Auswirkungen der intrakardialen Neuronen auf kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenesis in einem Ex-Vivo -Langendorff-System

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Modulation der intrakardialen vegetative Nervensystem und die Bewertung ihres Einflusses auf grundlegende Elektrophysiologie, Arrhythmogenesis und Lager Dynamik mit einem ex-Vivo Langendorff Setup.

Zusammenfassung

Seit seiner Erfindung im^{späten 19 Jahrhundert} weiter Langendorff ex Vivo Herz-Perfusions-System zu einem wichtigen Instrument für das Studium eines breiten Spektrums an physiologische, biochemische, morphologische und pharmakologischen Parameter in Zentral denervierten Herzen. Hier beschreiben wir eine Setup für die Modulation der intrakardialen vegetative Nervensystem und die Bewertung ihres Einflusses auf grundlegende Elektrophysiologie, Arrhythmogenesis und zyklische Adenosin Monophosphate (cAMP) Dynamik. Die intrakardiale vegetative Nervensystem moduliert durch die mechanische Zerlegung von Vorhofflimmern Fett Pads-in welche murinen Ganglien sich hauptsächlich befinden — oder durch die Nutzung des globalen sowie gezielte pharmakologische Interventionen. Ein Octapolar elektrophysiologische Katheter wird in den rechten Vorhof und der rechten Herzkammer eingeführt, und epicardial platziert Multi-Elektroden (MEA) für hochauflösende Abbildung dienen, kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenesis zu bestimmen. Förster Resonanz Energietransfer (FRET) imaging wird für die Echtzeit-Überwachung von cAMP Ebenen in verschiedenen kardialen Regionen durchgeführt. Neuromorphology wird untersucht mittels Antikörper-basierten Färbung von ganzem Herzen mit neuronalen Marker, um die Identifikation und Modulation der spezifischen Ziele des intrakardialen Nervensystem in den durchgeführten Studien zu führen. Das ex-Vivo Langendorff Setup ermöglicht eine hohe Anzahl von reproduzierbare Experimente in kurzer Zeit. Dennoch, der teilweise offene Charakter des Setups (zB., während MEA Messungen) Konstante Temperaturregelung erschwert und sollte auf ein Minimum gehalten werden. Das beschriebene Verfahren ermöglicht es, zu analysieren und zu modulieren die intrakardiale vegetative Nervensystem in dezentralen Herzen.

Einleitung

Langendorff ex Vivo Herz Perfusion System weiter zu einem wichtigen Instrument für die Durchführung eines breiten Spektrums an morphologische, physiologische, Biochemische und pharmakologische Studien in Zentral denervierten Herzen^{1,2 ,3,4,5} seit ihrer Erfindung in den späten 19^th Jahrhundert⁶. Bis heute ist dieses System noch weit verbreitet zu verschiedenen Themen (zB., Ischämie Reperfusion) oder zum Studium Herz-pharmakologische Effekte^7,8, und ist ein grundlegendes Instrument in der Herz-Kreislauf-Forschung. Die Langlebigkeit dieser Methode ergibt sich aus mehrere Vorteile (zB., Messungen ohne den Einfluss des zentralen Nervensystems oder anderer Organe, systemischen Kreislauf oder zirkulierenden Hormone). Bei Bedarf können Arzneimittel kontrolliert Perfusion Puffer hinzugefügt oder direkt an bestimmte Strukturen angewendet werden. Experimente sind reproduzierbar und eine relativ hohe Anzahl von Experimenten kann in kurzer Zeit durchgeführt werden. Die (teilweise) offene Natur des Setups machen Temperaturregulierung schwierig und muss berücksichtigt werden. Obwohl das Langendorff-System auch in größeren Arten⁹verwendet wird, kleinere Tiere dienen in erster Linie als der experimentelle Aufbau weniger komplex und eine größere biologische Variabilität ist (zB., transgenen Maus Modelle) verwendet werden.

