Impatto dei neuroni intracardiaci elettrofisiologia cardiaca e aritmogenesi in un sistema di Langendorff Ex Vivo

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per la modulazione del sistema nervoso autonomo intracardiaco e la valutazione della sua influenza su base elettrofisiologia, aritmogenesi e accampamento dinamica utilizzando un'installazione di Langendorff ex vivo .

Abstract

Sin dalla sua invenzione nel tardo 19^° secolo, il sistema di perfusione Langendorff ex vivo cuore continua ad essere uno strumento rilevante per lo studio di un ampio spettro di parametri fisiologici, biochimici, morfologici e farmacologici in cuore centrale denervato. Qui, descriviamo una configurazione per la modulazione del sistema nervoso autonomo intracardiaco e la valutazione della sua influenza su base elettrofisiologia, aritmogenesi e le dinamiche dell'adenosina monofosfato ciclico (cAMP). Il sistema nervoso autonomo intracardiaco è modulato da dissezione meccanica di grasso atriale pastiglie-in cui gangli murini si trovano principalmente — o dall'utilizzo degli interventi farmacologici globali, nonché mirati. Un catetere elettrofisiologici di octapolar è stato introdotto in atrio destro e ventricolo destro, e dell'epicardio-disposto multi-elettrodo matrici (MEA) per la mappatura ad alta risoluzione vengono utilizzate per determinare aritmogenesi ed elettrofisiologia cardiaca. Trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) imaging viene eseguito per il monitoraggio in tempo reale dei livelli di cAMP in diverse regioni cardiache. Neuromorphology è studiato per mezzo di anticorpo-basato colorazione dei cuori interi usando marcatori neuronali per guidare l'identificazione e la modulazione degli obiettivi specifici del sistema nervoso autonomo intracardiaco negli studi eseguiti. L'impostazione di Langendorff ex vivo permette per un elevato numero di esperimenti riproducibili in breve tempo. Tuttavia, la natura in parte aperta del setup (ad es., durante le misurazioni MEA) rende difficile il controllo costante della temperatura e deve essere mantenuto al minimo. Questo metodo descritto rende possibile analizzare e modulano il sistema nervoso autonomo intracardiaco nei cuori decentralizzati.

Introduzione

Il sistema di perfusione Langendorff ex vivo cuore continua ad essere uno strumento rilevante per l'esecuzione di un ampio spettro di fisiologici, biochimici, morfologici e studi farmacologici in centrale denervato cuori^{1,2 ,3,4,5} sin dalla sua invenzione nel tardo 19^th secolo⁶. Ad oggi, questo sistema è ancora ampiamente usato per vari argomenti (ad es., ischemia riperfusione) o per lo studio cardiaco farmacologico effetti^7,8ed è uno strumento fondamentale nella ricerca cardiovascolare. La longevità di questo metodo risultati da diversi vantaggi (ad es., le misure sono eseguite senza l'influenza del sistema nervoso centrale o altri organi, la circolazione sistemica o ormoni circolanti). Se necessario, prodotti farmaceutici possono essere aggiunto in modo controllato il buffer di aspersione o applicati direttamente alle strutture specifiche. Gli esperimenti sono riproducibili, e un numero relativamente elevato di esperimenti può essere eseguito in un breve periodo di tempo. La natura aperta (in parte) dell'installazione può rendere difficile la regolazione della temperatura e deve essere presa in considerazione. Anche se il sistema di Langendorff è utilizzato anche in più grandi specie⁹, animali più piccoli vengono utilizzati principalmente come la messa a punto sperimentale è meno complesso e una maggiore variabilità biologica (ad es., transgenici modelli murini) può essere utilizzato.

Nel setup sperimentale del presente protocollo, è l'influenza del sistema nervoso autonomo intracardiaco su parametri elettrofisiologici di base, aritmogenesi ventricolare, conduzione dell'epicardio e dinamiche dell'adenosina monofosfato ciclico (cAMP) valutati. Un gran numero di gangli intracardiaci, che sono situate principalmente nei cuscinetti adiposi atriali e si sono affermati per il controllo indipendente dal controllo neurale centrale di elettrofisiologia cardiaca, è che sia lasciato intatto o manualmente rimosso con attenzione meccanica dissezione. Una modulazione farmacologica del sistema nervoso autonomo viene eseguito a livello globale con l'aggiunta di prodotti farmaceutici nel buffer di aspersione o localmente da modulazione mirata dei gangli atriali. Dopo gli esperimenti, i cuori sono adatti per una valutazione immunohistological come tutte le cellule del sangue sono stati rimossi a causa di aspersione di continuo, che può aumentare la qualità della colorazione.

