Explorer le potentiel des cellules souches mésenchymateuses feuille sur le développement du carcinome hépatocellulaire In Vivo

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à développer un modèle cancer in vivo à l’aide de la technologie des cellules feuille. Un tel modèle pourrait être très utile pour l’évaluation des traitements anticancéreux.

Résumé

Un modèle in vivo animal qui imite le cancer chez l’homme pourrait avoir plusieurs applications qui fournissent des informations cliniques significatifs. Les techniques actuellement utilisées pour le développement de modèles in vivo de cancer ont des limites considérables. Par conséquent, dans cette étude, nous visons à mettre en œuvre de la technologie des piles à feuille pour développer un modèle de cancer in vivo . Carcinome hépatocellulaire (CHC) est développé avec succès chez le rat nude en utilisant des feuilles de cellule créées à partir des cellules de la lignée cellulaire HCC. Les feuilles de cellules de cancer sont générés par adhérence intracellulaire et la formation d’une structure stratifiée, contrôlée par la matrice extracellulaire. Cela permet la transplantation de feuille HCC dans le foie et la création d’un modèle animal de tumeur-roulement, moins d’un mois. En outre, on étudie le rôle des cellules souches mésenchymateuses (CSM) dans le développement de ce modèle de cancer. En plus de la plaque de ligne de cellules HCC, un autre des feuilles de deux cellules sont créées : une feuille de cellules HCC et moelle osseuse MSCs (BMMSCs) et une feuille de cellules HCC et cordon ombilical MSCs (UCMSCs). Les feuilles qui ont une combinaison des cellules de la HCC et MSCs sont aussi capables de produire un animal avec tumeur. Toutefois, l’ajout de MSCs réduit la taille de la tumeur formée, et cet effet néfaste sur le développement de tumeurs varie selon source des MSCs utilisé. Cela indique qu’il pourrait utiliser une feuille de cellules de certains sous-types MSC dans le contrôle et la gestion de la tumeur.

Introduction

HCC est un cancer primitif du foie qui est significativement associé à un mauvais pronostic. Chaque année, presque un demi-million de nouveaux patients sont diagnostiqués avec HCC, qui représentent 85 % des patients de cancer du foie dans le monde¹. Hepatocarcinogenesis n’est pas une maladie unique-forme ; C’est plutôt un ensemble de maladies qui ont différentes caractéristiques histopathologiques et variabilité génétique et génomique, outre varié résultats pronostiques¹. Par conséquent, les principaux défis à l’élaboration d’une stratégie thérapeutique efficace pour HCC sont la connaissance limitée de la biologie de la HCC et l’absence d’un modèle animal expérimental adapté qui peut aider à comprendre cette maladie complexe. Un modèle in vivo animal qui imite le cancer chez l’homme est nécessaire pour la sélection des gènes candidats et d’identifier des marqueurs pronostiques/prédictifs impliqués dans l’induction du cancer, ainsi que pour l’étude des différents facteurs qui peuvent influer sur les réponses du cancer d’agents thérapeutiques.

Des études in vitro du cancer sont toujours associées à des limites importantes. Cela est dû au fait que les cellules cancéreuses perdent beaucoup de leurs caractéristiques en vivo lorsque maintenu en culture. Les changements qui se produisent à des cellules in vitro résultat de l’absence de la physiologie du tissu entier dans un cadre ex vivo . Interaction de cellule-cellule de cancer (stromal, immunitaire, système vasculaire, épithélial, etc.) dans le microenvironnement tumoral reflète grandement sur le cancer cellule caractéristiques². Le microenvironnement tumoral pourrait modifier expression de gènes/protéines de cellules du cancer et des caractéristiques phénotypiques, outre ANGIOGÉNÉTIQUE et potentiel métastatique. Le système de culture à deux dimensions (2d) in vitro manque également une matrice convenable, ce qui est nécessaire pour réguler la progression tumorale. Ainsi, en raison de ces limitations, en vivo modèles toujours devraient être utilisés pour appuyer les conclusions préliminaires de in vitro des modèles. Dans cette étude, nous utilisons la technologie de feuille de cellule à développer un modèle in vivo animal qui élucide le processus biologique qui sous-tendent la HCC.

