JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, bir iletişim kuralı modülasyonu intrakardiyak otonom sinir sistemi ve temel Elektrofizyoloji, arrhythmogenesis ve ex vivo Langendorff kurulumu kullanarak kamp dinamikleri üzerindeki etkisi değerlendirilmesi için mevcut.

Özet

Geç 19 yy onun icat beri Langendorff ex vivo kalp perfüzyon sistemi fizyolojik, biyokimyasal, morfolojik ve farmakolojik parametrelerinde geniş bir yelpazede eğitim için uygun bir araç olmaya devam ediyor Merkezi olarak denervated kalpler. Burada, modülasyon intrakardiyak otonom sinir sistemi ve temel Elektrofizyoloji, arrhythmogenesis ve siklik adenozin monofosfattır (kampı) dinamikleri üzerindeki etkisi değerlendirmesi için bir Kur açıklayın. İntrakardiyak otonom sinir sistemi tarafından hangi fare gangliyon bulunduğu esas olarak atriyal yağ yastıkları diseksiyon mekanik modülasyonlu — veya küresel yanı sıra hedeflenen farmakolojik müdahalelerin kullanımına göre. Bir octapolar elektrofizyolojik kateter sağ atriyumu ve sağ ventrikül tanıtıldı ve epicardial yerleştirilen çoklu elektrot dizilerin (MEA) yüksek çözünürlüklü eşleme kardiyak Elektrofizyoloji ve arrhythmogenesis belirlemek için kullanılır. Imaging Förster rezonans enerji transferi (FRET) kamp düzeyleri farklı kalp bölgelerdeki gerçek zamanlı izlenmesi için gerçekleştirilir. Neuromorphology aracılığıyla boyama kılavuzu tanımlama ve modülasyon gerçekleştirilen çalışmalarda intrakardiyak otonom sinir sisteminin belirli hedefleri için nöronal işaretçileri kullanarak tüm kalplerin antikor tabanlı incelenmiştir. Ex vivo Langendorff Kur tekrarlanabilir deneyler kısa bir süre içinde çok sayıda olanak sağlar. Yine de, kısmen açık yapısı yapısı (Örn., MEA ölçümler sırasında) sabit sıcaklık kontrolü zor hale getirir ve minimumda tutulmalıdır. Açıklanan bu yöntemi analiz ve adem-i merkeziyetçi kalpler intrakardiyak otonom sinir sisteminde modüle olanak sağlar.

Giriş

Langendorff ex vivo kalp perfüzyon sistemi fizyolojik, biyokimyasal, morfolojik geniş bir yelpazede gerçekleştirmek için ilgili bir araç olmaya devam etmektedir ve hearts1,2 denervated merkezi olarak Farmakolojik çalışmalar beri onun buluşu geç 19inci yüzyıl6' ,3,4,5 . Bugüne kadar bu sistem hala yaygın olarak çeşitli konular için kullanılır (Örn., iskemi reperfüzyon) veya çalışmaya kalp farmakolojik etkileri7,8ve kardiyovasküler araştırma temel bir araçtır. Uzun ömürlü bu yöntemin sonuçları çeşitli yararları (Örn., ölçümleri merkezi sinir sistemi veya diğer organları, sistemik dolaşımı veya dolaşan hormon etkisi gerçekleştirilir). Gerekirse, eczacılık denetimli bir biçimde perfüzyon arabelleğe eklenemez veya belirli yapılara doğrudan uygulanan. Deneyler tekrarlanabilir ve deneyler nispeten yüksek bir dizi kısa bir sürede gerçekleştirilebilir. Belgili tanımlık tertibat (kısmen) açık yapısı sıcaklık regülasyonu zor ve dikkate alınması gereken yapabilirsiniz. Langendorff sistem daha büyük tür9' da kullanılsa da daha az karmaşık ve büyük bir biyolojik çeşitliliğine deneysel Kur olduğu gibi daha küçük hayvanlar öncelikle kullanılır (Örn., transgenik fare modelleri) kullanılabilir.

