Hepatosellüler karsinom Vivo içinde geliştirilmesi üzerinde mezenkimal kök hücre sayfası potansiyelini keşfetmek

Özet

Burada, hücre sayfası teknolojisi kullanarak bir vivo içinde kanser modeli geliştirmek için bir protokol mevcut. Böyle bir model antikanser therapeutics değerlendirme için çok yararlı olabilir.

Özet

İnsan kanseri taklit eden bir in vivo hayvan modeli önemli klinik bilgi sunar çeşitli uygulamalar olabilir. Şu anda kullanılan teknikleri vivo içinde kanser modelleri geliştirilmesi için önemli kısıtlamalar bulunmaktadır. Bu nedenle, bu çalışmada, bir vivo içinde kanser modeli geliştirmek için hücre sayfası teknolojiyi uygulamak için amacımız. Hepatosellüler karsinom (HCC) başarıyla çıplak fareleri HCC hücre satırı hücrelerinden oluşturulan hücre sayfalarını kullanarak geliştirilmiştir. Kanser hücre yaprak hücre içi adezyon ve hücre dışı matriks tarafından kontrollü bir tabakalı yapısı oluşumu aracılığıyla oluşturulur. Bu HCC sac ekimi karaciğer ve bir ay içinde bir tümörü taşıyan hayvan modeli oluşturulması için izin verir. Buna ek olarak, mezenkimal kök hücre (MSC), bu kanser modeli geliştirilmesinde rol araştırıldı. HCC hücre satırı sayfa ek olarak başka bir iki hücre sayfaları oluşturulur: HCC hücreleri ve kemik iliği MSCs (BMMSCs) ve bir levha HCC hücrelerin ve göbek kordonu MSCs (UCMSCs) bir sayfası. HCC hücreleri ve MSCs kombinasyon var sayfaları da bir tümörü taşıyan hayvanı üretme yeteneğine sahiptirler. Ancak, MSCs eklenmesiyle oluşan tümör boyutunu küçültür ve bu tümör gelişimi üzerinde olumsuz etkisi kullanılan MSCs kaynağına bağlı olarak değişir. Bu hücre sabıkası belirli MSC alt türlerinden yapılan tümör yönetimi ve denetimi kullanıldığında olabilir gösterir.

Giriş

HCC önemli ölçüde kötü prognoz ile ilişkili karaciğer birincil bir kanserdir. Her yıl, neredeyse yarım milyon yeni hastaların karaciğer kanseri hastaları dünya çapında^%185'i temsil eden HCC ile tanısı. Hepatocarcinogenesis bir tek biçimli hastalık değildir; değil, ek olarak farklı histopatolojik özellikler ve genetik ve genomik çeşitliliğine sahip hastalıkları topluluğu prognostik sonuçlar¹çeşitli olduğunu. Bu nedenle, ana zorluklar HCC için etkili bir tedavi stratejisi geliştirme HCC Biyoloji sınırlı bilgi ve karmaşık bu hastalığı anlamak yardımcı olabilir uygun bir deneysel hayvan modeli eksikliği vardır. İnsan kanseri taklit eden bir in vivo hayvan modeli aday genler seçmek ve prognostik/akıllı işaretler kanseri indüksiyon yanı sıra kanser yanıt etkileyebilecek faktörler farklı soruşturma için karıştığı belirlenmesi için gereklidir terapötik ajanlar için.