Plus de dix ans, laboratoire de Okano mis en place une nouvelle méthode de l’ingénierie tissulaire, basé sur la cellule feuille technologie³. Cette technique utilise un plastique thermo-sensible de la culture pour permettre l’adhérence/détachement de cellule réversible en contrôlant l’hydrophobicité de la surface. Cette méthode permet une récolte douce des cellules cultivées en intact en trois dimensions (3d) forme (feuille de i.e.,cell), avec une bien gardé de la matrice extracellulaire (ECM) et les interactions cellule-cellule. La technique de feuille de cellule nécessite le PRELIMINAIRE de Pétri avec une poly(N-isopropylacrylamide) de température-responsive polymer (suis PIPA), qui est commercialement disponible et prêt à l’emploi. À une température inférieure à 20 ° C, polymères PIPA suis deviennent hydratées et dissolvent en solution aqueuse, considérant que, à une température plus élevée (37 ° C), les polymères sont déshydratent et se transforment en un précipité turbide. Le polymère contient des chaînes de l’amide hydrophile et chaînes latérales hydrophobes (groupes isopropyles). À des températures élevées, le mouvement brownien des molécules d’eau s’intensifie, considérant que, à basse température, les molécules de l’eau qui entoure les groupes isopropyle de la rupture de la structure hydratés et les groupes de l’isopropyl hydrophobe agréger en raison des interactions hydrophobes. Par conséquent, l’ensemble de la chaîne du polymère et agrégats précipite⁴.

Dans l’étude présentée, cette technique est employée pour développer un modèle animal de HCC à l’aide de trois feuillets cellulaires différentes. La première feuille employée se compose de HCC ligne cellules seulement, alors que les deux autres feuilles sont constitués d’une combinaison de cellules de la lignée cellulaire HCC et MSCs de deux sources différentes : MSCs (BMMSCs) de la moelle osseuse et du cordon ombilical MSCs (UCMSCs). MSCs sont des cellules stromales non hématopoïétiques capables de différencier les intocell dérivés de la lignée mésenchymateuse, incluant les adipocytes, les ostéocytes, les chondrocytes et les myocytes⁵. La raison pour laquelle que nous employons ces cellules lors de la création de la plaque de cellules de cancer est la contradiction du rapport sur l’effet de MSCs sur les cancers. Il a été suggéré que MSCs peuvent avoir deux phénotypes distincts : « MSC1 », un phénotype pro-inflammatoire et « MSC2 », un immunosuppresseur phénotype⁶. MSCs expriment des récepteurs toll-like (TLRs). TLR4 amorçage de MSCs augmente leur sécrétion de facteurs pro-inflammatoires, alors que l’amorçage TLR3 augmente leur sécrétion de facteurs immunosuppresseurs⁶. Une étude in vitro de ces deux phénotypes ont signalé qu’une co-culture de MSC1 avec des lignées de cellules cancéreuses atténue de croissance des cellules cancéreuses, tandis que MSC2 co-culture a l' opposé de l’effet⁷. Cela implique que MSCs peuvent être Pro-cancer ou anticancéreux, selon leur phénotype. Ainsi, en plus de développer le modèle animal de HCC en utilisant la technologie de cellule feuille, nous voulons explorer l’effet des transplantations MSC sur le développement de tumeurs, ainsi qu’à l’aide de ces cellules va accroître ou réduire le développement de ce modèle.

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Protocole

Le protocole suit les directives de protection des animaux du Comité d’éthique de l’Université du Roi Saoud. Interventions chirurgicales et anesthésiques autres médicaments utilisés pour les animaux sont approuvés par le Comité d’éthique de l’Université du Roi Saoud. Tous les travaux expérimentaux sont effectuée par un personnel convenablement formé.

1. cellule feuille Construction

1. Enduire le Pétri (3,5 cm température Pétri) de sérum non dilué fœtal (SVF) et faire en sorte de couvrir toute la surface du plat.
   Remarque : Cette étape est importante pour le détachement de la feuille de la cellule car elle favorise la croissance des cellules dans une monocouche et empêche l’agrégation cellulaire.
2. Incuber les plats pendant 24 h à 37 ° C en atmosphère humidifiée contenant 5 % CO₂ et 95 % d’air.
3. Enlever l’excès FBS de la vaisselle couchée et laissez la vaisselle sécher à température ambiante (RT) pendant au moins 1 h.
4. Préparer les suspensions de trois cellules : 1 x 10⁶ HepG2 cellules, cellules de 1 x 10⁶ HepG2 avec BMMSCs et 1 x 10⁶ HepG2 cellules avec UCMSCs (dans une proportion de 4:1 pour BMMSCs et UCMSCs).
5. Graine de la suspension cellulaire appropriée à chaque plat marqué.
6. Suspendre toutes les cellules dans un milieu de culture DMEM additionné de 10 % de SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine.
7. Incuber les cellules à 37 ° C en atmosphère humidifiée contenant 5 % CO₂ et 95 % d’air.