Bu iletişim kuralı deneysel kurulumunda, intrakardiyak otonom sinir sisteminin temel elektrofizyolojik parametreleri, ventriküler arrhythmogenesis, epicardial ve tel ve siklik adenozin monofosfattır (kampı) dynamics biri olarak değerlendirildi. Ya bozulmamış veya el ile kaldırıldı dikkatli makine ile sol atriyal yağ yastıkları esas olarak bulunan ve şimdi kardiyak Elektrofizyoloji merkezi sinir denetiminden bağımsız kontrol etmek için bilinen, intrakardiyak gangliyon, çok sayıda vardır diseksiyon. Farmakolojik bir modülasyon otonom sinir sisteminin genel olarak perfüzyon arabelleğe Eczacılık ekleyerek veya atriyal gangliyon hedeflenen modülasyon tarafından yerel olarak gerçekleştirilir. Tüm kan hücreleri boyama kalitesini artırabilir sürekli perfüzyon nedeniyle kaldırıldı olarak deneyler sonra kalpleri bir immunohistological değerlendirme için de uygundur.

Açıklanan teknikleri genel amacı kardiyak Elektrofizyoloji ve fare kalbinde arrhythmogenesis otonom sinir sisteminin etkisi konusunda ayrıntılı çalışmalar için yeni perspektifler sunmaktır. Bu tekniği kullanmak için bir neden çalışma ve otonom sinir sistemi merkezi sinir sistemine etkisi olmadan değiştirmek mümkün olmasıdır. Bir büyük avantajı kolay istihdam farmakolojik deneylerinde potansiyel pro - ya da antiarrhythmic özellikleri eski ve yeni acentalar test. Buna ek olarak, transgenik ve nakavt fare modelleri çeşitli kardiyak hastalıkların aritmiler, kalp yetmezliği veya metabolik hastalıkların altında yatan mekanizmaları incelemek kullanılabilir. Bu yaklaşımı otonom sinir sistemi atriyal düzeyde ventrikül kardiyak Elektrofizyoloji ve aritmiler indüksiyon nasıl etkileyebilir bizim anlayış geliştirmiştir.

Protokol

Hayvanları içeren tüm yordamları devlet Hamburg, Hamburg Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanımı komiteler yerel yetkilileri tarafından kabul edildi.

1. Langendorff aparatı hazırlanması

Not: Piyasada bulunan bir Langendorff perfüzyon sistemi kullanılır.

  1. Değiştirilmiş bir Krebs-Henseleit çözüm (119 mM sodyum klorür, sodyum bikarbonat, potasyum klorür, potasyum fosfat Yem mono, magnezyum sülfat, kalsiyum klorür, glikoz 8.3 mM ve sodyum 2 mM, 2.5 mM 1,1 mM 1.2 mM 4.6 mM, 25 mM hazırlamak pyruvate). % 95'i oxygen/5% karbondioksit karışımı kalsiyum yağış önlemek için perfüzyon ekleyin. Gözenek boyutu 0,22 µm olarak arabellek filtre.
  2. Farmakolojik Ajan kalp Elektrofizyoloji ve gerektiği gibi arrhythmogenesis üzerindeki etkisini araştırmak için tampon ekleyin.
  3. Su banyosu başlatmak ve % 95 oxygen/5% karbondioksit karışımı dahil perfüzyon çözüm yerleştirin. ~ 37 ˚C kanül önce doğrudan perfüzyon çözüm sıcaklığıdır su banyosu, sıcaklığı ayarlayın.
  4. Silindir pompa başlatmak ve en kısa zamanda doğru sıcaklık ulaşıldığında aparatı ile perfüzyon çözüm doldurun.
  5. Böylece hiçbir hava kabarcıkları kanül içinde ne zaman için aparatı montaj bırakılır pompa hızı kalp eklemeden önce ayarlayın.

