinde bulunan 3D-sayfa sonra kitle spektrometrik analizi MALDI-TOF kullanarak.

Tartışmalar

Photoassimilates için ana ulaşım yol teşkil eder ve aynı zamanda uzun mesafe farklı bitki parçaları^9,20,34arasında^{sinyal için önemlidir beri phloem bir kompartıman yüksek ilgi var, 35}. Küçük moleküller yanı sıra oluştururlar protein ve RNA gibi phloem bakım ve sinyal^4,7,8ile karıştığı olmuştur. Phloem kompozisyon analizi tarafından sınırlı erişilebilirlik çoğu bitki türü phloem örnekleri için sınırlıdır. Böcek stylet tekniği yaygın olarak uygulanabilir, ancak deneysel olarak talep ve phloem örnekleri¹¹çok küçük miktarlarda. Phloem örnekleme için kullanılan bir kolay EDTA kolaylaştırdı reaksiyon¹²tekniğidir. EDTA divalent iyonları kalsiyum gibi chelates ve böylece P-proteinler ve callose elek plakaların kapanış engeller. Bu kullanımı kolay, ancak kirlenme hasarlı hücreleri tarafından eğilimli ve örnekleri seyreltilmiş. EDTA tarafından divalent iyonları tüketen da varolan kompleksleri bir arıza neden olabilir. Ancak, örnekleme tür model bitki A. thaliana¹⁵dahil geniş bir dizi sağlar. İn phloem su kendiliğinden reaksiyon yalnızca az sayıda bitki türleri içinde oluşur. Bitki doku¹⁰önemli yaralanma içerir invaziv bir yöntemdir. Son zamanlarda şehirlerarası ulaşım^4,8,20eğitim için bir modeli tür olarak B. napus kurulmuş. Burada, phloem sap küçük kesik, yaralama etkileri ve kirlenme kaynakları azaltan tatmak mümkündür.

Farklı örnekleme teknikleri kullanarak, farklı bitki türü phloem örnekleri Proteom son yıllarda^7,8,17,36,37içinde^, araştırmış ^38,39. Bu Proteom çalışmalar için proteinler çıkarılan ve koşulları denaturing altında çöktürülmüş ve bu nedenle protein: protein ve protein hakkında sonuçlar izin verme: nükleik asit etkileşimleri mevcut yerel koşullar altında. Co-immunoprecipitation (COIP) ve bindirme deneyleri belirtilen büyük Ribonükleoprotein karmaşık phloem sap kabak⁴⁰mevcut, ama o herhangi bir makromoleküllerin kompleksleri içinde yerel koşullar altında bulunduğunu gösterilmiştir değil phloem sistemi.

Schägger ve ark. tarafından tanıtılan mavi yerel sayfa ²⁶, sonraki yüksek çözünürlüklü Jel Elektroforez adımları ile birlikte büyük protein kompleksleri her bileşeninin ayrılması etkinleştirin. Yerel B. napus 3D-sayfa analizleri kullanarak phloem çıktı, biz son zamanlarda göstermek birkaç yüksek molekül ağırlıklı protein: protein ve RNP kompleksleri phloem örnekleri var ve enzimatik aktif⁴vardır. RNPs yanı sıra protein kompleksleri boyutu dışlama Kromatografi gibi izole etmek için alternatif yöntemler var ama BN-sayfasına göre çözünürlük açısından başarısız. Ayrıca, karmaşık ayrılık makul kalitesi için boyutu dışlama sütun matrisler soruşturma altında genel olarak karmaşık moleküler ağırlık göre adapte olmak zorunda. Farklı büyüklükte konut projeleri analiz bu nedenle yoğun maliyet ve BN sayfası olarak yüksek odaklama gücü olarak izin vermez sütunları farklı türde talep edecek.