L'obiettivo generale delle tecniche descritte è di offrire nuove prospettive per gli studi dettagliati per quanto riguarda l'impatto del sistema nervoso autonomo sulla elettrofisiologia cardiaca e aritmogenesi nel cuore del mouse. Un motivo per utilizzare questa tecnica è che è possibile studiare e alterare il sistema nervoso autonomo senza l'impatto del sistema nervoso centrale. Uno dei principali vantaggi è l'occupazione facile degli esperimenti farmacologici, in quali potenziali proprietà pro - o antiaritmico di vecchi e nuovi agenti possono essere testati. Inoltre, modelli murini transgenici e knockout di varie malattie cardiache sono disponibili per studiare i meccanismi alla base di aritmie, infarto o malattie metaboliche. Questo approccio ha migliorato la nostra comprensione di come il sistema nervoso autonomo a livello atriale possono avere un impatto elettrofisiologia cardiaca ventricolare e l'induzione di aritmie.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dalle autorità locali, di stato di Amburgo, la cura degli animali Università di Amburgo e comitati di uso.

1. preparazione dell'apparato di Langendorff

Nota: Viene utilizzato un sistema di perfusione di Langendorff commercialmente disponibile.

1. Preparare una soluzione modificata di Krebs-Henseleit (119 mM di cloruro di sodio, 25mm di bicarbonato di sodio, 4,6 mM di cloruro di potassio, 1,2 millimetri di fosfato di potassio monobasico, 1,1 mM di solfato di magnesio, 2,5 mM di cloruro di calcio, 8,3 di glucosio e 2 mM di sodio piruvato). Aggiungere una miscela di anidride carbonica oxygen/5% 95% per la soluzione di perfusione per impedire la precipitazione del calcio. Filtrare il buffer con una dimensione dei pori di 0,22 µm.
2. Aggiungere un agente farmacologico il buffer per studiare il suo effetto sulla elettrofisiologia cardiaca e aritmogenesi come necessario.
3. Avviare la vasca di acqua e mettere la soluzione di perfusione tra cui una miscela di anidride carbonica 95% oxygen/5% in esso. Regolare la temperatura del bagno d'acqua, in modo che la temperatura della soluzione di perfusione direttamente prima la cannula è ~ 37 ˚ c.
4. Avviare la pompa roller e riempire l'apparecchio con la soluzione di perfusione, non appena viene raggiunta la temperatura corretta.
5. Regolare la portata pompa prima di fissare il cuore, in modo che bolle d'aria non vengono lasciati nella cannula montando all'apparato.

2. hard - e Software di preparazione

1. Collegare un sistema di acquisizione dati digitali e il relativo software corrispondente all'apparato di Langendorff per una registrazione continua di aspersione pressione, portata e frequenza cardiaca.
   1. Impostare la pressione di perfusione mirati nelle impostazioni generali a 80 mmHg.
   2. Avviare la registrazione.
2. Utilizzare un catetere di elettrofisiologia (Tabella materiali) con elettrodi di platino, una superficie dell'elettrodo di 0.5 x 0.5 mm e una spaziatura di elettrodo di 0,5 mm per la registrazione dei dati e la stimolazione con un generatore di stimolo digitale designato.
   1. Posizionare il catetere vicino alla zona dove il cuore verrà posizionato dopo l'allegato all'apparecchio.
   2. Preparare la stimolazione selezionando 2 elettrodi dal catetere e utilizzare una lunghezza di ciclo di 100 ms.