Vitro kanser çalışmaları hala büyük sınırlamalar ile ilişkilidir. Gerçeğini kanser hücrelerinin kültürü muhafaza ne zaman onların in vivo özelliklerinin çoğunu kaybetmek nedeni bu. Bütün doku Fizyoloji bir ex vivo ortamda olmamasından hücreleri vitro sonucu oluşan değişiklikleri. Kanser hücre hücre etkileşim (stromal, bağışıklık, damarlara, epitel, vb) tümör microenvironment içinde büyük ölçüde kanser hücre özellikleri²üzerinde yansıtır. Tümör microenvironment kanser hücre gen/protein ifade ve ek olarak angiogenetic ve metastatik potansiyeli fenotipik özellikleri değiştirmek. İki boyutlu (2B) vitro kültür sistemi de tümör ilerleme düzenlemek gerekli olan uygun doku matris yoksun. Böylece, bu sınırlamaları nedeniyle vivo içinde modelleri her zaman vitro modelleri ön bulguları desteklemek için kullanılması gereken. Bu çalışmada, HCC yatan tam biyolojik süreci elucidates in vivo hayvan modeli geliştirmek için hücre sayfası teknolojisini kullanır.

Daha--dan a on yıl önce Okano'nın laboratuvar doku mühendisliği hücre sayfa teknoloji³dayalı bir roman yöntemi kurdu. Bir termo-yanıt veren Kültür plastik geri dönüşümlü hücre adezyon/dekolmanı yüzey hydrophobicity kontrol ederek izin vermek için bu tekniği kullanır. Bu yöntem nazik bir biçimde olduğu gibi üç boyutlu (3-D) (i.e.,cell sayfa), kültürlü hücre hasat bakımlı hücre dışı matriks (ECM) ve hücre-hücre etkileşimleri ile sağlar. Hücre sayfası teknik ticari olarak kullanılabilir ve kullanıma hazır olan kültür yemekleri ile bir sıcaklık duyarlı polimer poly(N-isopropylacrylamide) (PIPA değilim), precoating gerektirir. Bir sıcaklık 20 ° C'den polimerler PIPA Am sulu olmak ve (37 ° C) daha yüksek bir sıcaklık, polimerler susuz haline ve bulanık bir çökelti dönüşümü ise sulu çözümler içinde çözülür. Polimer hidrofilik Amid zincirleri ve hidrofobik yan zincirleri (izopropil gruplar) içerir. Sulu yapısı dökümü izopropil grupları ve hidrofobik izopropil grupları çevreleyen su moleküllerinin düşük sıcaklıkta Toplam ise, yüksek sıcaklıklarda su molekülleri Albert hareketi, yoğun hidrofobik etkileşimler nedeniyle. Bu nedenle, tüm polimer zincirini toplar ve⁴precipitates.

Sunulan çalışmada, üç farklı hücre yaprak kullanarak bir HCC hayvan modeli geliştirmek için bu tekniği istihdam. Diğer iki yaprak HCC hücre satır hücreleri ve MSCs iki farklı kaynaklardan oluşur, ancak istihdam ilk sayfayı HCC hücre satır hücreleri yalnızca, oluşur: kemik iliği MSCs (BMMSCs) ve göbek kordonu MSCs (UCMSCs). MSCs intocell türevleri adipositler, osteocytes, kondrosit ve miyositler⁵gibi mezenkimal soyundan ayırt yeteneğine hematopoetik stromal hücreler vardır. Biz bu hücrelerin kanser hücre sayfası oluştururken istihdam MSCs etkisi kanser tutarsız raporlama nedenidir. MSCs iki ayrı fenotipleri olabilir sürülmüştür: "MSC1", proinflamatuar fenotip ve "MSC2", bir immünsüpresif fenotip⁶. MSCs toll benzeri reseptörler (TLR) hızlı. TLR3 astar immünsüpresif faktörler⁶onların salgılanmasını artırır, ancak TLR4 astar MSCs, proinflamatuar faktörler, onların salgılanmasını artırır. Bu iki fenotipleri vitro incelenmesi MSC2 ortak kültür ters etkisi⁷varken MSC1 ortak bir kültür kanser hücre hatları ile kanser hücre büyümesi, zayıflatılmış bildirdi. Bu MSCs yanlısı kanser veya bağlı olarak onların fenotip antikanser olabilir implicates. Böylece, hücre sayfası teknolojisi kullanarak HCC hayvan modeli geliştirmeye ek olarak, tümör gelişimi, MSC nakli etkisi keşfetmek istiyoruz ve bu hücreler kullanarak geliştirmek olup bu model geliştirilmesi azaltmak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Protokol Kral Suud Üniversitesi'nin etik kurul hayvan bakımı kuralları izler. Cerrahi, anestezi ve hayvanlar üzerinde kullanılan diğer ilaçlar Kral Suud Üniversitesi'nin etik kurul tarafından onaylanır. Tüm deneysel çalışma uygun eğitimli personel tarafından gerçekleştirilir.