2. zor - ve yazılım hazırlık

  1. Dijital veri toplama sistemi ve ilgili yazılımı perfüzyon basıncı, akış hızı ve kalp hızı sürekli bir kayıt için Langendorff aleti bağlayın.
    1. Hedeflenen perfüzyon basıncı 80 mmHg için genel ayarları ayarlayın.
    2. Kayıt işlemini başlatmak.
  2. Elektrofizyoloji kateter (Tablo reçetesi) platin elektrotlar, 0.5 x 0.5 mm bir elektrot yüzeyi ve bir elektrot aralığı 0.5 mm ile veri kayıt ve stimülasyon için belirlenen dijital uyarıcı jeneratör ile kullanın.
    1. Nerede kalp cihazları eki sonra yerleştirilmiş olacaktır bölgesi kateter yerleştirin.
    2. Sonda 2 elektrotlar seçerek stimülasyon hazırlamak ve bir döngü uzunluğu 100 ms kullanın.

3. kalp hazırlanması

  1. Soğuk (~ 2-4 ˚C) eklemek perfüzyon arabellek (10-20 mL ve 40-50 mL, böylece bütün çanak kaplıdır) buz üzerinde 2 Petri yemekler (çapı 6 cm ve 10 cm) ve yeri ve kanül ile çanak doğrudan sonraki ve mikroskop altında. Çift düğüm kanül çevresinde hazırlayın.
  2. Hızla kalp sonra servikal çıkığı Mayo makas ve dar desen forseps kullanarak toraks açarak tüketim. Sonra Londra forseps kullanarak diyafram yukarıda vena kava ve aort kavrama ve kalp-akciğer blok tüm damarları ve omurga yakın bağ dokusu şaşılık makasla keserek tüketim.
  3. Buz gibi soğuk arabellek ile dolu kalp-akciğer bloğu ilk çanak (6 cm çapında) içine aktarmak ve akciğerleri şaşılık makas ve Londra forseps kullanarak kalp zarar vermeden dikkatli bir şekilde çıkarın. Mikroskop altında kalp yerleştirin ve timus, yemek borusu ve trakea bahar makas ve Dumont SS forseps kullanarak dikkatli bir şekilde çıkarın.
  4. 1.5-2 mm sağ atrium Kateter yerleştirilmesi için üst kısmında bir delik için bahar makas kullanın. Pulmoner arter delik. Daha sonra aort supraaortic dalları altında doğrudan kesmek ve düğüm kolayca eklenebilir böylece aorta dokuyu.
  5. Atriyal yağ yastıkları devam edin, Binbaşı da dahil olmak üzere atrially ganglionated Pleksi, sol atriyum sağlam çevresinde bulunan veya tamamen tarafından dikkatli diseksiyon kaldırmalısınız.
  6. Kanül ile çanak kalp aktarmak ve mikroskop altında yerleştirin. Aort kanülü üzerinde Dumont SS forseps ile çekin ve aort etrafında sıkıca hazır düğüm kravat. Böylece aort kapak ve Koroner damarları serbest bırakılır kanül aort çok derine yerleştirilen değil emin olun.
  7. Kanül Langendorff cihazlar için hızlı bir şekilde takın. Kanül yaptı hava kabarcığı yok olduğundan emin olun.
  8. Perfüzyon basıncı sabit basınç perfüzyon izin 80 mmHg için geçiş.
  9. Kateter dikkatli bir şekilde sağ atriyumu ve sağ ventrikül dokunmadan veya kalp zarar takın ve bant ile kanül kateter takın.
  10. Stimülasyon 100 ms hazır döngüsü uzunluğu için bir ilk 20 dk denge dönem başlangıcı.
  11. İstikrarlı bir sıcaklık izin vermek için odası kapatın.

