Ermittlung des Potenzials von mesenchymalen Stammzellen Blatt auf die Entwicklung des hepatozellulären Karzinoms In Vivo

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Entwicklung eines in-Vivo Krebs-Modells mit Blatt-Zelltechnologie. Ein solches Modell könnte sehr nützlich für die Bewertung der Anti-Krebs-Therapie.

Zusammenfassung

In Vivo Tiermodell, das menschlichen Krebs nachahmt hätten verschiedene Anwendungen, die signifikante klinische Informationen liefern. Die derzeit verwendeten Techniken für die Entwicklung von in Vivo Krebs-Modelle haben erhebliche Einschränkungen. Daher wollen wir in dieser Studie Zelle Blatt Technologie um eine in-Vivo -Krebs-Modell zu entwickeln, zu implementieren. Das Leberzellkarzinom (HCC) ist erfolgreich in nackten Ratten mit Zelle Sheets erstellt von HCC Zelle Zeile Zellen entwickelt. Die Krebs Zelle Blätter entstehen durch intrazelluläre Adhäsion und die Bildung von eine geschichtete Struktur, durch die extrazelluläre Matrix gesteuert. Dies ermöglicht die HCC-Blatt-Transplantation in die Leber und die Schaffung einer Tumor-tragenden Tiermodell innerhalb eines Monats. Darüber hinaus ist die Rolle von mesenchymalen Stammzellen (MSC) an der Entwicklung dieses Modells Krebs untersucht. Neben dem HCC Zelle Zeile Blatt, eine andere Zelle zwei Blätter entstehen: ein Blatt HCC Zellen und Knochenmark MSCs (BMMSCs) und ein Blatt von HCC Zellen und Nabelschnur MSCs (UCMSCs). Blätter, die eine von HCC Zellen und MSCs Kombination sind auch in der Lage, eine Tumor-tragenden Tier. Aber die Zugabe von MSCs reduziert die Größe der der gebildete Tumor, und dieses negative Auswirkungen auf die Entwicklung von Tumoren variiert abhängig von der verwendeten MSCs-Quelle. Dies bedeutet, dass eine Zelle Blatt gemacht von bestimmten MSC-Subtypen bei Tumor-Verwaltung und Kontrolle genutzt werden könnte.

Einleitung

HCC ist ein primärer Krebs der Leber, die signifikant mit einer schlechten Prognose assoziiert ist. Jährlich fast eine halbe Million neue Patienten mit HCC, was 85 % der Leberkrebs Patienten weltweit¹diagnostiziert. Hepatocarcinogenesis ist keine einzelne Form Krankheit; Vielmehr ist es eine Sammlung von Krankheiten, die verschiedene histopathologische Merkmale und genetische und genomic Variabilität, zusätzlich zu haben prognostische Ergebnisse¹vielfältig. Daher sind die größten Herausforderungen bei der Entwicklung einer effektiven therapeutischen Strategie für HCC die begrenzten Kenntnissen der HCC-Biologie und der Mangel an geeigneten experimentellen Tiermodell, die helfen können, diese komplexe Krankheit zu verstehen. In Vivo Tiermodell, das menschlichen Krebs nachahmt ist notwendig für die Auswahl von Kandidatengenen und Identifizierung prognostische/prädiktive Marker verwickelt in Krebs-Induktion, sowie für die Untersuchung von verschiedener Faktoren, die Krebs Antworten beeinflussen können zu Therapeutika.

In-vitro- Studien sind noch mit großen Einschränkungen verbunden. Dies ist aufgrund der Tatsache, dass Krebszellen viele ihre in Vivo -Funktionen verlieren wenn in Kultur gepflegt. Die Änderungen, die an Zellen in Vitro Ergebnis aus dem Fehlen der ganze Gewebe Physiologie in einer ex-Vivo -Umgebung auftreten. Krebs Zell-Zell-Interaktion (Stromazellen, immun-, Gefäßsystem, epithelialen, etc.) innerhalb der Tumor Mikroumgebung reflektiert stark Krebs Zelle Eigenschaften². Der Tumor Mikroumgebung könnte Krebs Zelle gen/Protein-Expression und phänotypischen Eigenschaften, neben angiogenetischer und metastasiertem Potenziale verändern. Das zweidimensionale (2D) in-vitro- Kultur-System fehlt auch eine geeignete Gewebe-Matrix, die Tumorprogression regulieren muss. Daher sollten aufgrund dieser Einschränkungen in Vivo Modellen immer genutzt werden, um die vorläufigen Ergebnisse der in-vitro- Modelle unterstützen. In dieser Studie verwenden wir Blatt Zelltechnologie in Vivo Tiermodell zu entwickeln, die den gesamten biologischen Prozess zugrunde liegenden HCC erläutert.