Kompleksleri B. napus üzerinden analiz etmek için kritik adımlar phloem sap malzeme başlangıç olarak kullanılan toplam miktarı içerir. Phloem örneği en az 600 µL gerekli olan ve beş iyi sulanan bitkilerden elde edilebilir. 3D-sayfa ve BN Kuzey kurutma için ilk BN jel phloem örnekleri yeterli miktarda ile başlatmak gereklidir. 20-30 µg protein her içine de ve en az yüklenebilir kadar bunu başarmak için phloem örnekleri triplicates aynı örneği paralel olarak çalıştır yoğunlaşmıştır. Çok düşük veya çok yüksek konsantrasyonları kompleksleri (şekil 3) algılanmasını azaltır. Phloem örnekleri içine buz üzerine tepki boruları toplanması ve daha sonra kullanmak üzere protein yıkımı ve ciro önlemek donmuş muhafaza edilmelidir. Proteaz inhibitörleri analiz bütün phloem proteomes bulduk, ama aynı zamanda tam etkin bir proteasome B. napus⁴phloem içinde tanımlanmıştır. Ayrıca, birim ve phloem örnekleri bileşimi örnekleme süresi-noktası ve çevre koşulları¹⁰bağlıdır. Bu nedenle benzer koşullar altında günün aynı zamanda toplamak için özen göstermelidir. Stres Tedaviler (örneğin kuraklık) toplanabilir phloem miktarını azaltabilirsiniz. Tek proteinler tarafından kütle spektrometresi tanımlamak için olası keratin contaminations tarafından giyen eldiven her zaman sınırlamak için zorunludur. Keratin ek sinyallere kitle spec Çözümleme sırasında yol açar ve protein kimlik engellemektedir. BN-sayfa daha yüksek bir voltaj veya ortam sıcaklığı çalışan Isıtma kırılgan kompleksleri sökme içinde sonuçlanabilir jel yol açabilir.

Burada sunulan Protokolü protein: protein kompleksleri analiz için uygundur. Ayrıca paralel komplekslerinde yer alan belirli RNA'ların algılamak için kullanılabilir gösterir. Bunu başarmak için biz yeni bir protokol BN⁴kurutma Kuzey tanıttı. RNA'ların RNAse contaminations tarafından bozulması yatkındır. Bu tür bozulma sınırlamak için DEPC-tedavi, su kullanılmalıdır.

Sunulan yönteminin ana sınırlamalarını boyut, şekil ve ardından değişiklikleri kompleksleri^{31bile geçiş davranışını bağlıdır beri BN-PAGE tarafından ayrılmış protein kompleksleri molekül ağırlığı tahmini dahil, 41}. RNP kompleksleri boyut tahmini nükleik asitler etkisi geçiş davranışı nedeniyle daha karmaşıktır. Bu da kompleksleri aynı boyutta bir tek grupta birlikte geçirmek önlenebilir değil. Bu karmaşık besteleri hatalı tahmin için yol açabilir. Bu nedenle tamamlayıcı teknikleri ile gözlenen etkileşimleri doğrulama, örneğin fonksiyonel deneyleri⁴,-ebilmek var olmak gerekli. Ayrıca sadece zayıf veya geçici bir makromoleküllerin karmaşık ilişkili proteinler kullanılan BN arabellekte kaybetmiş. Bunu önlemek için örnekleri çapraz, ne de eserler neden olabilir ya da protein tanımlama, engel olabilir veya arabellek koşulları optimize edilebilir.

Klasik 2D-sayfa, aksine kasanın üre SDS sayfa, hydrophobicity ve molekül ağırlığı isoelectric noktası (PI) ve molekül ağırlığı ²⁸yerine göre ayırma verir ve proteinler için ayırma sınırı yok bir belirli pI aralığı. Benzer Klasik 2D sayfa, ayrılmış proteinler, ama tek noktaları olarak görünür bir çapraz çizgi ^4,28 (şekil 5, şekil 6). Hidrofilik proteinler daha satır²⁸bulunur, ancak daha fazla hidrofobik proteinler bu çapraz, yukarıda noktalar görünür. Bu protokol için kullanılan polyacrylamide konsantrasyonları proteinler arasında 25-80 kDa de ayıracak. Bir ayrılık daha küçük veya daha büyük proteinlerin polyacrylamide izin vermek için konsantrasyon değiştirilebilir veya Degrade jelleri üçüncü boyutu kullanılabilir. 3D-sayfa (şekil 6) tarafından ayrılmış bileşenleri karmaşık IV (şekil 3) dışarı, sindirmek ve kütle spektrometresi tarafından analiz tripsin kesilmiş. Bu birkaç tRNA ligazlar tanımlaması içinde sonuçlandı. Diğer kompleksleri bileşenlerinin olmuştur son ⁴yayınlandı. 3D SAYFAMIZI farklı ligazlar, yani aspartat, asparagine, treonin, benzer moleküler ağırlıkları (Tablo 3) ile lizin ve glisin ligazlar ayrılması etkin. Metiyonin tRNA özgü sonda kullanarak, biz karmaşık IV içinde potansiyel olarak ilişkili tRNA algılamak başardık, ama tam uzunlukta tRNA veya tRNA parçaları karmaşık ise kullanılan problar ile ayrımcılık yapamam. Nükleik asitler gerçekten kompleksi içinde ilişkili ve eş geçirme iseniz, proteaz phloem sap sindirilmiş kontrol etmek için örnekleri uygun geçiş denetimleri hizmet verebilir.