3. preparazione del cuore

1. Aggiungere il freddo (~ 2-4 ˚ c) buffer di aspersione (10-20 mL e 40-50 mL, affinché l'intera pietanza è coperto) per i 2 piatti Petri (diametro di 6 cm e 10 cm) e il piatto con la cannula e posto loro il ghiaccio direttamente successiva e sotto il microscopio. Preparare un doppio nodo intorno la cannula.
2. Accise rapidamente il cuore dopo dislocazione cervicale con l'apertura del torace utilizzando Mayo forbici e pinze modello stretto. Poi afferrare l'aorta e la vena cava sopra il diaframma usando il forcipe di Londra e asportare il blocco cuore-polmoni tagliando tutti i vasi sanguigni e del tessuto connettivo vicino alla colonna vertebrale con le forbici di strabismo.
3. Trasferire il blocco cuore-polmoni nel primo piatto (6 cm di diametro) riempito con il buffer ghiacciato e con attenzione rimuovere i polmoni senza danneggiare il cuore utilizzando strabismo forbici e pinze di Londra. Poi mettete il cuore sotto il microscopio e rimuovere con cautela il timo, l'esofago e trachea utilizzando forbici di primavera e forcipe Dumont SS.
4. Utilizzare le forbici di primavera per praticare un foro di 1,5-2 mm nella parte superiore dell'atrio destro per l'inserimento del catetere. Praticare un foro nell'arteria polmonare. Quindi tagliare l'aorta direttamente sotto i rami di supraaortic e rimuovere il tessuto dall'aorta, in modo che il nodo può essere collegato facilmente.
5. Tenere i cuscinetti adiposi atriali, comprese le principali atrially trova ganglionated plexi, intorno all'atrio sinistro intatto o rimuoverli completamente da dissezione accurata.
6. Trasferire il cuore al piatto con la cannula e posizionarlo sotto il microscopio. Accostare l'aorta la cannula con il forcipe Dumont SS e legare il nodo preparato strettamente intorno all'aorta. Assicurarsi che la cannula non è collocata troppo in profondità nell'aorta, in modo che la valvola aortica e le arterie coronariche sono lasciate liberi.
7. Collegare la cannula rapidamente all'apparato di Langendorff. Assicurarsi che non vi siano nessun bolle lasciato nella cannula.
8. Passare la pressione di perfusione a 80 mmHg, permettendo un'aspersione di pressione costante.
9. Inserire con cautela il catetere in atrio destro e ventricolo destro senza toccare o danneggiare il cuore e fissare il catetere alla cannula con nastro adesivo.
10. Iniziare la stimolazione con la lunghezza di ciclo di preparati di 100 ms per un periodo di equilibrazione iniziale 20 min.
11. Chiudere la camera per consentire una temperatura stabile.

4. aritmogenesi e parametri elettrofisiologici

1. Applicare una stimolazione programmate tramite gli elettrodi distale o prossimale del catetere a due volte l'atriale o ventricolare Soglia pacing per valutare i parametri elettrofisiologici come descritto nei passaggi seguenti.
   1. Determinare il tempo di recupero del nodo del seno come la lunghezza del ciclo di ritorno massimo dopo 10 s di ritmo a una lunghezza di ciclo S1S1 di 120 ms, 100 ms e 80 ms a tasso fisso.
   2. Determinare il punto del Wenckebach come la più lunga durata del ciclo S1S1 (8 stimoli; S1S1: 100 ms; riduzione graduale di 2 ms) con una perdita di conduzione nodale AV 11. Determinare i periodi refrattari nodali atrioventricolari come la più lunga S1S2 (12 stimoli; S1S1: 120 ms, 110 ms e 100ms; una corta accoppiato extrastimulus con una riduzione di S1S2 graduale di 2 ms) con una perdita di conduzione nodale di avoirdupois.
   3. Determinare i periodi refrattari atriali e ventricolari come la più lunga S1S2 (12 stimoli; S1S1: 120 ms, 110 ms e 100ms; una corta accoppiato extrastimulus con una riduzione di S1S2 graduale di 2 ms) con una risposta ventricolare o atriale assente^10,11.
2. Eseguire un extrastimulation programmata (S1S1: 120 ms, 100 ms e ms 80, seguita da fino a 3 battiti extra; 60-20 ms con una riduzione graduale di 2 ms) o scoppio protocolli di stimolazione (5 s a S1S1: 50-10 ms con una riduzione graduale di 10 ms) in linea con le convenzioni di Lambeth da eva preso le ventricolare aritmogenesi^10,11,12.

5. dell'epicardio conduzione misure

Nota: Registrare unipolare dell'epicardio elettrogrammi utilizzando un sistema di registrazione 128 canali, computer-assistita con una frequenza di campionamento di 25 kHz per la mappatura ad alta risoluzione. Utilizzare una matrice multi-elettrodo 32 (MEA; Inter-elettrodo distanza: 300 µm; 1.8 x 1.8 mm). Nota che i dati sono stati filtrati passa banda (50 Hz) e digitalizzati con 12 bit e una gamma di segnale di 20 mV.

