Влияние внутрисердечной нейронов на сердечной электрофизиологии и Arrhythmogenesis в системе Langendorff Ex Vivo

Резюме

Здесь мы представляем собой протокол для модуляции внутрисердечной вегетативной нервной системы и оценки его влияния на основные электрофизиологии, arrhythmogenesis и лагеря динамика, с помощью программы Langendorff установки ex vivo .

Аннотация

С момента своего изобретения в конце 19-^го века Langendorff система перфузии ex vivo сердце продолжает быть важным инструментом для изучения широкий спектр физиологических, биохимических, морфологические и фармакологические параметры в централизованно денервированных сердца. Здесь мы описываем установку для модуляции внутрисердечной вегетативной нервной системы и оценки его влияния на основные электрофизиологии, arrhythmogenesis и динамика циклический аденозинмонофосфат (лагерь). Внутрисердечной вегетативной нервной системы модулируется механических рассечение предсердий жира колодки в котором мышиных ганглии расположены главным образом — или путем использования как глобальных, так и целевых фармакологического вмешательства. Octapolar электрофизиологические катетер вводится в правого предсердия и правого желудочка, и эпикардиальной размещены массивы несколькими электродами (МПС) для сопоставления с высоким разрешением используются для определения сердечной электрофизиологии и arrhythmogenesis. Фёрстер передачи энергии резонанса (ЛАДА) изображений выполняется для реального времени наблюдения за лагеря уровнях в различных регионах сердца. Нейроморфологию изучается с помощью на основе антител окрашивание всей сердца с помощью нейронов маркеров для идентификации и модуляции конкретных целевых показателей внутрисердечной вегетативной нервной системы в проведенных исследованиях. Langendorff ex vivo установки позволяет большое количество воспроизводимых экспериментах в короткое время. Тем не менее, частично открытый характер установки (например., во время измерений МПС) затрудняет контроль постоянной температуры и должны быть сведены к минимуму. Этот описан метод позволяет анализировать и модулировать внутрисердечной вегетативной нервной системы в децентрализованных сердцах.

Введение

Langendorff система перфузии ex vivo сердце продолжает быть важным инструментом для выполнения широкий спектр физиологических, биохимических, морфологические и фармакологические исследования в центре денервированных сердца^{1,2 ,3,,45} с момента его изобретения в конце 19 века^6тыс . На сегодняшний день, эта система до сих пор широко используется для различных темы (например., ишемии-реперфузии) или для изучения сердца фармакологические эффекты^7,8и является основным инструментом в сердечно-сосудистых исследований. Долговечность данного метода приводит к от несколько преимуществ (например., измерения выполняются без влияние центральной нервной системы или других органов, кровообращения или циркулирующих гормонов). При необходимости, Фармацевтика можно добавлять контролируемым образом буфер перфузии или непосредственно применяться к конкретным структурам. Воспроизводимость экспериментов, и относительно большое количество экспериментов могут быть выполнены в течение короткого времени. (Частично) открытый характер настройки можно сделать трудно регулирование температуры и необходимо принимать во внимание. Хотя в более крупных видов⁹также используется Langendorff система, мелкие животные используются главным образом как экспериментальной установки является менее сложной и большей биологической вариативности (например., трансгенные мыши модели) могут быть использованы.

В экспериментальной установки настоящего Протокола является влияние внутрисердечной вегетативной нервной системы на основные электрофизиологические параметры, желудочковой arrhythmogenesis, эпикардиальной теплопроводности и циклический аденозинмонофосфат (лагерь) динамика оценены. Большое количество внутрисердечной ганглии, которые расположены в основном в предсердной жировых отложений и теперь хорошо известны для контроля сердечной электрофизиологии независимо от центральной нейронные управления, являются либо оставить нетронутыми или вручную удалены с тщательной механической рассечение. Фармакологических модуляции вегетативной нервной системы осуществляется глобально добавив Фармацевтика в буфер перфузии или локально путем целенаправленных модуляции предсердий ганглиев. После экспериментов сердца хорошо подходят для оценки иммуногистохимического как все клетки крови были удалены из-за непрерывного перфузии, который может увеличить качество окрашивания.