In der Versuchsanordnung dieses Protokolls ist der Einfluss des intrakardialen Nervensystem auf elektrophysiologische Grundparameter, ventrikuläre Arrhythmogenesis, epicardial Wärmeleitung und zyklische Adenosin Monophosphate (cAMP) Dynamik ausgewertet. Eine große Anzahl von intrakardialen Ganglien, die befinden sich hauptsächlich in der atrial Fettpolster und sind nun bekannt, kardiale Elektrophysiologie unabhängig von zentralen neuronalen Kontrolle zu kontrollieren, sind entweder intakt oder manuell entfernt mit sorgfältigen mechanischen Links Dissektion. Eine pharmakologische Modulation des autonomen Nervensystems wird weltweit durch Zugabe von Arzneimitteln auf den Puffer, Perfusion oder lokal durch gezielte Modulation von Vorhofflimmern Ganglien durchgeführt. Nach den Experimenten sind die Herzen gut geeignet für eine immunohistologische Bewertung, wie alle Blutzellen durch die kontinuierliche Perfusion entfernt worden sind, die wodurch die Qualität der Färbung erhöht werden kann.

Das übergeordnete Ziel der beschriebenen Techniken ist es, neuartige Perspektiven für detaillierte Studien über die Auswirkungen des autonomen Nervensystems auf kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenesis im Herzen Maus bieten. Ein Grund für die Verwendung dieser Technik ist, dass es möglich ist, zu studieren und das vegetative Nervensystem ohne Auswirkungen auf das zentrale Nervensystem zu ändern. Ein großer Vorteil ist die einfache Beschäftigung pharmakologische Experimente, in welche möglichen pro- oder antiarrhythmische Eigenschaften des alten und neuen Agenten können getestet werden. Darüber hinaus stehen transgenen und Knockout Maus-Modellen der verschiedenen Herzerkrankungen untersuchen die Mechanismen, Herzrhythmusstörungen, Herzinsuffizienz oder Stoffwechselerkrankungen. Dieser Ansatz wurde erweitert unser Verständnis der Auswirkungen des autonomen Nervensystems auf das Vorhofflimmern Niveau auf ventrikulären kardialen Elektrophysiologie und die Induktion von Arrhythmien.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tiere wurden von den lokalen Behörden das Hamburg, Universität Hamburg Tierbetreuung und Nutzung Ausschüsse genehmigt.

1. Vorbereitung des Apparates Langendorff

Hinweis: Ein handelsübliches Langendorff Perfusion System wird verwendet.

1. Bereiten Sie eine modifizierte Krebs-Henseleit-Lösung (119 mM von Natrium-Chlorid, 25 mM von Natriumbicarbonat, 4,6 mM Kaliumchlorid, 1,2 mM von Kalium Phosphat monobasic, 1,1 mM von Magnesiumsulfat, 2,5 mM von Kalzium-Chlorid, 8,3 mM von Glukose und 2 mM von Natrium Pyruvat). Fügen Sie ein Gemisch aus 95 % oxygen/5% Kohlendioxid zur Perfusion Lösung zu verhindern, dass Kalzium Niederschlag. Filtern Sie den Puffer mit einer Porengröße von 0,22 µm.
2. Fügen Sie einen pharmakologischen Agenten in den Puffer zu untersuchen, ihre Wirkung auf kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenesis nach Bedarf hinzu.
3. Starten Sie das Wasserbad und platzieren Sie die Perfusion-Lösung mit einer Mischung von 95 % oxygen/5% Kohlendioxid drin. Einstellen Sie die Temperatur des Wasserbades, so, dass die Temperatur der Perfusion Lösung direkt vor die Kanüle ~ 37 ° c ist.
4. Starten Sie die Walze Pumpe und füllen Sie das Gerät mit der Perfusion Lösung, sobald die richtige Temperatur erreicht ist.
5. Einstellen Sie die Pumprate vor dem Anbringen der Herzen so, dass keine Luftblasen in die Kanüle übrig sind, bei der Montage auf den Apparat.

2. hard - und Software-Erstellung

1. Verbinden Sie ein digitales Datenerfassungssystem und die entsprechende Software mit Langendorff Vorrichtung für eine kontinuierliche Aufzeichnung der Perfusionsdruck, Durchfluss und Herzfrequenz.
   1. Legen Sie die gezielte Perfusionsdruck in den allgemeinen Einstellungen zu 80 MmHg.
   2. Die Aufnahme starten.
2. Verwenden Sie einen Elektrophysiologie Katheter (Table of Materials) mit Platin-Elektroden, eine Elektrodenoberfläche von 0,5 x 0,5 mm und einer Elektrode Abstand von 0,5 mm für die Datenaufzeichnung und Anregung mit einem ausgewiesenen digitalen Impuls-Generator.
   1. Platzieren Sie den Katheter in der Nähe der Gegend, wo das Herz nach dem Anbau auf den Apparat positioniert wird.
   2. Bereiten Sie die Stimulation durch den Katheter 2 Elektroden auswählen und verwenden Sie eine Zykluslänge von 100 ms.