1. hücre sac İnşaat

1. Kültür yemekleri (3.5 cm sıcaklık duyarlı kültür yemekleri) su katılmamış fetal Sığır serum (FBS) ile ceket ve çanak tüm yüzeyi kapsayacak şekilde sağlamak.
   Not: Bu bir monolayer hücrelerinin büyümesini destekler ve hücre toplama engeller bu adımı hücre sayfası dekolmanı için önemlidir.
2. Yemekleri için % 5 CO₂ ve % 95 hava içeren bir oksijen atmosferde 37 ° C'de 24 saat kuluçkaya.
3. Aşırı FBS kaplamalı yemeklerini kaldırın ve yemekleri için en az 1 h (RT) Oda sıcaklığında kurumasını sağlar.
4. Üç hücre süspansiyonlar hazırlamak: 1 x 10⁶ HepG2 hücreleri, 1 x 10⁶ HepG2 hücreleri ile BMMSCs ve 1 x 10⁶ HepG2 hücreleri ile UCMSCs (BMMSCs ve UCMSCs için 4:1 oranında).
5. Tohum uygun hücre süspansiyon etiketli her yemeğin için.
6. DMEM kültür % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş orta bütün hücrelerdeki askıya alma.
7. Hücreleri oksijen bir atmosferde % 5 CO₂ ve % 95 hava içeren 37 ° C'de kuluçkaya.

2. hücre sayfası dekolmanı

1. % 100 hücre izdiham bulaşıkları da 37 ° C kuluçka dışarı al.
2. HepG2 hücre sayfası çanak RT, 1 h için HepG2/BMMSC ve HepG2/UCMSC hücre sayfası yemekler %5 CO₂ ve % 95 hava içeren bir oksijen atmosferde 20 ° C'de 30-40 dk için kuluçka sırasında kuluçkaya.
   Not: sadece HepG2 yapılan hücre sayfası kırılgandır; sıcaklık 20 ° C-azaltarak sayfanın yapısına zarar neden.

3. cerrahi işlem performansını

Not: hücre sayfası dekolmanı için kuluçka süre boyunca, hayvan yordam başlatın.