4. elektrofizyolojik parametreleri ve Arrhythmogenesis

  1. Elektrofizyolojik parametreleri aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi değerlendirmek için iki kez atriyal veya ventriküler pacing eşik, kateterin distal veya proksimal elektrotlar ile programlanmış bir stimülasyon uygulanır.
    1. 10 sonrası maksimum dönüş döngüsü uzunluğu olarak sinüs düğümü toparlanma süresini belirlemek s sabit oran bir S1S1 döngü uzunluğu 120 ms, 100 ms ve 80 ms pacing.
    2. Uzun S1S1 döngüsü uzunluğu (8 uyaranlara; Wenckebach çizilmeye başlanacağı noktayı belirlemek S1S1: 100 ms; 2 ms kademeli azaltma) 11 AV nodal iletim kaybı ile. En uzun S1S2 olarak Atriyoventriküler nodal ateşe dayanıklı nokta belirlemek (12 uyaranlara; S1S1: 120 ms, 110 msn ve 100ms; kısa bir extrastimulus 2 ms kademeli S1S2 azalması ile birleştiğinde) AV nodal iletim kaybı ile.
    3. En uzun S1S2 olarak atriyal ve ventriküler ateşe dayanıklı nokta belirlemek (12 uyaranlara; S1S1: 120 ms, 110 msn ve 100ms; kısa bir extrastimulus 2 ms kademeli S1S2 azalması ile birleştiğinde) yok atriyal veya ventriküler Yanıt ile10,11.
  2. Programlanmış bir extrastimulation gerçekleştirmek (S1S1: 120 ms, 100 ms ve 80 ms tarafından 3 ekstra vuruş; takip, 60-20 ms 2 ms kademeli azaltma ile) veya protokoller pacing patlama (5 S1S1 s: 50-10 ms ile 10 ms kademeli azaltma) eva için Lambeth kuralları doğrultusunda luate ventriküler arrhythmogenesis10,11,12.

5. epicardial ve tel ölçümleri

Not: tek kutuplu epicardial electrograms yüksek çözünürlüklü eşlemesi için 25 kHz örnekleme oranı ile 128-kanal, bilgisayar destekli kayıt sistemi kullanarak kaydedin. 32 bir çoklu elektrot kullanın (MEA; arası elektrot mesafe: 300 µm; 1,8 x 1,8 mm). Not veri edildi bant (50 Hz) filtre ve 12 bit ve 20 sinyal aralığı ile sayısallaştırılmış mV.

  1. Bana kalp belirlenmiş alanda yer ve topraklama kalp13,14,15başka bir bölümüne ekleyin.
  2. Bana yakın bir epicardial stimülasyon kateter yerleştirin ve sabit bir stimülasyon başlar.
  3. Genlik ve sinyal kalitesini kontrol ederek iyi temas elektrotlar, onay alındıktan sonra kaydetmeye başlamak.
  4. Çevrimdışı bir analiz dalga yayılma hızı ve dağılım ve tel yönde belirlenmesi için kullanın.

6. Förster rezonans Enerji Transfer FRET tabanlı siklik adenozin monofosfattır (kampı) görüntüleme

Not: CAG-Epac1-kampları transgenik fareler16kalpler FRET tabanlı ölçümleri için hasat.