2. cellule feuille détachement

1. Au confluent de 100 % de cellules, prendre la vaisselle hors de l’incubateur à 37 ° C.
2. Incuber le plat de feuille cellulaire HepG2 pendant 1 h à RT, tout en incubant les HepG2/BMMSC et HepG2/UCMSC cellule feuille plats pendant 30-40 min à 20 ° C en atmosphère humidifiée contenant 5 % CO₂ et 95 % d’air.
   Remarque : La plaque de cellules fabriquée à partir de seulement HepG2 est fragile ; réduire la température à 20 ° C provoque des dommages à la structure de la feuille.

3. exécution de la procédure chirurgicale

Remarque : Au cours de la période d’incubation pour le détachement de feuille de la cellule, démarrer la procédure de l’animale.

1. Instructions pour la préparation de la zone de chirurgie
   1. Effectuer toutes les interventions chirurgicales dans une zone stérile distincte au sein du laboratoire, par exemple une hotte à flux laminaire et une salle de chirurgie aseptique. S’assurer que toutes les surfaces de la région de chirurgie sont non poreux, étanche, durable et nettoyables.
   2. Porter un équipement de protection adéquat, notamment des gommages, des gants, masques faciaux et tête et couvre-chaussures.
   3. Utilisation chirurgicale des outils qui sont propre et stérilisé (par autoclavage ; tige saturée sous haute pression) au début de la chirurgie.
   4. Changer entre les rats.
2. Préparation de l’animal pour la chirurgie
   1. Utiliser des rats nus âgés de 8 à 12 semaines.
   2. Créer une anesthésie injectable pour les rats.
      1. Pour préparer la solution d’anesthésie, kétamine-xylazine, mélanger 1 mL de solution saline physiologique stérile (par exemple, le chlorure de sodium 0,9 %) dans un flacon stérile 10 mL sérum, 1 mL de xylazine (à une concentration de 20 mg/mL) et 2 mL de kétamine et bien agiter avant utilisation.
      2. Pour appliquer l’anesthésie, injecter par voie intrapéritonéale 0,2 mL de la solution de kétamine-xylazine par 100 g de poids corporel du rat.
         Remarque : La dose totale de la solution est de 100 mg/kg de la kétamine et 10 mg/kg de xylazine.
   3. Retirer saletés/débris visibles sur le site chirurgical.
   4. Vérifier la profondeur de l’anesthésie en testant le réflexe de retrait pédale (pied touche pincée sur les deux pattes).
      Remarque : Si la pincée de pad pied provoque une réponse, répéter à une dose de 0,05 mL/100 g (environ toutes les 30 min), puis re-vérifier la profondeur de l’anesthésie.
   5. Désinfecter la zone de chirurgie avec un gommage bi-étagé de povidone-iode/isopropanol.
   6. Couvrir le rat avec un drap stérile pour éviter toute contamination de l’incision.
   7. Injecter les rats par voie sous-cutanée avec la buprénorphine (0,01 - 0,05 mg/kg)⁸ avant de faire l’incision.
   8. À l’aide d’un scalpel stérile, faire un 7 à 10 cm couper entre la peau et les muscles sous-jacents pour exposer le foie.
      1. Séparer les muscles abdominaux de la peau avec le bord plat arrière du scalpel.
      2. Poignarder soigneusement la linea alba à l’aide d’un scalpel et d’étendre la coupe avec des ciseaux pointus.

4. cellule feuille Transplantation

Remarque : La transplantation de cellules feuille est effectuée sur le foie.

1. Recueillir la plaque de cellules de la boîte de Pétri.
   1. Tapotez doucement le plat de la culture sur le banc pour détacher la feuille de sa surface.
   2. Séparer la plaque de cellules de surface de la capsule en grattant le bord de la feuille dans un demi cercle à l’aide d’un embout de la pipette stérile.
   3. Retirez délicatement le support complet de la boîte de Pétri.
   4. S’assurer que la feuille est intacte sans aucun dommage ; dans le cas contraire, il ne peut pas être utilisée (Figure 1).
      Remarque : Les feuilles qui en résulte peuvent être détectées directement par le œil.
2. Préparer une membrane stérile (papier filtre) pour récolter la plaque de cellules du plat.
   1. Tout d’abord, faire tremper la membrane avec un soluté physiologique. Ensuite, retirez l’excès saline avec un tampon de coton stérile.
   2. Placer la membrane humide sur la plaque de cellules, tout en évitant les plis et les bulles d’air entre la membrane et la feuille de la cellule.
   3. Ajouter quelques gouttes de sérum physiologique sur la membrane et la plaque de cellules pour les recueillir plus facilement.
      Remarque : Pour éviter de casser la plaque de cellules, ne sont pas utiliser de sérum physiologique froid et soulever la membrane et la plaque de cellules avec une pince.
   4. Laisser la membrane pendant quelques secondes pour s’assurer que la feuille de la cellule est bien fixée à la membrane et puis il recueille.
3. Préparer le foie pour la transplantation de cellules feuille.
   1. Assurez-vous que la surface du foie est sec en tapant doucement avec un tampon de coton stérile.
   2. À l’aide d’une pince stérile, placer la membrane avec la plaque de cellules sur un seul lobe de foie de rat.
   3. Ajouter quelques gouttes de sérum physiologique et appliquez une légère pression à la membrane pour détacher la plaque de cellules de celle-ci.
   4. Attendre 5 min avant de retirer soigneusement la membrane.
      NOTE : Ceci est fait pour s’assurer que la feuille de la cellule est correctement branchée sur le foie.
   5. Enfin, fermer les muscles sous-jacents et incisions avec sutures en nylon de 5-0 de la peau.
   6. Désinfecter la zone de chirurgie avec la povidone iodée.
      Remarque : Figure 2 montre un schéma de la procédure de transplantation cellulaire feuille sur le foie d’un rat nu.