Vor mehr als einem Jahrzehnt etablierte Okano Labor eine neuartige Methode des Tissue Engineering basierend auf Zelle Blatt Technologie³. Diese Technik nutzt einen Thermo-responsive Kultur Kunststoff um reversible Zelle Adhäsion/Ablösung zu ermöglichen, durch die Kontrolle der Oberfläche Hydrophobie. Diese Methode ermöglicht eine schonende Ernte von kultivierten Zellen in einem intakten dreidimensionale (3D) Format (i.e.,cell Blatt), mit einem gepflegten extrazelluläre Matrix (ECM) und Zell-Zell-Interaktionen. Die Zelle Blatt Technik erfordert vorbeschichten Kultur Gerichte mit einem Temperatur-responsive Polymer-poly(N-isopropylacrylamide) (PIPA bin), die kommerziell verfügbar und einsatzbereit. Bei einer Temperatur unter 20 ° C PIPA bin Polymere werden hydratisiert und lösen sich in wässrigen Lösungen, in der Erwägung, dass bei einer höheren Temperatur (37 ° C), Polymere dehydriert und verwandeln Sie in eine trübe Niederschlag. Das Polymer enthält hydrophilen Amid Ketten und hydrophoben Seitenketten (Isopropyl-Gruppen). Bei hohen Temperaturen wird die Brownsche Bewegung der Wassermoleküle in der Erwägung, dass bei einer niedrigen Temperatur der Wassermoleküle rund um die Isopropyl-Gruppen des Zusammenbruches hydratisiert Struktur und die Gruppen der hydrophoben Isopropyl aggregieren intensiviert, durch hydrophobe Wechselwirkungen. Daher ist die gesamte Kette des Polymers aggregiert und Ausscheidungen⁴.

In der vorgestellten Studie wird diese Technik eingesetzt, um ein HCC Tiermodell mit drei verschiedenen Zelle Blätter entwickeln. Das erste Blatt beschäftigt besteht aus HCC Zelle Zeile Zellen nur, während die anderen beiden Blätter aus einer Kombination von HCC Zelle Zeile Zellen und MSCs aus zwei verschiedenen Quellen besteht: Knochenmark MSCs (BMMSCs) und Nabelschnur MSCs (UCMSCs). MSCs sind nicht blutbildende Stromatumoren Zellen, die in der Lage sind Intocell Derivate der mesenchymalen-Linie, inklusive Adipozyten, Osteozyten, Chondrozyten, Myozyten⁵zu unterscheiden. Der Grund, warum wir diese Zellen beschäftigen, bei der Erstellung der Krebs Zelle Blatt ist die inkonsistente Berichterstattung über die Wirkung von MSCs auf Krebserkrankungen. Es wurde darauf hingewiesen, dass MSCs zwei verschiedene Phänotypen haben können: "MSC1", einem proinflammatorischen Phänotyp und "MSC2", eine immunsuppressive Phänotyp-⁶. MSCs express Toll-Like-Rezeptoren (TLR). TLR4 grundieren der MSCs erhöht ihre Absonderung von proinflammatorischen Faktoren, während TLR3 Grundierung ihrer Sekretion von immunsuppressiven Faktoren⁶erhöht. Eine in-vitro- Studie über diese zwei Phänotypen berichtet, dass ein Kokulturen MSC1 mit Krebszelllinien Wachstum von Krebszellen, gedämpft, während MSC2 kokultur die entgegengesetzte Wirkung⁷hatte. Das bedeutet, dass MSCs pro-Krebs oder Krebs, je nach deren Phänotyp sein können. So wollen wir neben der Entwicklung der HCC-Tiermodell mit Blatt-Zelltechnologie, die Wirkung des MSC Transplantationen auf Tumorentwicklung, erkunden und ob diese Zellen erhöhen oder verringern die Entwicklung dieses Modells.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Das Protokoll folgt den Tierbetreuung Richtlinien des König-Saud-Universität Ethikkommission. Chirurgische Eingriffe, Anästhetika und andere Medikamente für Tiere verwendet werden von König-Saud-Universität Ethikkommission genehmigt. Alle experimentellen Arbeit erfolgt durch entsprechend geschultes Personal.