  1. Bir stereomicroscope15,17etrafında kendi kendini inşa bir görüntüleme sistemi kullanın.
  2. Stereomicroscope kalp önünde yerleştirin ve keskinliği için ayarlayın.
  3. Bir ışık kaynağı ile kamp sensör heyecanlandırmak [Örneğin, bir tek-dalgaboyu ışık yayan diyot kullanımı (440 nm)]. Bir ışın ayırıcı (Camgöbeği floresan protein/sarı floresan protein çifti, kullan bir 565dcxr Dikroik ayna ve D480/30 ve D535/40 emisyon filtreleri) kullanarak donör ve alıcısı kanal içine ışık emisyon bölün.
  4. İstikrarlı bir sıcaklık odası plastik bir şal koyarak olun.
  5. Bilimsel tamamlayıcı metal oksit-yarıiletken (sCMOS) kamera kullanarak görüntü alabilir. Işık kaynağı ve kamera görüntüleme yazılımı mikro-Yöneticisi gibi bir açık kaynak ile görüntü yakalama koordine etmek.
  6. Resim alma başlatmak için Multi-D almaitin. düğme ve hızlandırılmış kadar hangi bir görüntü edinme her 10 ayarla s, floresan sinyal (yaklaşık 100 ms) gücüne bağlıdır uygun çekim hızı ile.
  7. Daha önce açıklanan ve mevcut online FRET ve online 2 FRET eklentileri17 görüntü iki kanal içine bölünmüş, faiz bölgeleri seçin ve oranı izleme izlemek için kullanın.
  8. Satın alma sırasında deneme yapısına bağlı olarak farklı maddeler içeren değiştirilmiş Krebs-Henseleit çözüm ile kalp sıvı.
  9. Deney sonunda, satın alma Durdur düğmesine basarak geçin ve görüntü yığınını kaydetmek.
  10. İki özdeş bölümler için donör ve alıcısı kanalları görüntüleri bölebilirsiniz ve birden çok bölge-in-ilgi FRET analiz gerçekleştirebilirsiniz bir özel analiz yazılımı kullanarak çevrimdışı FRET veri analiz.
    Not: Bir özel eklenti (çevrimdışı FRET), hangi Sprenger vd içinde sağlanan gereklidir 17.
    1. Yazılımını başlatın. Analiz eklentileri menüsüne giderek açın, sonra kartve daha sonra Mikro-Yöneticisi dosya aç'ıtıklatın.
    2. İki özdeş resim CFP ve YFP kanallar için hızlandırılmış ayrılmıştır için çevrimdışı FRET eklentisi çalıştırmak.
    3. YFP görüntü ilgi bölgenin işaretlemek için Serbest seçim aracını kullanın. Seçimi Çok ölçü penceresine eklemek için Ekle düğmesine basın.
    4. Faiz Multi ölçü birimi penceresinde bölge seçin ve bir tablo her çerçeve ve bölge için Ortalama gri değerleri elde etmek için çok tuşuna basın. Kopyalayın ve tüm verileri bir Excel sheet yapıştırın.
    5. CFP görüntü yığınıüzerinde'yi tıklatın. CFP yığını için adım 6.10.4 olduğu gibi aynı işlemleri ve ortalama gri değerleri aynı Excel sayfası yapıştırın.
  11. Taşma payı ile faktör bağış için ham verileri çevrimdışı alıcısı kanal17düzeltmek.
    1. B. kanama yoluyla faktör nerede aşağıdaki formülü kullanın:
      Oranı = (YFP - B x CFP) / CFP
    2. Taşma payı üzerinden faktörü B CFP sadece ifade bir kalp Imaging tarafından belirlemek ve donör floresan YFP kanaldaki yüzdesi ölçmek (B = YFP / CFP).

7. Neuromorphology

Not: bütün-mount immunostainings olduğu gibi fare kalplerin intrakardiyak otonom sinir sistemi çözümleme. Not çoğu intrakardiyak gangliyon epicardial yağ dokusu pulmoner damarlar yakın lokalizedir.