3. Vorbereitung des Herzens

1. Fügen Sie die Kälte (~ 2 bis 4 ° c) Perfusion-Puffer (10-20 mL und 40-50 mL, so dass die ganze Schüssel abgedeckt ist) 2 Petrischalen (Durchmesser von 6 cm und 10 cm) und die Schale mit der Kanüle und Stelle sie auf Eis direkt neben und unter dem Mikroskop. Bereiten Sie ein doppelknoten um die Kanüle.
2. Verbrauchsteuern Sie schnell das Herz nach zervikale Dislokation durch Öffnen den Thorax mit Mayo Schere und Zange schmal Muster. Dann greifen Sie die Aorta und Vena Cava oberhalb des Zwerchfells mit London-Pinzette und Verbrauchsteuern des Herz-Lungen-Blocks durch Schneiden alle Gefäße und Bindegewebe in der Nähe der Wirbelsäule mit der Schere Strabismus.
3. Übertragen Sie die Herz-Lungen-Block in die erste Schüssel (6 cm Durchmesser) mit dem eiskalten Puffer gefüllt und entfernen Sie vorsichtig die Lunge ohne Beschädigung das Herz mithilfe von Strabismus Scheren und Pinzetten London. Dann legen Sie das Herz unter dem Mikroskop und entfernen Sie vorsichtig die Thymusdrüse, die Speiseröhre und Luftröhre mit Frühling Scheren und Pinzetten Dumont SS.
4. Verwenden Sie die Feder-Schere, schneiden Sie ein Loch von 1,5-2 mm im oberen Teil der rechten Vorhof für das Einführen des Katheters. Schneiden Sie ein Loch in die Lungenarterie. Dann schneiden Sie die Aorta direkt unter den Supraaortic Ästen und entfernen Sie das Gewebe aus der Aorta, zu, so dass der Knoten leicht angebracht werden kann.
5. Halten Sie das Vorhofflimmern Fettpolster, darunter die großen befindet sich atrially ganglionated Plexiglas, um den linken Vorhof intakt oder vollständig zu entfernen durch sorgfältige Präparation.
6. Übertragen Sie das Herz in die Schale mit der Kanüle zu, und legen Sie sie unter die Lupe genommen. Ziehen Sie die Aorta über die Kanüle mit der Dumont SS-Zange und binden Sie den vorbereiteten Knoten eng um die Aorta. Stellen Sie sicher, dass die Kanüle nicht zu tief in die Aorta platziert wird, so dass die Aortenklappe und die Herzkranzgefäße frei gelassen werden.
7. Befestigen Sie die Kanüle schnell Langendorff-Apparat. Stellen Sie sicher, dass gibt es keine Luftblasen in die Kanüle Links.
8. Wechseln Sie den Perfusionsdruck zu 80 MmHg, so dass ein konstanter Druck Perfusion.
9. Einführen Sie den Katheter vorsichtig in den rechten Vorhof und Rechte Herzkammer ohne zu berühren oder das Herz schädigen und befestigen Sie den Katheter an der Kanüle mit Klebeband.
10. Starten Sie die Stimulation mit den vorbereiteten Zykluslänge von 100 ms für einen anfänglichen 20 min Gleichgewichtherstellung Zeitraum.
11. Schließen Sie die Kammer um eine gleichbleibende Temperatur zu ermöglichen.