(1) Zelle Blatt Bau

1. Die Kultur-Gerichte (3,5 cm Temperatur reagierende Kultur Gerichte) mit unverdünntem fetalen bovine Serum (FBS) zu beschichten und stellen sicher, dass die Fläche der Schale.
   Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig für die Ablösung des Blattes Zelle, da es das Wachstum der Zellen in einem monomolekularen Film unterstützt und Zelle Aggregation verhindert.
2. Inkubieren Sie die Gerichte für 24 h bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO₂ % bis 95 % Luft.
3. Entfernen Sie die überschüssige FBS aus beschichteten Gerichte und lassen Sie die Gerichte bei Raumtemperatur (RT) für mindestens 1 h trocknen.
4. Bereiten Sie die drei Zellsuspensionen: 1 x 10⁶ HepG2-Zellen, 1 x 10⁶ HepG2-Zellen mit BMMSCs und 1 x 10⁶ HepG2-Zellen mit UCMSCs (im Verhältnis von 4:1 für BMMSCs und UCMSCs).
5. Samen der entsprechenden Zellsuspension auf jede beschriftete Teller.
6. Sperren Sie alle Zellen im Kulturmedium DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt.
7. Inkubation der Zellen bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO₂ % bis 95 % Luft.

(2) Zelle Blatt Ablösung

1. Nehmen Sie bei 100 % Zelle Zusammenströmen die Gerichte aus dem Inkubator 37 ° C.
2. Inkubieren Sie die HepG2 Zelle Blatt Schale für 1 h bei RT, während der Inkubation HepG2/BMMSC und HepG2/UCMSC Zelle Blatt Gerichte für 30-40 min. bei 20 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO₂ % bis 95 % Luft.
   Hinweis: Die Zelle Blatt hergestellt aus nur HepG2 ist zerbrechlich; reduzieren die Temperatur auf 20 ° C verursacht Schäden an der Struktur des Blattes.

3. Leistungen des chirurgischen Eingriffs

Hinweis: Während der Inkubationszeit für die Zelle Blatt Ablösung die tierische Prozedur starten.