  1. Farklı stainings kullanımı neurofilament (genel nöronal yapıları; tavuk anti-NF-H, 1:3, 000), gösterimi için tirozin hidroksilaz (TH, sempatik nöronal yapıları; tavşan α TH, 1:1, 000) ve kolin asetiltransferaz (sohbet, parasempatik nöronal yapıları; keçi α sohbet, 1:50).
  2. Perfüzyon Langendorff aparatı içinde sonra fare kalpler 24 h için formalin 10 mL fix ve fosfat tamponlu tuz (PBS) 4 ˚C, içinde depolayabilirsiniz.
  3. Dent'in çamaşır suyu kalbimizde bleach (4:1:1 metanol: hidrojen peroksit çözüm %30 (w/w) H2O: dimetil sülfoksit (DMSO)) 4 ˚C 1 haftadır ve onları daha sonra rehydrate PBS'ye metanol PBS içinde azalan bir dizi (% 100, % 75, % 50, % 25; 1 h) 18.
  4. Aşağıdaki incubations 24-iyi-plaka kartvizitlere 4 ˚C, nazik bir ajitasyon ile gerçekleştirin:
    1. % 1 kalbimizde permeabilize Triton-X-100/PBS (PBS-T) için 3 x 1 h gecede engelleme arabellekte kütük parçası onları önce oda sıcaklığında [%5 Sığır serum albumin (BSA) / PBS-T + % 0,2 Sodyum azid].
    2. Antikorlar aşağıdaki gibi seyreltik: keçi α sohbet (1:50), tavşan α TH (1:1, 000), tavuk α neurofilament (1:3, 000); Floresan etiketleme için ikincil antikorlar (1:500; veya üreticinin yönergelerine göre); biotinylated ikincil antikorlar chromogenic etiketleme için (1: 200; veya üreticinin yönergelerine göre).
  5. Birincil antikorlar 4 ˚C 1 haftadır engelleme arabellekte seyreltilmiş numune kuluçkaya.
  6. Kalpler 3 x 15 dk için PBS-T engelleme arabellekte ikincil antikor kuluçka için 4 gün önce yıkayın.
  7. Kalpler 3 x 15 dk için PBS-T içinde yıkayın ve oda sıcaklığında 3 h için floresan boyama için montaj orta depolamak veya bir avidin-biotin karmaşık algılama kiti üreticinin talimatlarına göre kullanın.
  8. Kalpler 1s içinde bir ticari tampon 3, 3'-diaminobenzidine (DAB), için için üreticinin yönergelerine göre DAB içeren arabellekte görsel bir denetim altında geliştirme önce önceden kuluçkaya.
  9. Numuneler Çift Kişilik distile su içinde saklayın.
  10. Parafin kesitler için kurutmak ve kalpleri parafin içinde embed.
    1. 4-µm kalınlığında kesitler kesin ve onları Laboratuvarı rutin prosedürleri göre deparaffinize. Ve nasıl yapılması antijen alma ihtiyacı antikor kasanın bağlı olduğundan tek tek her kurulum için kurulacak ihtiyacı var.
    2. 10 min % 0,2 Triton-X-100/Tris-tamponlu tuz (TBS), 3 x 5 dk yıkar TBS. içinde takip için bölümleri permeabilize
    3. %3 ile engellemek BSA/TBS oda sıcaklığında 1 h için.
    4. Onları gecede 4 ˚C kuluçkaya [birincil antikorlar: keçi α sohbet (1:50), tavşan α TH (1:500), tavuk α neurofilament (1:1, 000)] veya oda sıcaklığında (ikincil antikorlar floresans etiketli, 1:500) 1 BSA/TBS ile 3 x 5 dk yıkar TBS arasında % 2 h.
    5. Bisbenzimide H33342 trihydrochloride 1 µg/mL ikincil antikor ekleyin veya farklı bir nükleer boyama yöntemi kullanın.
    6. Floresan boyama için montaj orta slaytları bağlayın.

Sonuçlar

Şekil 1 2 çoklu elektrot dizilerin (ölçü) dahil olmak üzere Langendorff kurulum görüntüsünü gösterir. Deneme önce intrakardiyak kateter kanülü sağ atrium/sağ ventrikül içinde hızlı ve kolay ekleme kolaylaştırmak için ve denge başlayabilirsiniz kadar kısa bir süre sağlamak için yakın konumlandırılmış. Odası tam olarak kapatılır ve istikrarlı bir sıcaklık garanti böylece alt kısmındaki odasının (bkz.

Tartışmalar

Bu makale, iyi bilinen Langendorff ex vivo kalp perfüzyon sistemi etkisi kardiyak Elektrofizyoloji ve arrhythmogenesis intrakardiyak nöronların farklı eşleme ve stimülasyon teknikleri kullanarak çalışma için bir araç olarak sunulan endocardial ve epicardial yaklaşımlar da dahil olmak üzere.

İletişim kuralı'nın çeşitli yerlerinde kurulum için büyük önem taşımaktadır. İlk olarak, atriyal yağ yastıkları bozulmamış kalmak veya hızlı bir şekilde Miyokard...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar için onun mükemmel teknik yardım ve UKE mikroskobu görüntüleme Merkezi (Umif), Üniversitesi Tıp Merkezi Hamburg-mikroskoplar ve destek sağlamak için Eppendorf Hartwig Wieboldt teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma tarafından finanse edilen yanında Dernegimizin des Universitären Herzzentrums Hamburg e.V. yapıldı ve DZHK (Almanca Kardiyovasküler Araştırma Merkezi) tarafından [FKZ 81Z4710141].