4. elektrophysiologische Parameter und Arrhythmogenesis

1. Wenden Sie eine programmierte Stimulation über die distal oder proximalen Elektroden des Katheters an zweimal das Vorhofflimmern oder ventrikuläre Tempo Schwelle, die elektrophysiologische Parameter zu bewerten, wie in den folgenden Schritten beschrieben.
   1. Bestimmen der Sinusknoten Erholungszeit als die maximale Rückkehr Zykluslänge nach 10 s festverzinsliche Tempo auf eine S1S1 Zykluslänge von 120 ms, 100 ms und 80 ms.
   2. Bestimmen Sie den Wenckebach-Punkt als die längste S1S1 Zykluslänge (8 Stimuli; S1S1: 100 ms; 2 ms schrittweise Reduktion) mit einem Verlust von 11 AV-Knoten-Leitung. Bestimmen der ventrikulären Knoten feuerfesten Perioden als die längste S1S2 (12 Stimuli; S1S1: 120 ms, 110 ms und 100 MS; ein kurzer gekoppelt mit 2 ms schrittweise S1S2 Extrastimulus) mit einem Verlust der AV-Knoten-Leitung.
   3. Vorhofflimmern und ventrikuläre feuerfesten Zeiträume als die längste S1S2 zu bestimmen (12 Stimuli; S1S1: 120 ms, 110 ms und 100 MS; ein kurzer gekoppelt mit 2 ms schrittweise S1S2 Extrastimulus) mit einer abwesenden Vorhofflimmern oder ventrikuläre Antwort^10,11.
2. Führen Sie eine programmierte Extrastimulation (S1S1: 120 ms, 100 ms und 80 ms, gefolgt von bis zu 3 zusätzliche Schläge; 60-20 ms mit einer schrittweisen Reduzierung der 2 ms) oder Burst Stimulation Protokolle (5 s bei S1S1: 50 – 10 ms mit einer schrittweisen Reduzierung der 10 ms) im Einklang mit der Lambeth Konventionen Eva Zentrum der linksventrikulären Arrhythmogenesis^10,11,12.

5. epicardial Wärmeleitung Messungen

Hinweis: Datensatz unipolaren epicardial elektrogrammen mit einem 128-Kanal, EDV-gestützte Erfassung-System mit einer Sampling-Rate von 25 kHz für hochauflösende Kartierung. Verwenden Sie ein 32 Multi-Elektroden-Array (MEA; Inter Elektrodenabstand: 300 µm; 1,8 x 1,8 mm). Beachten Sie, dass die Daten Bandpass gefiltert (50 Hz waren) und mit 12 Bit und einer Reichweite von 20 digitalisiert mV.

1. Die MEA in dem dafür vorgesehenen Bereich des Herzens geben Sie und die Erdung zu einem anderen Teil der Herzen^13,14,15.
2. Legen Sie einen epicardial Stimulation Katheter in der Nähe der MEA und beginnen Sie eine ständige Stimulation.
3. Aufnahme nach der Bestätigung der guten Kontakt der Elektroden durch Überprüfung der Signalqualität und Amplitude.
4. Verwenden Sie eine offline-Analyse zur Bestimmung der Ausbreitungsgeschwindigkeit der Welle und Dispersion in Pfeilrichtung Wärmeleitung.

6. Förster Resonance Energy Transfer FRET-basierte zyklische Adenosin Monophosphate (cAMP) Bildgebung

Hinweis: Für Bund-basierten Messungen, Ernten Sie Herzen von CAG-Epac1-Lager Transgene Mäuse¹⁶.