5. après la chirurgie soins

1. Immédiatement après la chirurgie, loger le rat individuellement pour éviter le cannibalisme ou suffocation et surveiller régulièrement (au moins toutes les 15 min) jusqu'à ce qu’elle est consciente et entièrement ambulant.
2. Ensuite, évaluer les rats par jour pendant 5-14 d, au moins 5 jours après l’intervention, pour s’assurer qu’il n’y a pas de complications. Lors de l’évaluation quotidienne, s’assurer de ce qui suit.
   1. La plaie est fermée, et les sutures sont intacts, sans être trop serré.
   2. Il n’y a aucun signe d’infection du site d’incision, comme la chaleur, excès, gonflement ou purulent décharge.
   3. Il n’y a pas de signes associés à la douleur, tels que la consommation de nourriture et d’eau a diminué, perte de poids, déshydratation, peau sous la tente ou respiration par la bouche ouverte et rapide. Au contrôle douleur modérée à sévère après l’intervention, le cas échéant, injecter les rats par voie sous-cutanée avec la buprénorphine (0,01 - 0,05 mg/kg) chaque 6-8 h⁹ pendant au moins 48 à 72 heures après l’opération.

6. analyse de la zone transplantée

1. Un mois après la transplantation, scarifice le rat et recueillir la zone transplantée pour histologique et immunohistochimique analyse.

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Résultats

Tumorigénicité des feuilles de transplantation cellulaire chez les Rats :

Un mois après la transplantation, toutes les feuilles de cellules transplantées dans le foie des rats ont développé des tumeurs (Figure 3). La taille moyenne des tumeurs développées de HepG2, HepG2/BMMSC et les feuilles de cellulaire HepG2/UCMSC étaient de 4,5 cm, 4 cm et 2,5 cm, respectivement

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Discussion

Une quantité considérable de recherche se consacre au développement adéquat en vivo précliniques modèle animal qui ressemble à des cancers humains. Actuellement, les principales approches utilisées pour créer des modèles animaux de cancer impliquent de transplantation de génie génétique et la cellule¹¹. Modèles animaux génétiquement modifiés sont de bons outils pour l’identification et la validation des gènes cibles, ainsi que la compréhension des mécanismes molécul...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
FBS	Gibco/Invitrogen	10270106
DMEM high glucose	Sigma	D5671-500ML
Penicillin/streptomycin	Life Technology	15070063
Sterile physiologic saline	Sigma	S0817-1GA
Human HepG2 cell line	ATCC, USA	HB-8065
Human bone marrow MSCs cell line	PromoCell, USA	C-12974
human umbilical cord tissue MSCs	PromoCell, USA	C-12971
Ketamine 50%	Rompun, Bayer
Xylazine 2%	Rompun	23076-35-9
Alphadine® solution.	Riyadh Pharma	LBL0816
Disposables:
15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube	Falcon	352097
3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane)	Sigma	174904-1CS
100-1000 µl  Pipette Tips	Sigma	CLS4868-1000EA
Basic Procedure Drape	Thermofisher	PMD5293.0
Equipment
Plus pipette, variable volume	Eppendorf® Research®	Z683779-1EA
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2	Any brand
Biological safety cabinet	Any brand
Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2	Any brand
Sterile surgical tools and nude rats:
Forceps
Scissors
scalpel
Nylon Suture  5-0	Accutome	AB-3854S	Monofilament, Lancet
1 ml Tuberculin Syringes	Fisher Scientific	14-826-88
Nude rats	Charles river