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium chlorideSigma-AldrichS3014Modified Krebs-Henleit solution
Sodium hydrogencarbonateSigma-Aldrich401676Modified Krebs-Henleit solution
Potassium chlorideSigma-AldrichP5405Modified Krebs-Henleit solution
Potassium phosphate monobasicSigma-AldrichP5655Modified Krebs-Henleit solution
Magnesium sulfate heptahydrateSigma-AldrichM1880Modified Krebs-Henleit solution
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC7902Modified Krebs-Henleit solution
GlucoseSigma-AldrichG5767Modified Krebs-Henleit solution
Sodium pyruvate bioXtraSigma-AldrichP8574Modified Krebs-Henleit solution
Carbogen (95% O2 / 5% CO2)SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, GermanyModified Krebs-Henleit solution
Sterile filter steritop-GP 0.22EMD MilliporeSCGPT05REModified Krebs-Henleit solution
Atropine sulfateSigma-AldrichA0257Neuromodulation
Hexamethonium chlorideSigma-AldrichH2138Neuromodulation
Nicotine free base 98-100%Sigma-AldrichN3876Neuromodulation
Formalin solution neutral buffered 10%Sigma-AldrichHT501128Whole mount staining
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneSigma-Aldrich252859Whole mount staining
MethanolSigma-Aldrich34860Whole mount staining
Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2OMerck, KGA, Darmstadt, GermanyH1009Whole mount staining
Dimethyl sulfoxideMerck, KGA, Darmstadt, GermanyD8418Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tabletsGibco / Invitrogen18912-014Whole mount staining
Triton-x-100Sigma-AldrichT8787Whole mount staining
Albumin bovine fraction VBiomol, Hamburg, Germany11924.03Whole mount staining
Chicken anti neurofilamentEMD MilliporeAB5539Whole mount staining
Rabbit anti tyrosine hydroxylaseEMD MilliporeAB152Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferaseEMD MilliporeAP144PWhole mount staining
Donkey α rabbit IgG Alexa 488Thermo Fisher ScientificA21206Whole mount staining
Donkey α goat IgG Alexa 568Thermo Fisher ScientificA11057Whole mount staining
Donkey α chicken IgY Alexa 647Merck, KGA, Darmstadt, GermanyAP194SA6Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α rabbit igGR&D SystemsAP182BWhole mount staining
Biotin-conjugated donkey α goat igGR&D SystemsAP192PWhole mount staining
Biotin-conjugated goat α chicken igYR&D SystemsBAD010Whole mount staining
Vectashield mounting mediumVector laboratories, Burlingame, CA, USAH-1000Immunohistochemistry
Vectastain ABC kitVector laboratories, Burlingame, CA, USAPK-4000Immunohistochemistry
Steady DAB/PlusAbcam plc, Cambridge, UKab103723Whole mount staining
HistoClearDiaTec, Bamberg, GermanyHS2002Immunohistochemistry
BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAB2261Immunohistochemistry
Vectashield HardSet mounting mediumVector laboratories, Burlingame, CA, USAVEC-H-1400Immunohistochemistry
Perfusion systemHUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany 73-4343Langendorff apparatus
Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameterPowerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New ZealandPL3508 PowerLab 8/35Langendorff setup
Octapolar catheterCIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USAcustomLangendorff setup
Stimulus generatorSTG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, GermanySTG4002-160µAStimulation setup
Stimulation softwareMulti Channel Systems, Reutlingen, GermanyMC_Stimulus IIStimulation setup
Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrogramsME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, GermanyUSB-ME128-SystemMEA setup
Multi-electrode arrayMEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, GermanyEcoFlexMEA36MEA setup
Multi-electrode array recording softwareMulti Channel Systems, Reutlingen, GermanyMC_RackMEA setup
Spring scissorsFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany15003-08Heart Preparation
Strabismus ScissorsFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany14575-09Heart Preparation
Mayo ScissorsFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany14110-15Heart Preparation
Dumont SS ForcepsFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany11203-25Heart Preparation
London ForcepsFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany11080-02Heart Preparation
Narrow Pattern ForcepsFine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany11003-13Heart Preparation
Plastic WrapParafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United StatesConsumable Materials
StereomicroscopeLeica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, GermanyFRET
LEDCoolLED, Andover, UKpE-100FRET
DualViewPhotometrics, Tucson, AZ, USADV2-SYSFRET
DualView filter setPhotometrics, Tucson, AZ, USA05-EMFRET
optiMOS scientific CMOS cameraQimaging, Surrey, BC, Canada01-OPTIMOS-R-M-16-CFRET
Imaging software  Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USAFRET
Analysis SoftwareImage J software; Public Domain, NIH, USAFRET