1. Verwenden Sie eine selbstgebaute imaging-System um ein Stereomikroskop^15,17.
2. Legen Sie das Stereomikroskop vor das Herz und für Schärfe anpassen.
3. Die cAMP-Sensor mit einer Lichtquelle zu begeistern [z. B.mit einem Einzel-Wellenlänge Licht emittierende Diode (440 nm)]. Die helle Emission in Donor und Akzeptor-Kanäle mit einem Strahlteiler (für ein paar Cyan fluoreszierenden Proteinen/gelb fluoreszierenden Proteins, Gebrauch ein 565dcxr dichroitischen Spiegel und D480/30 und D535/40 Emission Filter) aufgeteilt.
4. Eine stabile Temperatur zu gewährleisten, indem man eine Plastikfolie um die Kammer.
5. Nehmen Sie Bilder mithilfe einer wissenschaftlichen ergänzende Metall-Oxid-Halbleiter (sCMOS) Kamera. Koordinieren Sie die Lichtquelle und Kamera Bildaufnahme mit einer open-Source imaging-Software wie Micro-Manager.
6. Um die Bildaufnahme zu starten, drücken Sie die Multi Acq. Taste und richten Sie ein Zeitraffer, die erwirbt ein Bild alle 10 s, mit den entsprechenden Belichtungszeit, die Stärke das Fluoreszenzsignal (ca. 100 ms) abhängt.
7. Verwenden Sie die zuvor beschriebenen und verfügbar online Bund und Bund Online-2 Plugins¹⁷ teilen das Bild in zwei Kanäle, wählen die Regionen von Interesse, und überwachen die Verhältnis-Ablaufverfolgung.
8. Perfundieren Sie bei der Übernahme Herzen mit der modifizierten Krebs-Henseleit-Lösung, die verschiedene Stoffe enthalten, abhängig von der Art des Experiments.
9. Am Ende des Experiments die Übernahme durch Drücken der Stop -Taste schalten Sie aus und sparen Sie den Stapel von Bildern.
10. Analysieren Sie die Bund-Daten offline auf eine dedizierte Analysesoftware, die kann Bilder in zwei identische Abschnitte für die Spender und Akzeptor-Kanäle aufgeteilt und kann in mehreren Regionen von Interesse Bund-Analyse durchführen.
    Hinweis: Eine spezielle Plug-in (ÄRGERN Sie sich offline) wird benötigt, hat Sprenger Et Al. , ¹⁷.
    1. Starten Sie die Software. Die Analyse zu öffnen, indem Sie auf das Menü Plugins , dann klicke auf Mittelmanagement, und dann auf Datei öffnen Micro-Manager.
    2. Führen Sie das ÄRGERN Sie sich offline Plugin um den Zeitraffer in zwei identische Bilder für die CFP und YFP Kanäle aufgeteilt.
    3. Verwenden Sie das Freihand-Auswahl -Werkzeug des Interessenbereichs im YFP Bild markieren. Drücken Sie die Schaltfläche " Hinzufügen ", um die Auswahl der Fenster " Multi " hinzuzufügen.
    4. Wählen Sie die Region von Interesse in das Fenster " Multi " und drücken Sie Multi , eine Tabelle mit grauen Mittelwerte für jeden Frame und Region zu erhalten. Kopieren Sie und fügen Sie die Daten in einer Excel-Tabelle.
    5. Klicken Sie auf den GFP-Bildstapel. Führen Sie die gleichen Aktionen wie in Schritt 6.10.4 für den GFP-Stack und fügen Sie die mittleren Grauwerte in der gleichen Excel-Tabelle ein.
11. Korrigieren Sie die raw-Daten offline für den Faktor durchscheinen des Spenders in den Akzeptor Kanal¹⁷.
    1. Verwenden Sie die folgende Formel, wo B ist der durchscheinen-Faktor:
       Ratio = (YFP - B-X CFP) / GFP
    2. Durchbluten Faktor B von imaging ein Herz mit dem Ausdruck nur GFP bestimmen und messen den Prozentsatz der Spender Fluoreszenz im YFP Kanal (B = YFP / GFP).

(7) Neuromorphology

Hinweis: Analysieren Sie die intrakardiale vegetative Nervensystem mithilfe vollständig-hängen Immunostainings intakt murinen Herzen. Beachten Sie, dass die Mehrheit der intrakardialen Ganglien im epicardial Fettgewebe in der Nähe der Lungenvenen lokalisiert sind.