Общая цель описанных методов является предложить новые перспективы для подробного исследования относительно влияния вегетативной нервной системы на сердечной электрофизиологии и arrhythmogenesis в самом сердце мыши. Причина использовать эту технику, что это можно изучить и изменить вегетативной нервной системы без влияние центральной нервной системы. Одним из основных преимуществ является легко занятости фармакологические эксперименты, в которых потенциальные про - антиаритмические свойств или старых и новых агентов могут быть протестированы. Кроме того для изучения механизмов аритмии, сердечной недостаточности или метаболических заболеваний доступны трансгенных и нокаут мыши модели различных кардиологических заболеваний. Такой подход укрепил наше понимание как вегетативной нервной системы на уровне предсердий может влиять желудочков сердца электрофизиологии и индукции аритмий.

протокол

Все процедуры с участием животных были утверждены местными властями государства Гамбурга, Гамбургский университет животных ухода и использования комитетов.

1. Подготовка аппарата Langendorff

Примечание: Коммерчески доступных Langendorff перфузии система используется.

1. Подготовить измененный Кребса-Henseleit решение (119 мм хлорида натрия, бикарбонат натрия, 4,6 мм хлористого калия, 1,2 мм монокальций, Калия фосфат 1,1 мм магния сульфата, хлорида кальция, глюкозы 8.3 мм и 2 мм натрия 2,5 мм в 25 мм пируват). Добавьте смесь 95% двуокиси углерода в oxygen/5% перфузии решение для предотвращения кальция осадков. Фильтр буфер с размером пор 0,22 мкм.
2. Добавление фармакологических агента в буфер расследовать его влияние на сердечной электрофизиологии и arrhythmogenesis при необходимости.
3. Запустите ванну водой и поместите решение перфузии, включая смесь 95% двуокиси углерода в oxygen/5% в нем. Настройка температуры водяной бани, таким образом, чтобы температура раствора перфузии непосредственно перед канюлю ~ 37 градусов.
4. Запустить насос ролик и заполняют раствором перфузии аппарат, как только температура не будет достигнута.
5. Регулировать скорость насоса перед присоединением сердца, так, что нет пузырьков воздуха остаются в канюлю, когда крепления его к аппарату.

2. жесткий - и подготовка программного обеспечения

1. Подключите систему сбора цифровых данных и соответствующего программного обеспечения к Langendorff аппарат для непрерывной записи перфузионного давления, скорости потока и частоты сердечных сокращений.
   1. Установите целевой перфузионного давления в общих настройках 80 мм рт..
   2. Начните запись.
2. Используйте катетер электрофизиологии (Таблица материалов) с платиновыми электродами, поверхности электрода 0,5 х 0,5 мм и электрода расстояние 0,5 мм для записи данных и стимуляции с генератором назначенного цифровой стимул.
   1. Место катетера недалеко от района, где сердце будет располагаться после присоединения к аппарату.
   2. Подготовить стимуляции, выбрав 2 электроды из катетера и использовать цикл длиной 100 мс.