Referanslar

  1. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
  2. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  3. Hearse, D. J., Sutherland, F. J. Experimental models for the study of cardiovascular function and disease. Pharmacological Research. 41 (6), 597-603 (2000).
  4. Valentin, J. P., Hoffmann, P., De Clerck, F., Hammond, T. G., Hondeghem, L. Review of the predictive value of the Langendorff heart model (Screenit system) in assessing the proarrhythmic potential of drugs. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49 (3), 171-181 (2004).
  5. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
  6. Langendorff, O. Investigation of the living mammalian heart. Pflügers Archiv. 61, 291-332 (1895).
  7. Matsumoto-Ida, M., Akao, M., Takeda, T., Kato, M., Kita, T. Real-time 2-photon imaging of mitochondrial function in perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion. Circulation. 114 (14), 1497-1503 (2006).
  8. Rassaf, T., Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., Shiva, S., Heusch, G., Kelm, M. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circulation Research. 114 (10), 1601-1610 (2014).
  9. Schechter, M. A., et al. An isolated working heart system for large animal models. Journal of Visualized Experiments. 88 (88), 51671 (2014).
  10. Stockigt, F., et al. Total beta-adrenoceptor knockout slows conduction and reduces inducible arrhythmias in the mouse heart. PLoS One. 7 (11), e49203 (2012).
  11. Berul, C. I. Electrophysiological phenotyping in genetically engineered mice. Physiological Genomics. 13 (3), 207-216 (2003).
  12. Curtis, M. J., et al. The Lambeth Conventions (II): guidelines for the study of animal and human ventricular and supraventricular arrhythmias. Pharmacology & Therapeutics. 139 (2), 213-248 (2013).
  13. Schrickel, J. W., et al. Enhanced heterogeneity of myocardial conduction and severe cardiac electrical instability in annexin A7-deficient mice. Cardiovascular Research. 76 (2), 257-268 (2007).
  14. Rudolph, V., et al. Myeloperoxidase acts as a profibrotic mediator of atrial fibrillation. Nature Medicine. 16 (4), 470-474 (2010).
  15. Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
  16. Calebiro, D., et al. Persistent cAMP-signals triggered by internalized G-protein-coupled receptors. PLoS Biology. 7 (8), e1000172 (2009).
  17. Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. Journal of Visualized Experiments. (66), e4081 (2012).
  18. Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
  19. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2.28.1-2.28.12 (2017).
  20. Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116 (12), 2005-2019 (2015).
  21. Wengrowski, A. M., Wang, X., Tapa, S., Posnack, N. G., Mendelowitz, D., Kay, M. W. Optogenetic release of norepinephrine from cardiac sympathetic neurons alters mechanical and electrical function. Cardiovascular Research. 105 (2), 143-150 (2015).
  22. Rivinius, R., et al. Control of cardiac chronotropic function in patients after heart transplantation: effects of ivabradine and metoprolol succinate on resting heart rate in the denervated heart. Clinical Research in Cardiology. , (2017).
  23. Ajijola, O. A., et al. Augmentation of cardiac sympathetic tone by percutaneous low-level stellate ganglion stimulation in humans: a feasibility study. Physiological Reports. 3 (3), e12328 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T psorunu 135otonom sinir sistemiventrik ler ta ikardiotonomik gangliyonintrakardiyak sinir sistemiablasyonani kardiyak l m

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır