Impact des neurones intracardiaques sur l’électrophysiologie cardiaque et arythmogenèse dans un système de Langendorff Ex Vivo

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour la modulation du système nerveux autonome intracardiaque et l’évaluation de son influence sur l’électrophysiologie fondamentale, arythmogenèse et cAMP dynamique en utilisant une configuration de Langendorff ex vivo .

Résumé

Depuis son invention à la fin du 19^ème siècle, le système de perfusion Langendorff ex vivo le cœur continue d’être un outil pertinent pour étudier un large éventail de paramètres physiologiques, morphologiques, biochimiques et pharmacologiques coeurs au centre dénervés. Nous décrivons ici une configuration pour la modulation du système nerveux autonome intracardiaque et l’évaluation de son influence sur l’électrophysiologie fondamentale, arythmogenèse et dynamique de l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc). Système nerveux autonome intracardiaque est modulé par la dissection mécanique de graisse auriculaire tampons-dans les ganglions murines sont situées principalement — ou par l’utilisation d’interventions pharmacologiques ciblées mais aussi mondiales. Un cathéter électrophysiologiques octapolar est introduit dans l’oreillette droite et le ventricule droit et tableaux multi-électrode épicardique placés (MEA) pour la cartographie à haute résolution sont utilisés pour déterminer l’arythmogenèse et électrophysiologie cardiaque. Transfert d’énergie par résonance Förster (FRET) d’imagerie est réalisée pour la surveillance en temps réel du taux d’AMPc dans différentes régions cardiaques. Neuromorphology est étudié au moyen d’anticorps-basée la coloration des coeurs entiers à l’aide de marqueurs neurones pour guider l’identification et la modulation des objectifs spécifiques du système nerveux autonome intracardiaque dans les études effectuées. La configuration de Langendorff ex vivo permet pour un grand nombre d’expériences reproductibles en peu de temps. Néanmoins, la nature en partie ouverte de l’installation (p. ex.., pendant les mesures de la MEA) contrôle de température constante est difficile et doit être maintenue à un minimum. Cette méthode décrite permet d’analyser et de moduler l’intracardiaque système nerveux dans les coeurs décentralisé.

Introduction

Le système de perfusion Langendorff ex vivo le cœur continue d’être un outil pertinent pour effectuer un large éventail de morphologiques, biochimiques et physiologiques, et des études pharmacologiques dans dénervé centralement coeurs^{1,2 ,3,4,5} depuis son invention en fin 19^ème siècle⁶. A ce jour, ce système est encore largement utilisé pour divers sujets (p. ex.., ischémie reperfusion) ou étudier cardiaque pharmacologique effets^7,8et est un outil de base en recherche cardiovasculaire. La longévité de cette méthode résulte de plusieurs avantages (p. ex.., les mesures sont effectuées sans l’influence du système nerveux central ou autres organes, circulation systémique ou hormones circulantes). Si nécessaire, produits pharmaceutiques peuvent être ajoutés de façon contrôlée dans la mémoire tampon de perfusion ou appliqués directement à des structures spécifiques. Des expériences sont reproductibles, et un nombre relativement élevé d’expériences peut être effectué dans un court laps de temps. La nature ouverte (en partie) de l’installation peut faire la régulation de la température difficile et doit être pris en compte. Bien que le système de Langendorff est également utilisé dans la plus grande espèce⁹, petits animaux sont principalement utilisés comme le montage expérimental est moins complexe et une plus grande variabilité biologique (p. ex.., transgéniques modèles murins) peut être utilisé.

Le dispositif expérimental du présent protocole, l’influence du système nerveux autonome intracardiaque sur base paramètres électrophysiologiques, arythmogenèse ventriculaire, conduction épicardique et dynamique de l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) est évalué. Un grand nombre de ganglions intracardiaques, qui sont principalement situées dans les coussinets adipeux auriculaires et sont désormais bien connus pour contrôler l’électrophysiologie cardiaque indépendant de contrôle nerveux central, est que soit laissés intacts ou supprimé manuellement avec soin mécanique dissection. Une modulation pharmacologique du système nerveux autonome est réalisée à l’échelle mondiale en ajoutant des produits pharmaceutiques vers le tampon de perfusion ou localement par modulation ciblée des ganglions auriculaires. Après les expériences, les coeurs sont bien adaptés pour une évaluation immunohistological comme toutes les cellules sanguines ont été supprimées en raison de la perfusion continue, qui permet d’augmenter la qualité de la coloration.

L’objectif global des techniques décrites est d’offrir de nouvelles perspectives pour des études détaillées concernant l’incidence du système nerveux autonome sur l’électrophysiologie cardiaque et arythmogenèse dans le coeur de souris. Une raison d’utiliser cette technique est qu’il est possible d’étudier et de modifier le système nerveux sans l’impact du système nerveux central. Un avantage majeur est l’emploi facile des expériences pharmacologiques, dans quelles propriétés antiarythmiques ou pro - potentielles de vieux et nouveaux agents peuvent être testés. En outre, des modèles de souris transgéniques et knock-out de diverses maladies cardiaques sont disponibles pour étudier les mécanismes qui sous-tendent les arythmies, insuffisance cardiaque ou des maladies métaboliques. Cette approche a amélioré notre compréhension de la façon dont le système nerveux autonome au niveau auriculaire peut avoir des répercussions électrophysiologie cardiaque ventriculaire et l’induction des arythmies.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par les autorités locales des comités de l’utilisation, soins aux animaux de l’Université de Hambourg et l’état de Hambourg.

1. préparation de l’appareil de Langendorff

NOTE : Un système de perfusion Langendorff commercialement disponible est utilisé.

1. Préparer une solution de Krebs-Henseleit modifiée (119 mM de 25 mM de bicarbonate de sodium, 4,6 mM de 1,2 mM de phosphate de potassium monobasique, 1,1 mM de sulfate de magnésium, 2,5 mM de chlorure de calcium, 8,3 mM de glucose et de 2 millimètres de sodium, le chlorure de potassium, le chlorure de sodium pyruvate). Ajouter un mélange de 95 % de dioxyde de carbone oxygen/5% à la solution de perfusion afin d’éviter la précipitation de calcium. Filtrer le tampon avec une taille de pore de 0,22 µm.
2. Ajouter un agent pharmacologique au tampon pour étudier ses effets sur l’électrophysiologie cardiaque et arythmogenèse selon les besoins.
3. Commencer le bain d’eau et placer la solution de perfusion comprenant un mélange de 95 % de dioxyde de carbone oxygen/5% en elle. Réglez la température du bain, afin que la température de la solution de perfusion directement avant la canule est ~ 37 ˚C.
4. Démarrer la pompe à rouleaux et remplir l’appareil avec la solution de perfusion dès que la température voulue est atteinte.
5. Régler la vitesse de la pompe avant d’attacher le coeur, afin qu’aucune bulle d’air n’est laissés dans la canule, lors du montage de l’appareil.

2. hard - et Software préparation

1. Raccorder un système d’acquisition de données numérique et son logiciel correspondant à l’appareil de Langendorff pour un enregistrement continu de la pression de perfusion, le débit et la fréquence cardiaque.
   1. Réglez la pression de perfusion ciblées dans les paramètres généraux à 80 mmHg.
   2. Démarrer l’enregistrement.
2. Utiliser un cathéter d’électrophysiologie (Table des matières) avec électrodes de platine, une surface de l’électrode de 0,5 x 0,5 mm et un espacement de l’électrode de 0,5 mm pour l’enregistrement des données et de la stimulation avec un générateur numérique de stimulus désigné.
   1. Placer le cathéter à proximité de la zone où le cœur sera positionné après l’attachement à l’appareil.
   2. Préparer la stimulation en sélectionnant 2 électrodes dans le cathéter et utiliser une longueur de cycle de 100 ms.

3. préparation du cœur

1. Ajouter le froid (~ 2-4 ° c) tampon de perfusion (10-20 et 40-50 mL, pour que le plat entier est couvert) pour les 2 boîtes de Pétri (diamètre de 6 cm et 10 cm) et le plat avec la canule et le lieu sur glace directement et sous le microscope. Préparer un double noeud autour de la canule.
2. Rapidement l’accise cœur après la dislocation cervicale en ouvrant le thorax à l’aide de ciseaux de Mayo et pinces modèle étroit. Puis saisissez l’aorte et la veine cave supérieure au-dessus du diaphragme à l’aide de la pince de Londres et excise le bloc coeur-poumons en coupant tous les navires et les tissus conjonctifs à proximité de la colonne vertébrale avec les ciseaux strabisme.
3. Transférer le bloc coeur-poumons dans le premier plat (6 cm de diamètre) rempli avec le tampon glacé et retirer délicatement les poumons sans endommager le cœur à l’aide de ciseaux strabisme et pinces à Londres. Placez ensuite le coeur sous le microscope et retirer délicatement le thymus, le œsophage et la trachée, à l’aide de ciseaux de printemps et pinces Dumont SS.
4. Les ciseaux de printemps permet de découper un trou de 1,5 à 2 mm dans la partie supérieure de l’oreillette droite par l’insertion du cathéter. Découper un trou dans l’artère pulmonaire. Puis couper l’aorte directement sous les branches supraaortic et retirer le tissu de l’aorte, afin que le noeud peut être fixé facilement.
5. Gardez les coussinets adipeux auriculaires, dont le major atrially situé ganglionated plexi, autour de l’atrium gauche intact ou de les supprimer complètement par une dissection minutieuse.
6. Transférer le cœur dans le plat avec la canule et le placer sous le microscope. Rangez-vous l’aorte la canule avec la pince Dumont SS et attacher le noeud disposé autour de l’aorte. Assurez-vous que la canule n’est pas placée trop profondément dans l’aorte afin que la valve aortique et les vaisseaux coronaires sont laissées libres.
7. Fixer la canule rapidement à l’appareil de Langendorff. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans la canule.
8. Passer la pression de perfusion à 80 mmHg, ce qui permet une perfusion de pression constante.
9. Placer le cathéter avec soin dans l’oreillette droite et le ventricule droit sans toucher ni endommager le coeur et fixer le cathéter à la canule avec du ruban adhésif.
10. Commencer la stimulation avec la longueur du cycle de prêt de 100 ms pour une période d’équilibration initiale de 20 min.
11. Fermer la chambre pour permettre à une température stable.

4. arythmogenèse et paramètres électrophysiologiques

1. Appliquer une stimulation programmée via les électrodes distales ou proximales du cathéter à deux fois le seuil stimulation d’auriculaire ou ventriculaire pour évaluer les paramètres électrophysiologiques, tel que décrit dans les étapes suivantes.
   1. Déterminer le temps de récupération du n ud sinusal comme la durée maximale de retour après 10 s de taux fixe une stimulation à une longueur de cycle S1S1 de 120 ms, ms 100 et 80 ms.
   2. Déterminer le point de Wenckebach comme la longueur plus longue du cycle S1S1 (8 stimuli ; S1S1 : 100 ms ; réduction par étapes de 2 ms) avec une perte de 11 conduction nodale AV. Déterminer les périodes réfractaires nodales auriculoventriculaire comme la plus longue S1S2 (12 stimulus ; S1S1 : 120 ms, ms 110 et 100 ms ; une courte associée extrastimulus 2 ms stepwise S1S2) avec une perte de conduction nodale AV.
   3. Déterminer les périodes réfractaires auriculaires et ventriculaires, comme la plus longue S1S2 (12 stimulus ; S1S1 : 120 ms, ms 110 et 100 ms ; une courte associée extrastimulus 2 ms stepwise S1S2) avec une réponse auriculaire ou ventriculaire absente^10,11.
2. Effectuer une extrastimulation programmée (S1S1 : 120 ms, ms 100 et 80 ms, suivies jusqu'à 3 battements supplémentaires ; 60-20 ms avec une réduction progressive de 2 ms) ou éclatement des protocoles de stimulation (5 s à S1S1 : 50-10 ms avec une réduction par étapes de 10 ms) conformément aux Conventions de Lambeth à eva luate l’arythmogenèse ventriculaire^10,11,12.

5. les mesures de Conduction épicardique

Remarque : Enregistrer électrogrammes épicardique en utilisant un système d’enregistrement 128 canaux, assistée par ordinateur avec une fréquence d’échantillonnage de 25 kHz pour la cartographie à haute résolution. Utiliser un tableau multi-électrode 32 (MEA ; inter-électrode distance : 300 µm ; 1,8 x 1,8 mm). Notez que les données étaient passe-bande filtré (50 Hz) et numérisé avec 12 bits et une gamme de signal de 20 mV.

1. Placez la MEA dans la zone désignée du cœur et ajouter la mise à la terre à une autre partie du cœur^13,14,15.
2. Placer un cathéter de stimulation épicardique à proximité de la MEA et commencer une stimulation constante.
3. Démarrer l’enregistrement après la confirmation du bon contact des électrodes en vérifiant la qualité du signal et l’amplitude.
4. Utiliser une analyse hors ligne pour la détermination de la vitesse de propagation des ondes et de la dispersion dans le sens de conduction.

6. Förster Resonance Energy Transfer frette cyclique l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) imagerie

Remarque : Pour les mesures axées sur la frette, récolter des coeurs de CAG-Epac1-camps souris transgéniques¹⁶.

1. Utiliser un système d’imagerie auto-construits autour un stéréomicroscope^15,17.
2. Placez le stéréomicroscope devant le cœur et l’ajuster d’acuité.
3. Exciter le capteur cAMP avec une source lumineuse [par exemple, l’aide d’une seule longueur d’onde lumière diode électroluminescente (440 nm)]. Diviser l’émission lumineuse dans des canaux donneur et accepteur en utilisant un séparateur de faisceau (pour une paire de protéine fluorescente cyan fluorescent protein/jaune, utiliser un 565dcxr miroir dichroïque et filtres d’émission D480/30 et D535/40).
4. Assurer une température stable en mettant une pellicule de plastique autour de la chambre.
5. Prendre des photos en utilisant une caméra scientifique complementary metal-oxide-semiconductor (sCMOS). Coordonner la source lumineuse et la caméra capture d’image avec un open source logiciel tel que Micro-Manager d’imagerie.
6. Pour démarrer l’acquisition de l’image, poussez l' Acq Multi-D. bouton et de mettre en place un Time-lapse, qui acquiert une image toutes les 10 s, avec le temps d’exposition appropriée, qui dépend de la puissance du signal fluorescent (environ 100 ms).
7. Le précédemment décrite et disponible vous inquiétez pas en ligne et la base en ligne 2 plugins¹⁷ permet de diviser l’image en deux canaux, sélectionnez les régions d’intérêt et surveiller le traçage de ratio.
8. Lors de l’acquisition, perfuse le cœur avec la solution de Krebs-Henseleit modifiée contenant des substances différentes, selon la nature de l’expérience.
9. À la fin de l’expérience, éteignez l’acquisition en appuyant sur le bouton arrêter et enregistrer la pile d’images.
10. Analyser les données FRET hors ligne en utilisant un logiciel d’analyse dédié qui peut diviser les images en deux sections identiques pour les canaux donneur et accepteur et pouvant effectuer des analyses de frette dans plusieurs régions d’intérêt.
    Remarque : Un dédié plug-in (vous inquiétez pas en mode hors connexion) est nécessaire, ce qui est fourni dans Sprenger et al. ¹⁷.
    1. Lancez le logiciel. Ouvrir l’analyse en allant dans le menu Plugins , puis cliquez sur MicroManager, puis sur Ouvrir le fichier Micro-Manager.
    2. Exécuter le plugin vous inquiétez pas en mode hors connexion pour le Time-lapse scindée en deux images identiques pour les canaux de la PCP et la YFP.
    3. Utilisez l’outil de Sélection à main levée à l’occasion de la région d’intérêt dans l’image de la YFP. Appuyez sur le bouton Ajouter pour ajouter la sélection à la fenêtre de Mesure Multi .
    4. Choisissez la région d’intérêt dans la fenêtre de Mesure Multi et appuyez sur Multi pour obtenir un tableau avec des valeurs moyennes de gris pour chaque cadre et chaque région. Copiez et collez les données dans une feuille Excel.
    5. Cliquez sur la PCP Image pile. Effectuer les mêmes opérations qu’à l’étape 6.10.4 pour la pile de la CFP et collez les valeurs moyennes de gris dans la même feuille Excel.
11. Corriger les données brutes en mode hors connexion pour le facteur cordeau du donateur dans l’accepteur canal¹⁷.
    1. Utilisez la formule suivante, où B est le facteur le cordeau :
       Ratio = (YFP - B x CFP) / CFP
    2. Déterminer le facteur de cordeau B Imaging un cœur exprimant CFP seulement et de mesurer le pourcentage de la fluorescence du donneur dans le chenal de la YFP (B = YFP / CFP).

7. Neuromorphology

NOTE : Analyser l’intracardiaque système nerveux à l’aide d’immunostainings entier-montent des cœurs murine intact. Notez que la majorité des ganglions intracardiaques est localisée dans le tissu adipeux épicardique près les veines pulmonaires.