3. Подготовка сердца

1. Добавьте холодной (~ 2-4 градусов) буфера перфузии (10-20 мл и 40-50 мл, так что весь блюдо покрыта) 2 Петри (диаметр 6 см и 10 см) и блюдо с канюлей и место их на льду, непосредственно следующий и под микроскопом. Подготовьте двойным узлом вокруг канюли.
2. Быстро акцизных сердце после шейки матки дислокации, открыв грудную клетку, используя ножницы Майо и узкие шаблон щипцы. Затем сцепление аорты и полой выше диафрагмы, используя пинцет Лондон и акцизных легочное сердце блока путем разрезания всех сосудов и соединительной ткани рядом с корешком ножницами косоглазия.
3. Легочное сердце блок в первое блюдо (6 см в диаметре), наполненный ледяной буфера передачи и тщательно удалить легких без повреждения сердца, используя ножницы косоглазия и Лондоне щипцами. Затем поместите сердце под микроскопом и тщательно удалить тимуса, трахеи и пищевода, используя ножницы весной и пинцет СС Дюмон.
4. Используйте весной ножницы, чтобы вырезать отверстие 1,5-2 мм в верхней части правого предсердия для ввода катетера. Вырежьте отверстие в легочной артерии. Затем вырежьте аорты непосредственно под supraaortic ветвями и удаление ткани из аорты, так, что узел может быть легко.
5. Держите предсердий жировых отложений, включая основные atrially находится ganglionated оргстекла, вокруг левого предсердия нетронутыми или полностью удалить их тщательное вскрытие.
6. Передача сердце на блюдо с канюлю и поместите его под микроскопом. Натяните аорты канюлю с щипцами Дюмон СС и связать подготовленный узел плотно вокруг аорты. Убедитесь, что канюли находится не слишком глубоко в аорте, так что аортального клапана и коронарных сосудов, остаются бесплатно.
7. Быстро прикрепите канюли Langendorff аппарата. Убедитесь, что нет пузырьков в канюлю.
8. Переключатель перфузионного давления до 80 мм рт.ст., позволяя перфузии постоянное давление.
9. Вставьте катетер тщательно правого предсердия и правого желудочка без прикосновения или повреждения сердца и закрепите катетер канюля с лентой.
10. Запустите стимуляции с подготовленной цикл длиной 100 мс на период уравновешивания первоначальный 20 мин.
11. Закройте камеру разрешить стабильную температуру.

4. Электрофизиологические параметры и Arrhythmogenesis

1. Примените запрограммированных стимуляции через дистальной или проксимальной электроды катетера в два раза сокращение предсердий или желудочков стимуляции порог для оценки электрофизиологические параметры, как описано в следующих шагах.
   1. Определить время восстановления синусового узла как длина максимальный обратный цикл после 10 s фиксированного курса, ходить на S1S1 длину цикла 120 мс, 100 мс и 80 мс.
   2. Определить точку, Wenckebach как длинная длина цикла S1S1 (8 стимулы; S1S1: 100 мс; 2 мс поэтапного сокращения) с потерей 11 узловой AV проводимости. Определить предсердно узловой огнеупорных периодов как длинный S1S2 (12 стимулы; S1S1: 120 мс, 110 мс и МС; один короткий в сочетании с 2 мс поэтапного сокращения S1S2 extrastimulus) с потерей узловой AV проводимости.
   3. Определить предсердий и желудочков огнеупорных периодов как длинный S1S2 (12 стимулы; S1S1: 120 мс, 110 мс и МС; один короткий extrastimulus в сочетании с 2 мс поэтапного сокращения S1S2) отсутствует сокращение предсердий или желудочков ответ^10,11.
2. Выполнение запланированных extrastimulation (S1S1: 120 мс, 100 мс и 80 мс, а затем до 3 дополнительных ударов; 60-20 мс с 2 мс поэтапного сокращения) или взрыв, протоколы стимуляции (5 s в S1S1: 50-10 мс с 10 мс поэтапного сокращения) в соответствии с конвенций, Ламберт, Ева luate^11,10,желудочковой arrhythmogenesis¹².

5. эпикардиальной проведение измерения

Примечание: Запись однополярного эпикардиальной electrograms с помощью 128-канал, компьютерный запись системы с шагом дискретизации 25 кГц для сопоставления с высоким разрешением. Используйте массив 32 мульти электрода (МЭС; межэлектродный расстояние: 300 мкм; 1,8 х 1,8 мм). Обратите внимание, что данные были полосовой фильтрации (50 Гц) и оцифрованы с 12 бит и диапазон сигнала 20 МВ.

1. Место МПС в области места для сердца и добавить заземление в другую часть сердца^13,14,15.
2. Место эпикардиальной стимуляции катетера недалеко от МПС и начать постоянной стимуляции.
3. Начните запись после подтверждения хорошего контакта электродов, проверяя качество сигнала и амплитуды.
4. Используйте автономный анализ для определения скорости распространения волн и дисперсии в направлении проводимости.

6. основанные на ладу передачи энергии Фёрстер резонанс циклический аденозинмонофосфат (лагерь) изображений

Примечание: Для измерений, основанных на ладу, урожай сердца из CAG-Epac1-лагеря трансгенных мышей¹⁶.

1. Используйте систему самодельных изображений вокруг стереомикроскопом^15,17.
2. Место стереомикроскопом перед сердцем и настроить его для остроты зрения.
3. Возбуждают лагеря датчик с источником света [например, использование одной длины волны света излучающих диодов (440 Нм)]. Разделение света выбросов в доноров и акцепторов каналы с использованием splitter луча (для пара голубой флуоресцентный белок/желтый флуоресцентный белок, использование 565dcxr дихроичное зеркало и фильтры выбросов D480/30 и D535/40).
4. Обеспечить стабильную температуру, поставив пластиковые оберните вокруг камеры.
5. Возьмите изображения с помощью камеры научных дополнительные металл оксид полупроводник (sCMOS). Координировать источник света и камеры образов с открытым исходным кодом программного обеспечения таких как микро-менеджер.
6. Чтобы начать получение изображения, нажмите Multi-D Acq. кнопки и настроить промежуток времени, который приобретает изображение каждые 10 сек, с соответствующей экспозиции время, которое зависит от мощности флуоресцентного сигнала (около 100 мс).
7. Используйте ранее описанных и доступны онлайн ладу и лад онлайн 2 плагины¹⁷ разделить изображение на два канала, выберите регионы интереса и контролировать соотношение трассировки.
8. Во время приобретения perfuse сердце с модифицированных Кребса-Henseleit раствор, содержащий различные вещества, в зависимости от характера эксперимента.
9. В конце эксперимента выключите приобретения, нажав кнопку остановить и сохранить стек изображений.
10. Анализ данных ладу, автономно с помощью выделенного анализ программного обеспечения, которое можно разделить образы на двух идентичных секций для доноров и акцепторов каналов и может выполнять анализ лад в нескольких регионах интереса.
    Примечание: Выделенный плагин (ладу автономно) необходима, которая предоставляется в Шпренгер et al. ¹⁷.
    1. Запустите программное обеспечение. Откройте анализ, перейдя в меню плагинов , а затем нажмите на MicroManager, а затем на Открытых микро-менеджер файлов.
    2. Запустите ладу автономном режиме плагин для того, чтобы разделить два одинаковых изображения CFP и рекламы ЯФП каналов промежуток времени.
    3. Используйте средство Произвольной выборки для обозначения региона интерес рекламы ЯФП изображения. Нажмите кнопку Добавить , чтобы добавить выделение в окне Multi измерения .
    4. Выберите регион интерес в окне Multi измерения и нажмите Multi получить таблицу с средний серый значения для каждого кадра и региона. Скопируйте и вставьте все данные в листе Excel.
    5. Нажмите на Стек изображений СЛП. Выполните те же действия, что и в шаге 6.10.4 для стека CFP и вставьте значения среднего серого в тот же лист Excel.
11. Исправьте необработанные данные автономно для фактор через кровь донора в акцепторной канал¹⁷.
    1. Используйте следующую формулу, где B — фактор кровотечение через:
       Коэффициент = (рекламы ЯФП - B-x CFP) / СЛП
    2. Определить фактор кровотечение через B изображения сердца, выражая CFP только и измерить процент доноров флуоресценции в канале рекламы ЯФП (B = рекламы ЯФП / CFP).

7. нейроморфологию

Примечание: Анализ внутрисердечной вегетативной нервной системы с помощью immunostainings целом гора нетронутыми мышиных сердец. Обратите внимание, что большинство внутрисердечной ганглиев локализованы в эпикардиальной жировой ткани рядом легочных вен.

1. Использовать различные stainings изображением neurofilament (общая нейрональных структур; курица анти NF-H, 1:3, 000), тирозин-гидроксилазы (TH, симпатичная(ый) нейрональных структур; кролик α-й, 1:1, 000) и холин ацетилтрансфераза (чат, парасимпатической нейрональных структур; Коза α чат, 1:50).
2. После перфузии в Langendorff аппарате исправить сердца мыши в 10 мл формалина за 24 часа и хранить их в фосфат амортизированное saline (PBS) на 4 градусов.
3. Отбеливатель сердца в отбеливатель Дент (наименьшие метанола: перекиси водорода раствор 30% (w/w) в H₂O: диметилсульфоксида (ДМСО)) за 1 неделю на 4 ° c и увлажняет их впоследствии в PBS в серии по убыванию метанола в PBS (100%, 75%, 50%, 25%; 1 h) ¹⁸.
4. Выполните следующие инкубаций в формате 24-хорошо пластины с нежным агитации на 4 ° c:
   1. Разрушения сердца в 1% тритон-X-100/PBS (PBS-T) для 3 x 1 ч при комнатной температуре до блокировки их на ночь в блокирующем буфере [5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) / PBS-T + азид натрия 0,2%].
   2. Разбавьте антитела следующим: Коза α чат (1:50), кролик α TH (1:1, 000), курица α neurofilament (1:3, 000); вторичные антитела для люминесцентные маркировки (1: 500; или согласно инструкциям производителя); биотинилированным вторичные антитела для маркировки Хромогенный (1: 200; или согласно инструкции производителя).
5. Проинкубируйте образцы в первичных антител, разводят в блокирующем буфере 1 неделю на 4 градусов.
6. Помыть сердца для 3 x 15 мин в PBS-T перед вторичное антитело инкубации в блокирующем буфере для 4 дней.
7. Помыть сердца для 3 x 15 мин в PBS-T и хранить их в среде установки для флуоресцентной окраски за 3 ч при комнатной температуре или использовать авидин Биотин комплекс обнаружения kit согласно инструкциям производителя.
8. Предварительно Инкубируйте сердца за 1 ч в коммерческих буфера для 3, 3'-диаминобензидин (DAB), до разработки их под визуальный контроль в буфере DAB-содержащих согласно инструкциям производителя.
9. Храните образцы в двойной дистиллированной воды.
10. Для парафиновых срезах обезвоживанию и внедрить сердца в парафин.
    1. Резать толстые секции 4-мкм и deparaffinize их по данным лаборатории рутинные процедуры. Ли и как антиген поиска необходимо выполнить должна быть создана для каждого индивидуальную настройку, поскольку она зависит от комбинации антител.
    2. Разрушения в разделах 10 мин в солевой раствор 0,2% Тритон X-100/трис буфере (TBS), следуют 3 x 5 мин моет в TBS.
    3. Блокировать их с 3% BSA/TBS 1 ч при комнатной температуре.
    4. Инкубировать их на ночь при 4 ° c [первичного антитела: Коза α чат (1:50), кролик α й (1: 500), курица α neurofilament (1:1, 000)] или 2 ч при комнатной температуре (помечены флуоресцентным вторичные антитела, 1: 500) в 1% BSA/TBS с 3 x 5 мин моет TBS между ними.
    5. Добавьте 1 мкг/мл bisbenzimide H33342 trihydrochloride вторичное антитело решение или использовать другой метод ядерной окрашивание.
    6. Смонтируйте слайды в среде установки для флуоресцентной окраски.

Результаты

Рисунок 1 показывает изображение Langendorff установки, включая 2 несколькими электродами массивы (МЭС). До эксперимента внутрисердечного катетера расположен близко к канюля для содействия быстрой и легкой вставки в желудочке прямо атриум и обеспечить за к?...