1. Anweisungen für die Vorbereitung der OP-Bereich
   1. Führen Sie alle chirurgischen Eingriffe in einem sterilen separaten Bereich innerhalb des Labors, wie eine Kapuze, Laminar-Flow Kabinett oder einer aseptischen Operationssaal. Sicherstellen Sie, dass alle Flächen von den OP-Bereich nicht-poröse, versiegelten, langlebig und desinfizierbare.
   2. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung, einschließlich Peelings, Handschuhe, Gesichtsmasken und Kopf und Schuh-covers.
   3. Verwendung chirurgische Werkzeuge, sind sauber und sterilisiert (durch Autoklavieren; gesättigten Stamm unter hohem Druck) zu Beginn der Operation.
   4. Ändern Sie Handschuhe zwischen Ratten.
2. Vorbereitung des Tieres für die Chirurgie
   1. Verwenden Sie 8 bis 12 Wochen alten nackte Ratten.
   2. Injizierbare Narkose für Ratten zu erstellen.
      1. Um die Anästhesie-Lösung vorzubereiten, Ketamin-Xylazin, mischen Sie 2 mL Ketamin, 1 mL Xylazin (in einer Konzentration von 20 mg/mL) und 1 mL sterile physiologische Kochsalzlösung (z.B. 0,9 % Natriumchlorid) in eine sterile 10-mL-Serum-Sammelbehälter und vor Gebrauch gut schütteln verwenden.
      2. Um Anästhesie anzuwenden, injizieren Sie 0,2 mL der Lösung Ketamin-Xylazin pro 100 g Körpergewicht der Ratte intraperitoneal.
         Hinweis: Die Gesamtdosis der Lösung ist 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin.
   3. Der Operationsstelle entfernen Sie sichtbaren Schmutz/Schmutz.
   4. Prüfen Sie die Tiefe der Narkose durch Testen des Pedal Rückzug Reflexes (Foot Pad Prise auf beide Hinterpfoten).
      Hinweis: Wenn die Fuß-Pad-Prise eine Reaktion verursacht, wiederholen bei einer Dosis von 0,05 mL/100 g (ca. alle 30 min.), dann erneut die Narkose Tiefe.
   5. Desinfizieren Sie den OP-Bereich mit einem zwei-Phasen-Peeling von Povidon-Jod/Isopropanol.
   6. Decken Sie die Ratte mit einem sterilen Tuch zur Vermeidung von Kontaminationen des Schnittes.
   7. Die Ratten mit Buprenorphin (0,01 - 0,05 mg/kg) subkutan zu injizieren⁸ vor dem Einschnitt.
   8. Mit einem sterilen Skalpell, machen Sie eine 7 - bis 10 cm Schnitt zwischen Haut und darunter liegenden Muskeln, die Leber verfügbar zu machen.
      1. Trennen Sie die Bauchmuskulatur aus der Haut mit der flachen hinteren Kante des Skalpells.
      2. Sorgfältig zu erstechen die Linea Alba mit einem Skalpell und verlängern Sie den Schnitt mit einer scharfen Schere.

4. Blatt Zelltransplantation

Hinweis: Blatt Zelltransplantation erfolgt auf die Leber.

1. Sammeln Sie die Zelle Blatt aus der Kulturschale.
   1. Klopfen Sie leicht der Kulturschale über die Bank, das Blatt von der Oberfläche zu lösen.
   2. Das Gericht Oberfläche trennen Sie der Zelle Blatt durch abkratzen der Rand des Blattes in einem Halbkreis mit einer sterilen PIPETTENSPITZE.
   3. Entfernen Sie vorsichtig das gesamte Medium aus der Kulturschale.
   4. Sicherzustellen Sie, dass das Blatt ohne Beschädigung intakt ist; Ansonsten, es kann nicht sein (Abbildung 1) verwendet.
      Hinweis: Die resultierende Blätter können direkt mit dem Auge erkannt werden.
2. Bereiten Sie eine sterile Membran (Filterpapier) der Zelle Blatt aus der Schale zu ernten.
   1. Zuerst, die Membran mit normalen Kochsalzlösung einweichen. Dann entfernen Sie die überschüssige Kochsalzlösung mit einem sterilen Wattepad.
   2. Legen Sie die nasse Membran über das Blatt Zelle unter Vermeidung von Falten und Luftblasen zwischen der Membran und die Zelle Blatt.
   3. Fügen Sie einige Tropfen des normalen Kochsalzlösung über die Membran und die Zelle Blatt, sie einfacher zu sammeln.
      Hinweis: Um zu vermeiden, brechen die Zelle Blatt, nicht kalten Kochsalzlösung verwenden und heben Sie die Membran und die Zelle-Blatt mit der Pinzette.
   4. Lassen Sie die Membran für ein paar Sekunden um sicherzustellen, dass die Zelle Blatt ordnungsgemäß mit der Membran verbunden ist, und dann sammeln.
3. Bereiten Sie die Leber für Blatt Zelltransplantation.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Leber Oberfläche trocken ist, indem es vorsichtig mit einem sterilen Wattepad.
   2. Mit sterilen Pinzette, platzieren Sie die Membran der Zelle Blatt über eine einzelne Lappen der Leber der Ratte.
   3. Fügen Sie ein paar Tropfen sterilen Kochsalzlösung und üben Sie sanften Druck auf die Membrane der Zelle Blatt von ihm zu trennen.
   4. Warten Sie 5 min vor die Membran vorsichtig entfernen.
      Hinweis: Dies geschieht, um sicherzustellen, dass die Zelle Blatt ordnungsgemäß mit der Leber verbunden ist.
   5. Schließlich schließen Sie die darunter liegenden Muskeln und Haut Einschnitte mit 5: 0-Nylon-Fäden.
   6. Der OP-Bereich mit Povidon-Jod zu desinfizieren.
      Hinweis: Abbildung 2 zeigt ein Diagramm der Zelle Blatt Transplantationsverfahren auf die Leber eine nackte Ratte.