1. Utiliser différentes salissures pour la représentation des neurofilaments (structures neuronales générales ; poulet anti-NF-H, 1:3, 000), tyrosine hydroxylase (TH, des structures neuronales sympathiques ; lapin α TH, 1:1, 000) et la choline acétyltransférase (ChAT, parasympathique structures neuronales ; chèvre α ChAT, 01:50).
2. Après la perfusion dans l’appareil de Langendorff, fixer le cœur de souris dans 10 mL de formol pendant 24 h et stockez-les en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 4 ° c.
3. Blanchir les cœurs en agent de blanchiment de Dent (4:1:1 méthanol : peroxyde d’hydrogène solution 30 % (p/p) dans H₂o : le diméthylsulfoxyde (DMSO)) pendant 1 semaine à 4 ° c et réhydrater par la suite aux PBS d’une série de descendant de méthanol dans du PBS (100 %, 75 %, 50 %, 25 % ; 1 h chaque) ¹⁸.
4. Effectuez les incubations suivantes dans un format de 24-puits-plat avec une agitation modérée à 4 ° c :
   1. Permeabilize âmes en 1 % Triton-X-100/PBS (PBS-T) 3 x 1 h à température ambiante avant de les bloquer du jour au lendemain dans un tampon de blocage [5 % d’albumine sérique bovine (BSA) / PBS-T + 0,2 % d’azide de sodium].
   2. Diluer les anticorps comme suit : chèvre α ChAT (01:50), lapin α TH (1:1, 000), neurofilaments α de poulet (1:3, 000) ; Anticorps secondaires pour le marquage fluorescent (1/500 ; ou selon les instructions du fabricant) ; Anticorps secondaires biotinylés d’étiquetage chromogène (1 : 200 ; ou selon les instructions du fabricant).
5. Incuber les échantillons à l’anticorps primaires dilués dans un tampon bloquant pendant 1 semaine à 4 ° c.
6. Laver les coeurs pour 3 x 15 min à PBS-T avant l’incubation de l’anticorps secondaire dans un tampon bloquant pendant 4 jours.
7. Laver les coeurs pour 3 x 15 min à PBS-T et stockez-les dans un milieu de montage pour une coloration fluorescente pendant 3 h à température ambiante ou utiliser un kit de détection complexe avidine-biotine selon les instructions du fabricant.
8. Avant Incuber les coeurs dans un tampon commercial pour 3, 3'-diaminobenzidine (DAB), pendant 1 heure avant de les développer sous un contrôle visuel dans un tampon contenant du DAB selon les instructions du fabricant.
9. Stocker les échantillons dans l’eau bidistillée.
10. Pour les sections de paraffine, déshydrater et incorporer les cœurs à la paraffine.
    1. Coupes épaisses de 4 µm et les Déparaffiner selon les procédures du laboratoire de routine. Si et comment recherche d’antigène doit être effectuée doit être établie pour chaque installation individuelle puisque cela dépend de la combinaison de l’anticorps.
    2. Permeabilize les sections pendant 10 min dans 0,2 % Triton X-100/Tris-salin (SCT), suivie de 3 x 5 min lavages dans les directives du SCT.
    3. Les bloquer avec 3 % BSA/SCT pendant 1 h à température ambiante.
    4. Les incuber une nuit à 4 ° c [anticorps primaires : chèvre α ChAT (01:50), lapin α TH (1/500), poulet neurofilament α (1:1, 000)] ou 2 h à température ambiante (anticorps secondaires marqués par fluorescence, 1/500) chez 1 % BSA/SCT avec 3 x 5 min lave SCT entre les deux.
    5. Ajouter 1 µg/mL de TRIHYDROCHLORURE de H33342 bisbenzimide à la solution d’anticorps secondaire ou utilisez une autre méthode de coloration nucléaire.
    6. Monter les diapositives dans un milieu de montage pour une coloration fluorescente.

Résultats

La figure 1 montre une image de l’installation de Langendorff dont 2 rangées d’électrodes multiples (AME). Avant l’expérience, le cathéter intracardiaque est positionné à proximité de la canule pour faciliter une insertion rapide et facile dans le ventricule droit atrium/droit tout en assurant une courte période de temps jusqu'à ce que l’équilibration peut commencer. La partie inférieure de la chambre peut être accrue (voir les flèches da...