Обсуждение

В этой рукописи известный Langendorff ex vivo сердце перфузии системы представлен как инструмента для изучения влияния внутрисердечной нейронов на сердечной электрофизиологии и arrhythmogenesis с помощью различных карт и методы стимуляции включая эндокарда и эпикардиальной подходы.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014	Modified Krebs-Henleit solution
Sodium hydrogencarbonate	Sigma-Aldrich	401676	Modified Krebs-Henleit solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405	Modified Krebs-Henleit solution
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655	Modified Krebs-Henleit solution
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M1880	Modified Krebs-Henleit solution
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902	Modified Krebs-Henleit solution
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	Modified Krebs-Henleit solution
Sodium pyruvate bioXtra	Sigma-Aldrich	P8574	Modified Krebs-Henleit solution
Carbogen (95% O2 / 5% CO2)	SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany	Modified Krebs-Henleit solution
Sterile filter steritop-GP 0.22	EMD Millipore	SCGPT05RE	Modified Krebs-Henleit solution
Atropine sulfate	Sigma-Aldrich	A0257	Neuromodulation
Hexamethonium chloride	Sigma-Aldrich	H2138	Neuromodulation
Nicotine free base 98-100%	Sigma-Aldrich	N3876	Neuromodulation
Formalin solution neutral buffered 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Whole mount staining
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	252859	Whole mount staining
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Whole mount staining
Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	H1009	Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	D8418	Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tablets	Gibco / Invitrogen	18912-014	Whole mount staining
Triton-x-100	Sigma-Aldrich	T8787	Whole mount staining
Albumin bovine fraction V	Biomol, Hamburg, Germany	11924.03	Whole mount staining
Chicken anti neurofilament	EMD Millipore	AB5539	Whole mount staining
Rabbit anti tyrosine hydroxylase	EMD Millipore	AB152	Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferase	EMD Millipore	AP144P	Whole mount staining
Donkey α rabbit IgG Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	Whole mount staining
Donkey α goat IgG Alexa 568	Thermo Fisher Scientific	A11057	Whole mount staining
Donkey α chicken IgY Alexa 647	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	AP194SA6	Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α rabbit igG	R&D Systems	AP182B	Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α goat igG	R&D Systems	AP192P	Whole mount staining
Biotin-conjugated goat α chicken igY	R&D Systems	BAD010	Whole mount staining
Vectashield mounting medium	Vector laboratories, Burlingame, CA, USA	H-1000	Immunohistochemistry
Vectastain ABC kit	Vector laboratories, Burlingame, CA, USA	PK-4000	Immunohistochemistry
Steady DAB/Plus	Abcam plc, Cambridge, UK	ab103723	Whole mount staining
HistoClear	DiaTec, Bamberg, Germany	HS2002	Immunohistochemistry
BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	B2261	Immunohistochemistry
Vectashield HardSet mounting medium	Vector laboratories, Burlingame, CA, USA	VEC-H-1400	Immunohistochemistry
Perfusion system	HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany	73-4343	Langendorff apparatus
Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter	Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand	PL3508 PowerLab 8/35	Langendorff setup
Octapolar catheter	CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA	custom	Langendorff setup
Stimulus generator	STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	STG4002-160µA	Stimulation setup
Stimulation software	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	MC_Stimulus II	Stimulation setup
Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms	ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	USB-ME128-System	MEA setup
Multi-electrode array	MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	EcoFlexMEA36	MEA setup
Multi-electrode array recording software	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	MC_Rack	MEA setup
Spring scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15003-08	Heart Preparation
Strabismus Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14575-09	Heart Preparation
Mayo Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14110-15	Heart Preparation
Dumont SS Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11203-25	Heart Preparation
London Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11080-02	Heart Preparation
Narrow Pattern Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11003-13	Heart Preparation
Plastic Wrap	Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States		Consumable Materials
Stereomicroscope	Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany		FRET
LED	CoolLED, Andover, UK	pE-100	FRET
DualView	Photometrics, Tucson, AZ, USA	DV2-SYS	FRET
DualView filter set	Photometrics, Tucson, AZ, USA	05-EM	FRET
optiMOS scientific CMOS camera	Qimaging, Surrey, BC, Canada	01-OPTIMOS-R-M-16-C	FRET
Imaging software	Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA		FRET
Analysis Software	Image J software; Public Domain, NIH, USA		FRET