1. Inserire il MEA nell'area designata del cuore e aggiungere la messa a terra per un'altra parte del cuore^13,14,15.
2. Posizionare un catetere di stimolazione dell'epicardio vicino la MEA e iniziare una stimolazione costante.
3. Avviare la registrazione dopo la conferma del buon contatto degli elettrodi controllando la qualità del segnale e l'ampiezza.
4. Utilizzare un'analisi non in linea per la determinazione della velocità di propagazione dell'onda e dispersione in direzione di conduzione.

6. Förster Resonance Energy Transfer FRET-base ciclica monofosfato di adenosina (accampamento) Imaging

Nota: Per le misure basate su FRET, raccogliere cuori dal CAG-Epac1-accampamenti topi transgenici¹⁶.

1. Utilizzare un sistema di imaging auto-costruito intorno un stereomicroscopio^15,17.
2. Posizionare lo stereomicroscopio davanti al cuore e regolarlo per acutezza.
3. Eccitare il sensore per l'AMPc con una fonte di luce [ad esempio, utilizzare una singola lunghezza d'onda diodo luminescente (440 nm)]. Dividere l'emissione di luce nel donatore e accettore canali utilizzando un divisore di fascio (per una coppia di proteina fluorescente ciano/giallo fluorescente proteine, uso un 565dcxr specchio dicroico e filtri di emissione D480/30 e D535/40).
4. Garantire una temperatura stabile mettendo un involucro di plastica intorno alla camera.
5. Prendere immagini utilizzando una fotocamera di complementary metal-oxide-semiconductor scientifica (sCMOS). Coordinare la sorgente luminosa e la telecamera cattura di immagine con un open source software come Micro-Manager di imaging.
6. Per avviare l'acquisizione dell'immagine, spingere la Multi-D Acq. pulsante e impostare un time-lapse, che acquisisce un'immagine ogni 10 s, con il tempo di esposizione appropriato, che dipende dalla forza del segnale fluorescente (circa 100 ms).
7. Uso il precedentemente descritto e disponibile FRET online e FRET online 2 plugin¹⁷ per dividere l'immagine in due canali, selezionare le regioni di interesse e monitorare l'analisi del rapporto.
8. Durante l'acquisizione, irrorare il cuore con la soluzione modificata di Krebs-Henseleit che contiene diverse sostanze, a seconda della natura dell'esperimento.
9. Alla fine dell'esperimento, spegnete l'acquisizione premendo il tasto Stop e salvare nello stack di immagini.
10. Analizzare i dati FRET offline utilizzando un software di analisi dedicato che può dividere le immagini in due sezioni identiche per i canali di donatore e accettore ed esegue analisi FRET in più regioni di interesse.
    Nota: Una dedicata plug-in (FRET non in linea) è necessaria, che viene fornito in Sprenger et al. ¹⁷.
    1. Avviare il software. Apri l'analisi accedendo al menu plugin , quindi fare clic su MicroManagere poi su Apri File di Micro-Manager.
    2. Eseguire il plugin FRET non in linea al fine di dividere il time-lapse in due immagini identiche per i canali di PCP e YFP.
    3. Utilizzare lo strumento di Selezione a mano libera per contrassegnare la regione di interesse nell'immagine YFP. Premere il pulsante Aggiungi per aggiungere la selezione alla finestra Multi misura .
    4. Scegliete la regione di interesse nella finestra Multi misura e premere Multi per ottenere una tabella con i valori medi di grigio per ogni fotogramma e la regione. Copiare e incollare tutti i dati in un foglio di Excel.
    5. Fare clic sulla serie di immagini di PCP. Eseguire le stesse azioni come nel passaggio 6.10.4 per lo stack di PCP e incollare i valori medi di grigio lo stesso foglio di Excel.
11. Correggere i dati non elaborati non in linea per il fattore di trapasso del donatore nell'accettore canale¹⁷.
    1. Utilizzare la seguente formula, dove B è il fattore di trapasso:
       Rapporto = (YFP - B x CFP) / PCP
    2. Determinare il fattore di trapasso B da imaging un cuore solo esprimendo la PCP e misurare la percentuale di fluorescenza donatore nel canale YFP (B = YFP / CFP).

7. Neuromorphology

Nota: Analizzare il sistema nervoso autonomo intracardiaco utilizzando intero-monta immunostainings del cuore murino intatto. Si noti che la maggior parte dei gangli intracardiaci è localizzata nel tessuto adiposo epicardico vicino alle vene polmonari.