1. Cerrahi alan hazırlanması için yönergeler
   1. Laboratuvar, bir başlık, laminar akış kabine veya aseptik cerrahi oda gibi bir steril ayrı alanındaki tüm cerrahi prosedürlerini yürütecektir. Cerrahi alan tüm yüzeyleri gözenekli olmayan, mühürlü, dayanıklı ve sanitizable olduğundan emin olun.
   2. Önlük, eldiven, facemasks ve baş ve ayakkabı kapakları da dahil olmak üzere uygun koruyucu giysiler giymek.
   3. Kullanım cerrahi alet are temiz ve steril (yolu ile ısıyla; yüksek basınç altında doymuş kök) başında cerrahinin.
   4. Eldiven fareler arasında değiştirin.
2. Ameliyat için hayvan hazırlanması
   1. 8 - için 12-hafta-yaşlı çıplak fareleri kullanın.
   2. Fareler için enjekte edilebilir anestezi oluşturun.
      1. Anestezi çözüm hazırlamak için ketamin-xylazine, ketamin 2 mL, xylazine (bir konsantrasyon 20 mg/mL), 1 mL ve 1 mL steril fizyolojik serum (Örneğin, % 0,9 sodyum klorür) steril 10 mL serum koleksiyonu şişe içinde karıştırın ve çok önce sallamak kullanın.
      2. Anestezi uygulamak için intraperitoneally 0.2 mL farenin vücut ağırlığının 100 gr başına ketamin-xylazine çözeltisi enjekte et.
         Not: Çözüm toplam doz 100 mg/kg ketamin bas ve 10 mg/kg xylazine değil.
   3. Görünür kir/enkaz cerrahi sitesinden kaldırın.
   4. Anestezi derinliği pedal çekilme refleks (ayak pedi tutam her iki arka ayakları üzerinde) test ederek kontrol edin.
      Not: Ayak pedi tutam bir yanıt neden oluyorsa, bir doz, 0.05 mL/100 g (yaklaşık her 30 dakika) yineleyin ve sonra anestezik derinlik yeniden denetleyin.
   5. Bir iki aşamalı bodur ile cerrahi alan povidone-iyot/isopropanol tarafından dezenfekte.
   6. Belgili tanımlık kesme kirlenmesini önlemek için steril bir örtüsü fareyle kapsar.
   7. Fareler subkutan buprenorfin (0.01 - 0.05 mg/kg) ile enjekte kesi yapmadan önce⁸ .
   8. Steril neşter kullanmadan, bir 7 - için 10-cm derileri ve karaciğer ortaya çıkarmak için temel kaslar arasında kesin olun.
      1. Karın kas deri neşteri düz arka kenarı ile ayırın.
      2. Dikkatli bir şekilde bıçakla linea alba neşter kullanarak ve keskin makas ile kesme genişletmek.

4. hücre sac ekimi

Not: Üzerinde karaciğer hücre sac ekimi gerçekleştirilir.

1. Hücre sayfası kültür çanak toplamak.
   1. Yavaşça kültür çanak yüzeyi sacdan ayırmak için tezgah üzerine dokunun.
   2. Hücre sayfası çanak'ın yüzeyinden bir yarım daire bir steril pipet ucu kullanarak sayfanın kenarına kazıma ayırın.
   3. Yavaşça tüm Orta kültür çanak çıkarın.
   4. Sayfanın herhangi bir zarar vermeden sağlam olduğundan emin olun; Aksi takdirde, olamaz (Şekil 1) kullanılır.
      Not: Elde edilen sayfaları doğrudan göz tarafından tespit edilebilir.
2. Yemeğin hücre sacdan hasat için steril bir membran (filtre kağıdı) hazırlayın.
   1. İlk olarak, membran normal salin ile ıslatın. Sonra aşırı tuz ile steril pamuk yastık kaldırın.
   2. Islak membran hücre sayfası, kırışıklıklar ve hava kabarcıkları membran ve hücre sayfası arasındaki kaçınırken yerleştirin.
   3. Membran ve onları daha kolay toplamak için hücre sayfası normal salin birkaç damla ekleyin.
      Not: hücre sayfası bozulmaması için değil soğuk serum kullanın ve membran ve hücre sayfasını forseps ile kaldırın.
   4. Membran hücre sayfası membran için düzgün takıldığından emin olmak birkaç saniye için bırakın ve sonra onu toplamak.
3. Karaciğer hücre sac ekimi için hazırlayın.
   1. Karaciğer yüzey hafifçe steril pamuk yastık ile dokunarak kuru olduğundan emin olun.
   2. Steril forseps kullanarak, membran hücre levha ile sıçan karaciğer tek bir lob yerleştirin.
   3. Steril serum fizyolojik birkaç damla ekleyin ve hücre sacdan ayırmak için membran için hafif bir basınç uygulayın.
   4. Dikkatle membran kaldırmadan önce 5 min için bekleyin.
      Not: Bu hücre sayfası karaciğere düzgün takıldığından emin olmak için yapılır.
   5. Son olarak, temel kasları kapatın ve insizyon ile 5-0 naylon dikiş cilt.
   6. Cerrahi alan povidone-iyot ile dezenfekte.
      Not: Resim 2 çıplak bir sıçan karaciğer üzerinde bir diyagram hücre sac ekimi yordam gösterir.