5. postoperative Pflege

1. Unmittelbar nach der Operation, beherbergen die Ratte einzeln um Kannibalismus oder Erstickungsgefahr zu vermeiden, und überwachen sie regelmäßig (mindestens alle 15 min) bis es bewusst und vollständig ambulant.
2. Dann bewerten Sie die Ratten täglich für 5-14 d, mindestens 5 d postoperativ, um sicherzustellen, dass es keine Komplikationen gibt. Während der täglichen Bewertung machen Sie Folgendes.
   1. Die Wunde geschlossen, und die Nähte sind intakt, ohne übermäßig fest.
   2. Es gibt keine Anzeichen einer Infektion in der Schnitt-Website, wie Hitze, übermäßige Schwellung oder eitrigen Ausfluss.
   3. Es gibt keine Anzeichen, die mit Schmerzen, wie verringerte Nahrung und Wasser-Verbrauch, Gewichtsverlust, Austrocknung, Haut zu Zelten oder schnelle und offene Mundatmung verbunden. Zu kontrollieren, die mäßige bis starke postoperative Schmerzen wenn überhaupt, injizieren Sie den Ratten subkutan mit Buprenorphin (0,01 - 0,05 mg/kg) alle 6-8 h⁹ für ein Minimum von 48-72 h postoperativ.

6. Analyse der transplantierten Bereich

1. Einen Monat nach der Transplantation, Scarifice der Ratte und sammeln die transplantierten Bereich für histologische und immunhistochemische Analyse.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Tumorigenität der transplantierten Zellen Blätter bei Ratten:

Einen Monat nach der Transplantation haben alle transplantierten Zellen Blätter in Ratten Leber Tumoren (Abbildung 3) entwickelt. Die durchschnittliche Größe der entwickelten Tumoren von HepG2 HepG2/BMMSC und HepG2/UCMSC Zelle Blätter wurden 4,5 cm, 4 cm und 2,5 cm, bzw.¹⁰.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Umfangreiche Forschung widmet sich der Entwicklung angemessene in-Vivo präklinischen Tiermodell, das menschliche Krebsarten ähnelt. Derzeit umfassen die wichtigsten Ansätze zur Erstellung von Krebs Tiermodellen Gentechnik und Cell Transplantation¹¹. Gentechnisch veränderte Tiermodelle sind gute Tools zur Identifizierung und Validierung von Zielgenen, sowie das Verständnis der molekularen Mechanismen, die Medikamenten-induzierten Toxizität. Dieses Modell ist jedoch mit einigen Einsch...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
FBS	Gibco/Invitrogen	10270106
DMEM high glucose	Sigma	D5671-500ML
Penicillin/streptomycin	Life Technology	15070063
Sterile physiologic saline	Sigma	S0817-1GA
Human HepG2 cell line	ATCC, USA	HB-8065
Human bone marrow MSCs cell line	PromoCell, USA	C-12974
human umbilical cord tissue MSCs	PromoCell, USA	C-12971
Ketamine 50%	Rompun, Bayer
Xylazine 2%	Rompun	23076-35-9
Alphadine® solution.	Riyadh Pharma	LBL0816
Disposables:
15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube	Falcon	352097
3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane)	Sigma	174904-1CS
100-1000 µl  Pipette Tips	Sigma	CLS4868-1000EA
Basic Procedure Drape	Thermofisher	PMD5293.0
Equipment
Plus pipette, variable volume	Eppendorf® Research®	Z683779-1EA
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2	Any brand
Biological safety cabinet	Any brand
Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2	Any brand
Sterile surgical tools and nude rats:
Forceps
Scissors
scalpel
Nylon Suture  5-0	Accutome	AB-3854S	Monofilament, Lancet
1 ml Tuberculin Syringes	Fisher Scientific	14-826-88
Nude rats	Charles river