Bu daha önce hemen hemen çoğu bileşen tüm ribozom hem de uzatma faktörlere phloem örnekleri^4,7' bulduğumda protein çeviri phloem elek tüpler içinde oluşabilir spekülasyonlar. Bizim bulma tRNA ve tRNA ligazlar bu fikri destek gibi görünüyor. Ancak, tRNA parçaları kabak phloem örnekleri mevcut çeviri⁴² güçlü inhibitörleri olduğu gösterilmiştir ve fonksiyonel ribozomlara çeviri yer alamaz düşündüren⁴, görünmektedir.

Birlikte ele alındığında, burada sunulan Protokolü yerli protein: protein ve phloem örnekleri ve ayrılık bile RNP kompleksleri ayrılması ve yüksek çözünürlüklü bireysel bileşenleri tanımlaması sağlar. Bu yöntemin uygulama keşif phloem örneklerinde RNP kompleksleri ve roman protein sağlar ve bu nedenle bu çok özel bitki yerde yeni işlevler aydınlatmak.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL reaction tubes	Eppendorf	30120086
10 well comb for SDS PAGE, thickness 1 mm	BioRad	1653359
2-Propanol	AppliChem	131090
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (29:1) solution	BioRad	1610156
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (37.5:1) solution	BioRad	1610158
96 % Ethanol	Carl Roth	P075
Acetic acid	Carl Roth	6755
Agarose	Lonza	50004
Aluminum sulfate-(14-18)-hydrate	AppliChem	141101
Ammonium peroxodisulfate (APS)	Carl Roth	9592.3
Bis-Tris	AppliChem	A3992
Boric acid	AppliChem	A2940
Bromophenol blue	AppliChem	A2331
Centrifugal concentrators e.g. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa)	Sartorius	VS0102
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit	Thermo Fisher Scientific	89880
Chromatography papers e.g. 3 mm CHR	Whatman	3030-153
CoolBox M30 System	Biocision	BCS-133
Coomassie brilliant Blue G-250	AppliChem	A3480
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	AppliChem	A0881
Dithiothreitol (DTT)	AppliChem	A1101
DNase I	AppliChem	A3778
Ethanol abs.	AppliChem	A3693
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	AppliChem	A1103
Gel Imaging system e.g. Chemidoc Touch	BioRad	1708370
GeneRuler 1kb plus	Thermo Fisher Scientific	SM1331
Glycerol	AppliChem	141339
Glycine	AppliChem	131340
Heating block TS1	Biometra	846-051-500
Hybridization oven e.g. GFL Hybridization Incubator 7601	GFL	7601
Hypodermic needle (0.8 mm)	B Braun	4658309
IPG gel comb, thickness 1 mm	BioRad	1653367
Labeling of RNA e.g.Biotin 3'end DNA Labeling Kit	Thermo Fisher Scientific	89818
Native gradient gel e.g. Novex NativePAGE 4–16% Bis-Tris protein gel	Invitrogen	BN1002BOX
Nylon membrane e.g. Hybond-N+	Amersham Pharmacia	RPN203B
Ortho-phosphoric acid	Carl Roth	6366.1
PageRuler prestained protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616
Power supply for Gel electrophoresis EPS	Amersham Pharmacia	18-1130-01	available from GE Healthcare
RNA Cleanup Kit	Qiagen	74204
Semi dry blot e.g. Fastblot 43B semi dry Blot	Biometra	846-015-100
Sodium chloride (NaCl)	AppliChem	A1149
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	AppliChem	142363
Synthesis of cDNA e.g. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific	K1621
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	AppliChem	A1148
Tricine	AppliChem	A3954
Tris	AppliChem	A1086
Tri-sodium citrate dihydrate	AppliChem	A3901
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026
ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer	Thermo Fisher Scientific	AM8670
Urea	AppliChem	A1360
UV Crosslinker e.g. Stratalinker 2400	Agilent	NC0477671	from Fisher Scientific
Vertical electrophoresis apparatus e.g.The XCell SureLock Mini-Cell or Mini-Protean III System	Thermo Fisher Scientific or BioRad	EI0001 or 1658004
Wipers e.g. KIMWIPES Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark	34120