5. ameliyat sonrası bakım

1. Ameliyattan hemen sonra tek tek yamyamlık veya boğulma önlemek için fareyi ev ve onu düzenli olarak (en azından her 15 dk) izlemek kadar bilinçli ve tam olarak ayakta.
2. Sonra günlük 5-14 d, en az 5 d için fareler post-operatively, herhangi bir komplikasyon sağlamak için değerlendirmek. Günlük değerlendirme sırasında şunlardan emin olun.
   1. Yara kapalı ve bir dikiş aşırı sıkı olmadan arada.
   2. Aşırı ısı gibi kesi site enfeksiyon belirtisi yok şişme veya pürülan akıntı.
   3. Azalan yiyecek ve su tüketimi, kilo kaybı, dehidratasyon, cilt çadır veya hızlı ve açık ağız nefes gibi ağrı ile ilişkili belirti yok. Şiddetli ameliyat sonrası ağrı için ılımlı denetlemek için varsa, fareler subkutan buprenorfin (0.01 - 0.05 mg/kg) ile en az 48-72 saat için her 6-8 h⁹ postoperatively enjekte et.

6. transplante çevrenin Analizi

1. Bir ay sonra nakli, scarifice fare ve transplante alan için toplamak histolojik ve immunohistokimyasal analizi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Transplante hücre yaprak sıçanlarda tumorigenicity:

Bir ay sonra nakli, tüm transplante hücre çarşaflarda rats karaciğer tümörleri (Şekil 3) geliştirdik. Gelişmiş tümör HepG2, HepG2/BMMSC ve HepG2/UCMSC hücre sayfaları üzerinden ortalama büyüklüğü 4,5 cm, 4 cm ve 2,5 cm, sırasıyla¹⁰vardı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Araştırma geniş bir miktarda insan kanserlerin benzer bir yeterli in vivo preklinik hayvan modeli geliştirmek için adamıştır. Şu anda, genetik mühendisliği ve hücre nakli¹¹kanser hayvan modelleri oluşturmak için kullanılan ana yaklaşımlar gerektirir. Genetiği değiştirilmiş hayvan modelleri tanıma ve onaylama hedef genlerin hem uyuşturucu kaynaklı toksisite temel moleküler mekanizmaları anlama iyi araçlardır. Ancak, bu model bazı sınırlamalar ile ilişkilidir...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
FBS	Gibco/Invitrogen	10270106
DMEM high glucose	Sigma	D5671-500ML
Penicillin/streptomycin	Life Technology	15070063
Sterile physiologic saline	Sigma	S0817-1GA
Human HepG2 cell line	ATCC, USA	HB-8065
Human bone marrow MSCs cell line	PromoCell, USA	C-12974
human umbilical cord tissue MSCs	PromoCell, USA	C-12971
Ketamine 50%	Rompun, Bayer
Xylazine 2%	Rompun	23076-35-9
Alphadine® solution.	Riyadh Pharma	LBL0816
Disposables:
15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube	Falcon	352097
3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane)	Sigma	174904-1CS
100-1000 µl  Pipette Tips	Sigma	CLS4868-1000EA
Basic Procedure Drape	Thermofisher	PMD5293.0
Equipment
Plus pipette, variable volume	Eppendorf® Research®	Z683779-1EA
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2	Any brand
Biological safety cabinet	Any brand
Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2	Any brand
Sterile surgical tools and nude rats:
Forceps
Scissors
scalpel
Nylon Suture  5-0	Accutome	AB-3854S	Monofilament, Lancet
1 ml Tuberculin Syringes	Fisher Scientific	14-826-88
Nude rats	Charles river