1. Verwenden Sie unterschiedliche Färbungen für die Darstellung der Neurofilamente (allgemeine neuronalen Strukturen, Huhn Anti-NF-H, 1:3 000), Tyrosin-Hydroxylase (TH, sympathischen neuronalen Strukturen, Kaninchen α TH, 1:1 000) und Cholin-Acetyltransferase (ChAT, parasympathischen neuronalen Strukturen; Ziege α ChAT, 01:50).
2. Beheben Sie nach der Durchblutung in den Apparat Langendorff die Mäuseherzen in 10 mL Formalin für 24 h und an Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4 ° c aufbewahren.
3. Die Herzen in Dent Bleichmittel Bleichen (4:1:1 Methanol: Wasserstoffperoxid-Lösung 30 % (w/w) in H₂o: Dimethyl Sulfoxid (DMSO)) für 1 Woche bei 4 ° c und rehydrieren sie anschließend auf PBS in einer Reihe von Methanol in PBS absteigend (100 %, 75 %, 50 %, 25 %; 1 h) ¹⁸.
4. Führen Sie die folgenden Inkubationen in einer 24-Well-Platte-Format mit einer sanften Agitation bei 4 ° c:
   1. Permeabilize die Herzen in 1 % Triton-X-100/PBS (PBS-T) für 3 x 1 h bei Raumtemperatur vor dem Blockieren sie über Nacht in einem blockierenden Puffer [5 % Rinderserumalbumin (BSA) / PBS-T + 0,2 % Natriumazid].
   2. Verdünnen Sie die Antikörper wie folgt: Ziege α ChAT (01:50), Kaninchen α TH (1:1 000), Huhn α Neurofilamente (1:3 000); sekundäre Antikörper zur Kennzeichnung von Leuchtstofflampen (1: 500; oder nach den Anweisungen des Herstellers); biotinylierte Sekundärantikörper chromogenen Kennzeichnung (1: 200; oder nach den Anweisungen des Herstellers).
5. Inkubieren Sie die Exemplare in Primärantikörper verdünnt in einem blockierenden Puffer für 1 Woche bei 4 ° c.
6. Waschen Sie die Herzen für 3 x 15 min in PBS-T vor der Sekundärantikörper Inkubation in einem blockierenden Puffer für 4 Tage.
7. Waschen Sie die Herzen für 3 x 15 min in PBS-T und an einem Eindeckmittel für fluoreszierende Färbung für 3 h bei Raumtemperatur bewahren Sie auf oder verwenden Sie eine Avidin-Biotin-Komplex Erkennung-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
8. Pre-inkubieren Sie die Herzen für 1 Stunde in einem kommerziellen Puffer für 3, 3'-Diaminobenzidine (DAB), bevor sie unter Sichtkontrolle in einem DAB-haltigen Puffer entsprechend den Anweisungen des Herstellers zu entwickeln.
9. Speichern Sie die Exemplare in doppelt destilliertem Wasser.
10. Für Paraffin Abschnitte entwässern und die Herzen in Paraffin einbetten.
    1. 4 µm Dicke Abschnitte schneiden und deparaffinize sie nach Routine Laborverfahren. Ob und wie Antigen-Retrieval durchgeführt werden muss, muss für jedes einzelnen Setup festgelegt werden, da es die Antikörper-Kombination abhängig.
    2. Die Abschnitte für 10 min in 0,2 % Triton-X-100/Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS), gefolgt von 3 x 5 min Wäschen in El permeabilize
    3. Blockieren sie mit 3 % BSA/TBS für 1 h bei Raumtemperatur.
    4. Brüten sie über Nacht bei 4 ° c [Primärantikörper: Ziege α ChAT (01:50), Kaninchen α TH (1: 500), Huhn α Neurofilamente (1:1 000)] oder 2 h bei Raumtemperatur (Fluoreszenz-markierten Sekundärantikörper, 1: 500) in 1 % BSA/TBS mit 3 x 5 min TBS dazwischen wäscht.
    5. 1 µg/mL Bisbenzimide H33342 Trihydrochloride der Sekundärantikörper Projektmappe hinzufügen oder eine andere nukleare Färbung Methode verwenden.
    6. Montieren Sie die Folien in einem Eindeckmittel für fluoreszierende Färbung.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt ein Bild von Langendorff Setup inklusive 2 Multi-Elektroden (MEAs). Vor dem Experiment ist der intrakardiale Katheter positioniert, in der Nähe der Kanüle, eine schnelle und einfache Einfügung in den rechten Atrium/rechten Ventrikel zu erleichtern und eine kurze Zeit bis die Gleichgewichtherstellung anfangen kann zu gewährleisten. Der untere Teil der Kammer kann (siehe die Pfeile in Abbildung 1) erhöht werd...

Diskussion

In diesem Manuskript ist das bekannte Langendorff ex Vivo Herz Perfusion System als Instrument zur Untersuchung der Auswirkungen von intrakardialen Neuronen auf kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenesis mit unterschiedlichen Mapping und stimulationstechniken vorgestellt. einschließlich endokardialen und epicardial Ansätze.