Discussion

Dans ce manuscrit, le système de perfusion du Langendorff ex vivo coeur bien connu est présenté comme un outil pour étudier l’impact des neurones intracardiaques sur l’électrophysiologie cardiaque et arythmogenèse en utilisant la cartographie différente et les techniques de stimulation y compris les approches endocardiques et épicardiques.

Plusieurs parties du protocole sont cruciales pour le programme d’installation. Tout d’abord, il est important d’utiliser une tec...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014	Modified Krebs-Henleit solution
Sodium hydrogencarbonate	Sigma-Aldrich	401676	Modified Krebs-Henleit solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405	Modified Krebs-Henleit solution
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655	Modified Krebs-Henleit solution
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M1880	Modified Krebs-Henleit solution
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902	Modified Krebs-Henleit solution
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	Modified Krebs-Henleit solution
Sodium pyruvate bioXtra	Sigma-Aldrich	P8574	Modified Krebs-Henleit solution
Carbogen (95% O2 / 5% CO2)	SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany	Modified Krebs-Henleit solution
Sterile filter steritop-GP 0.22	EMD Millipore	SCGPT05RE	Modified Krebs-Henleit solution
Atropine sulfate	Sigma-Aldrich	A0257	Neuromodulation
Hexamethonium chloride	Sigma-Aldrich	H2138	Neuromodulation
Nicotine free base 98-100%	Sigma-Aldrich	N3876	Neuromodulation
Formalin solution neutral buffered 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Whole mount staining
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	252859	Whole mount staining
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Whole mount staining
Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	H1009	Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	D8418	Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tablets	Gibco / Invitrogen	18912-014	Whole mount staining
Triton-x-100	Sigma-Aldrich	T8787	Whole mount staining
Albumin bovine fraction V	Biomol, Hamburg, Germany	11924.03	Whole mount staining
Chicken anti neurofilament	EMD Millipore	AB5539	Whole mount staining
Rabbit anti tyrosine hydroxylase	EMD Millipore	AB152	Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferase	EMD Millipore	AP144P	Whole mount staining
Donkey α rabbit IgG Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	Whole mount staining
Donkey α goat IgG Alexa 568	Thermo Fisher Scientific	A11057	Whole mount staining
Donkey α chicken IgY Alexa 647	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	AP194SA6	Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α rabbit igG	R&D Systems	AP182B	Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α goat igG	R&D Systems	AP192P	Whole mount staining
Biotin-conjugated goat α chicken igY	R&D Systems	BAD010	Whole mount staining
Vectashield mounting medium	Vector laboratories, Burlingame, CA, USA	H-1000	Immunohistochemistry
Vectastain ABC kit	Vector laboratories, Burlingame, CA, USA	PK-4000	Immunohistochemistry
Steady DAB/Plus	Abcam plc, Cambridge, UK	ab103723	Whole mount staining
HistoClear	DiaTec, Bamberg, Germany	HS2002	Immunohistochemistry
BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	B2261	Immunohistochemistry
Vectashield HardSet mounting medium	Vector laboratories, Burlingame, CA, USA	VEC-H-1400	Immunohistochemistry
Perfusion system	HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany	73-4343	Langendorff apparatus
Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter	Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand	PL3508 PowerLab 8/35	Langendorff setup
Octapolar catheter	CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA	custom	Langendorff setup
Stimulus generator	STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	STG4002-160µA	Stimulation setup
Stimulation software	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	MC_Stimulus II	Stimulation setup
Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms	ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	USB-ME128-System	MEA setup
Multi-electrode array	MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	EcoFlexMEA36	MEA setup
Multi-electrode array recording software	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	MC_Rack	MEA setup
Spring scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15003-08	Heart Preparation
Strabismus Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14575-09	Heart Preparation
Mayo Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14110-15	Heart Preparation
Dumont SS Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11203-25	Heart Preparation
London Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11080-02	Heart Preparation
Narrow Pattern Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11003-13	Heart Preparation
Plastic Wrap	Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States		Consumable Materials
Stereomicroscope	Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany		FRET
LED	CoolLED, Andover, UK	pE-100	FRET
DualView	Photometrics, Tucson, AZ, USA	DV2-SYS	FRET
DualView filter set	Photometrics, Tucson, AZ, USA	05-EM	FRET
optiMOS scientific CMOS camera	Qimaging, Surrey, BC, Canada	01-OPTIMOS-R-M-16-C	FRET
Imaging software	Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA		FRET
Analysis Software	Image J software; Public Domain, NIH, USA		FRET