1. Utilizzare diverse colorazioni per la raffigurazione di neurofilament (generale strutture neuronali; pollo anti-NF-H, 1:3, 000), tirosina idrossilasi (TH, strutture di un neurone simpatici; coniglio α TH, 1:1, 000) e la colina acetiltransferasi (ChAT, parasimpatico strutture di un neurone; capra α ChAT, 01:50).
2. Dopo l'aspersione nell'apparato di Langendorff, difficoltà i cuori di topo in 10 mL di formalina per 24 h e memorizzarli in tampone fosfato salino (PBS) a 4 ˚ c.
3. Candeggina i cuori in candeggina di Dent (4:1:1 metanolo: soluzione di perossido di idrogeno 30% (w/w) in H₂o: il solfossido dimetilico (DMSO)) per 1 settimana a 4 ˚ c e reidratare successivamente a PBS in una serie di discendenti di metanolo in PBS (100%, 75%, 50%, 25%; 1h ciascuna) ¹⁸.
4. Eseguire le seguenti incubazioni in un formato di piastra a 24 pozzetti con una movimentazione delicata a 4 ˚ c:
   1. Permeabilize i cuori nel 1% Triton X-100/PBS (PBS-T) per 3 x 1 h a temperatura ambiente prima di bloccare loro durante la notte in un tampone bloccante [5% albumina di siero bovino (BSA) / PBS-T + 0,2% sodio azide].
   2. Diluire gli anticorpi come segue: capra α ChAT (01:50), coniglio α TH (1:1, 000), neurofilament di pollo α (1:3, 000); anticorpi secondari per la etichettatura fluorescente (1: 500; o secondo le istruzioni del produttore); gli anticorpi secondari biotinilati per etichettatura cromogenico (1: 200; o secondo le istruzioni del produttore).
5. Incubare i campioni in anticorpi primari diluiti in un tampone bloccante per 1 settimana a 4 ˚ c.
6. Lavare i cuori per 3 x 15 min in PBS-T prima l'incubazione anticorpo secondario in un tampone bloccante per 4 giorni.
7. Lavare i cuori per 3 x 15 min in PBS-T e memorizzarli in un mezzo di montaggio per la colorazione fluorescente per 3 h a temperatura ambiente o utilizzare un kit di rilevazione complesso avidina-biotina secondo le istruzioni del produttore.
8. Pre-Incubare i cuori per 1h in un buffer commerciale per 3, 3'-diaminobenzidina (DAB), prima di sviluppare loro sotto un controllo visivo in un buffer contenente DAB secondo le istruzioni del produttore.
9. Conservare i campioni in doppio acqua distillata.
10. Per sezioni di paraffina, disidratare e incorporare i cuori in paraffina.
    1. Tagliare sezioni spesse 4-µm e deparaffinizzare li secondo le procedure di routine del laboratorio. Se e come ricupero dell'antigene deve essere eseguita deve essere stabilito per ogni singolo programma di installazione, poiché esso dipende dalla combinazione dell'anticorpo.
    2. Permeabilize le sezioni per 10 min a 0,2% Triton X-100/Tris-buffered saline (TBS), seguita da 3 x 5 min lavaggi in TBS.
    3. Bloccarli con 3% BSA/TBS per 1 h a temperatura ambiente.
    4. Incubare per una notte a 4 ˚ c [anticorpi primari: capra α ChAT (01:50), coniglio α TH (1: 500), pollo neurofilamento α (1:1, 000)] o a 2 h a temperatura ambiente (fluorescenza-etichettato anticorpi secondari, 1: 500) in 1% BSA/TBS con 3 x 5 min lava TBS in mezzo.
    5. Aggiungere 1 µ g/mL di bisbenzimide H33342 triidrocloruro per la soluzione di anticorpo secondario o utilizzare un diverso metodo di macchiatura nucleare.
    6. Montare i vetrini in un mezzo di montaggio per la colorazione fluorescente.

Risultati

La figura 1 Mostra un'immagine dell'installazione Langendorff comprese 2 matrici multi-elettrodo (MEA). Prima dell'esperimento, il catetere intracardiaco è posizionato vicino la cannula per facilitare una rapida e facile inserimento nel ventricolo di destra atrio/destra e garantire un breve periodo di tempo fino a quando l'equilibrazione può iniziare. La parte inferiore della camera può essere intensificata (vedere le frecce nella Figu...