Mehrere Teile des Protokolls sind entscheidend für das Setup. Erstens ist es wichtig, eine Vorbereitung Technik zu verwenden, in der das Vorhofflimmern Fe...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014	Modified Krebs-Henleit solution
Sodium hydrogencarbonate	Sigma-Aldrich	401676	Modified Krebs-Henleit solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405	Modified Krebs-Henleit solution
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655	Modified Krebs-Henleit solution
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M1880	Modified Krebs-Henleit solution
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902	Modified Krebs-Henleit solution
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	Modified Krebs-Henleit solution
Sodium pyruvate bioXtra	Sigma-Aldrich	P8574	Modified Krebs-Henleit solution
Carbogen (95% O2 / 5% CO2)	SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany	Modified Krebs-Henleit solution
Sterile filter steritop-GP 0.22	EMD Millipore	SCGPT05RE	Modified Krebs-Henleit solution
Atropine sulfate	Sigma-Aldrich	A0257	Neuromodulation
Hexamethonium chloride	Sigma-Aldrich	H2138	Neuromodulation
Nicotine free base 98-100%	Sigma-Aldrich	N3876	Neuromodulation
Formalin solution neutral buffered 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Whole mount staining
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	252859	Whole mount staining
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Whole mount staining
Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	H1009	Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	D8418	Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tablets	Gibco / Invitrogen	18912-014	Whole mount staining
Triton-x-100	Sigma-Aldrich	T8787	Whole mount staining
Albumin bovine fraction V	Biomol, Hamburg, Germany	11924.03	Whole mount staining
Chicken anti neurofilament	EMD Millipore	AB5539	Whole mount staining
Rabbit anti tyrosine hydroxylase	EMD Millipore	AB152	Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferase	EMD Millipore	AP144P	Whole mount staining
Donkey α rabbit IgG Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	Whole mount staining
Donkey α goat IgG Alexa 568	Thermo Fisher Scientific	A11057	Whole mount staining
Donkey α chicken IgY Alexa 647	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	AP194SA6	Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α rabbit igG	R&D Systems	AP182B	Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α goat igG	R&D Systems	AP192P	Whole mount staining
Biotin-conjugated goat α chicken igY	R&D Systems	BAD010	Whole mount staining
Vectashield mounting medium	Vector laboratories, Burlingame, CA, USA	H-1000	Immunohistochemistry
Vectastain ABC kit	Vector laboratories, Burlingame, CA, USA	PK-4000	Immunohistochemistry
Steady DAB/Plus	Abcam plc, Cambridge, UK	ab103723	Whole mount staining
HistoClear	DiaTec, Bamberg, Germany	HS2002	Immunohistochemistry
BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	B2261	Immunohistochemistry
Vectashield HardSet mounting medium	Vector laboratories, Burlingame, CA, USA	VEC-H-1400	Immunohistochemistry
Perfusion system	HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany	73-4343	Langendorff apparatus
Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter	Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand	PL3508 PowerLab 8/35	Langendorff setup
Octapolar catheter	CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA	custom	Langendorff setup
Stimulus generator	STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	STG4002-160µA	Stimulation setup
Stimulation software	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	MC_Stimulus II	Stimulation setup
Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms	ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	USB-ME128-System	MEA setup
Multi-electrode array	MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	EcoFlexMEA36	MEA setup
Multi-electrode array recording software	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	MC_Rack	MEA setup
Spring scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15003-08	Heart Preparation
Strabismus Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14575-09	Heart Preparation
Mayo Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14110-15	Heart Preparation
Dumont SS Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11203-25	Heart Preparation
London Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11080-02	Heart Preparation
Narrow Pattern Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11003-13	Heart Preparation
Plastic Wrap	Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States		Consumable Materials
Stereomicroscope	Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany		FRET
LED	CoolLED, Andover, UK	pE-100	FRET
DualView	Photometrics, Tucson, AZ, USA	DV2-SYS	FRET
DualView filter set	Photometrics, Tucson, AZ, USA	05-EM	FRET
optiMOS scientific CMOS camera	Qimaging, Surrey, BC, Canada	01-OPTIMOS-R-M-16-C	FRET
Imaging software	Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA		FRET
Analysis Software	Image J software; Public Domain, NIH, USA		FRET