Discussione

In questo manoscritto, sistema di perfusione la Langendorff ben noto ex vivo cuore è presentato come uno strumento per studiare l'impatto dei neuroni intracardiaci elettrofisiologia cardiaca e aritmogenesi utilizzando mapping diverso e tecniche di stimolazione inclusi gli approcci endocardial e dell'epicardio.

Parecchie parti del protocollo sono cruciali per l'installazione. In primo luogo, è importante utilizzare una tecnica di preparazione in cui i cuscinetti adiposi atriali riman...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014	Modified Krebs-Henleit solution
Sodium hydrogencarbonate	Sigma-Aldrich	401676	Modified Krebs-Henleit solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405	Modified Krebs-Henleit solution
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655	Modified Krebs-Henleit solution
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M1880	Modified Krebs-Henleit solution
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902	Modified Krebs-Henleit solution
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	Modified Krebs-Henleit solution
Sodium pyruvate bioXtra	Sigma-Aldrich	P8574	Modified Krebs-Henleit solution
Carbogen (95% O2 / 5% CO2)	SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany	Modified Krebs-Henleit solution
Sterile filter steritop-GP 0.22	EMD Millipore	SCGPT05RE	Modified Krebs-Henleit solution
Atropine sulfate	Sigma-Aldrich	A0257	Neuromodulation
Hexamethonium chloride	Sigma-Aldrich	H2138	Neuromodulation
Nicotine free base 98-100%	Sigma-Aldrich	N3876	Neuromodulation
Formalin solution neutral buffered 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Whole mount staining
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	252859	Whole mount staining
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Whole mount staining
Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	H1009	Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	D8418	Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tablets	Gibco / Invitrogen	18912-014	Whole mount staining
Triton-x-100	Sigma-Aldrich	T8787	Whole mount staining
Albumin bovine fraction V	Biomol, Hamburg, Germany	11924.03	Whole mount staining
Chicken anti neurofilament	EMD Millipore	AB5539	Whole mount staining
Rabbit anti tyrosine hydroxylase	EMD Millipore	AB152	Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferase	EMD Millipore	AP144P	Whole mount staining
Donkey α rabbit IgG Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	Whole mount staining
Donkey α goat IgG Alexa 568	Thermo Fisher Scientific	A11057	Whole mount staining
Donkey α chicken IgY Alexa 647	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	AP194SA6	Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α rabbit igG	R&D Systems	AP182B	Whole mount staining
Biotin-conjugated donkey α goat igG	R&D Systems	AP192P	Whole mount staining
Biotin-conjugated goat α chicken igY	R&D Systems	BAD010	Whole mount staining
Vectashield mounting medium	Vector laboratories, Burlingame, CA, USA	H-1000	Immunohistochemistry
Vectastain ABC kit	Vector laboratories, Burlingame, CA, USA	PK-4000	Immunohistochemistry
Steady DAB/Plus	Abcam plc, Cambridge, UK	ab103723	Whole mount staining
HistoClear	DiaTec, Bamberg, Germany	HS2002	Immunohistochemistry
BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	B2261	Immunohistochemistry
Vectashield HardSet mounting medium	Vector laboratories, Burlingame, CA, USA	VEC-H-1400	Immunohistochemistry
Perfusion system	HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany	73-4343	Langendorff apparatus
Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter	Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand	PL3508 PowerLab 8/35	Langendorff setup
Octapolar catheter	CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA	custom	Langendorff setup
Stimulus generator	STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	STG4002-160µA	Stimulation setup
Stimulation software	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	MC_Stimulus II	Stimulation setup
Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms	ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	USB-ME128-System	MEA setup
Multi-electrode array	MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	EcoFlexMEA36	MEA setup
Multi-electrode array recording software	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	MC_Rack	MEA setup
Spring scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15003-08	Heart Preparation
Strabismus Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14575-09	Heart Preparation
Mayo Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14110-15	Heart Preparation
Dumont SS Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11203-25	Heart Preparation
London Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11080-02	Heart Preparation
Narrow Pattern Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11003-13	Heart Preparation
Plastic Wrap	Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States		Consumable Materials
Stereomicroscope	Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany		FRET
LED	CoolLED, Andover, UK	pE-100	FRET
DualView	Photometrics, Tucson, AZ, USA	DV2-SYS	FRET
DualView filter set	Photometrics, Tucson, AZ, USA	05-EM	FRET
optiMOS scientific CMOS camera	Qimaging, Surrey, BC, Canada	01-OPTIMOS-R-M-16-C	FRET
Imaging software	Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA		FRET
Analysis Software	Image J software; Public Domain, NIH, USA		FRET