Esplorare il potenziale delle cellule staminali mesenchimali foglio sullo sviluppo di Carcinoma epatocellulare In Vivo

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per sviluppare un modello in vivo del cancro utilizzando tecnologia dello strato delle cellule. Tale modello potrebbe essere molto utile per la valutazione delle terapie anticancro.

Abstract

Un in vivo modello animale che imita cancro umano potrebbe avere varie applicazioni che forniscono le informazioni cliniche significative. Le tecniche attualmente utilizzate per lo sviluppo di modelli di cancro in vivo hanno notevoli limitazioni. Pertanto, in questo studio, miriamo a implementare la tecnologia dello strato delle cellule per sviluppare un modello di cancro in vivo . Carcinoma epatocellulare (HCC) è sviluppato con successo in nudi ratti utilizzando fogli di cella create da cellule di HCC cella linea. I fogli di cellule di cancro sono generati tramite adesione intracellulare e la formazione di una struttura stratificata, controllata dalla matrice extracellulare. Ciò consente il trapianto di foglio HCC in fegato e la creazione di un modello animale del tumore-cuscinetto entro un mese. Inoltre, il ruolo delle cellule staminali mesenchimali (MSC) nello sviluppo di questo modello di cancro è studiato. Oltre il foglio di linea delle cellule HCC, un'altra cella due fogli vengono creati: un foglio delle cellule HCC e midollo osseo MSCs (BMMSCs) e un foglio di cellule di HCC e cordone ombelicale MSCs (UCMSCs). Fogli che hanno una combinazione di entrambe le cellule HCC e MSCs sono anche in grado di produrre un animale del tumore-cuscinetto. Tuttavia, l'aggiunta di MSCs riduce le dimensioni del formato di tumore, e questo effetto negativo sullo sviluppo del tumore varia a seconda origine dei MSCs usate. Questo indica che una lastra cella determinati sottotipi MSC poteva essere utilizzata nel controllo e gestione di tumore.

Introduzione

HCC è un cancro primario del fegato che è significativamente associato con una prognosi difficile. Ogni anno, quasi mezzo milione nuovi pazienti sono diagnosticati con HCC, che rappresenta 85% dei pazienti di cancro del fegato nel mondo¹. Hepatocarcinogenesis non è una malattia di form singolo; piuttosto, è una collezione di malattie che hanno differenti caratteristiche istopatologiche e variabilità genetica e genomica, oltre alla varia prognostici risultati¹. Di conseguenza, le principali sfide nello sviluppo di un'efficace strategia terapeutica per HCC sono la limitata conoscenza della biologia HCC e la mancanza di un modello animale sperimentale adatto che può aiutare a capire questa complessa malattia. Un in vivo modello animale che imita cancro umano è necessario per la selezione di geni candidati e identificazione di marcatori prognostici/predittivi implicati nell'induzione del cancro, così come per lo studio di diversi fattori che possono influenzare le risposte del cancro agli agenti terapeutici.

Gli studi in vitro del cancro sono ancora associati con grossi limiti. Questo è dovuto al fatto che le cellule tumorali perdono molte delle loro caratteristiche in vivo quando mantenute in coltura. I cambiamenti che si verificano a cellule in vitro risultato dall'assenza della fisiologia del tessuto intero in un ambiente ex vivo . Interazione cellula--cellula di cancro (stromal, immunitario, sistema vascolare, epiteliali, ecc.) all'interno del microambiente tumorale riflette notevolmente il cancro delle cellule caratteristiche². Il microambiente tumorale potrebbe alterare l'espressione proteina/del gene del cancro delle cellule e delle caratteristiche fenotipiche, oltre angiogenetici e potenzialità metastatica. Il sistema di cultura bidimensionale (2D) in vitro manca anche una matrice di tessuto adatto, che è necessaria regolare la progressione del tumore. Così, a causa di queste limitazioni, in vivo modelli dovrebbero sempre essere utilizzati per supportare i risultati preliminari di modelli in vitro . In questo studio, usiamo la tecnologia dello strato delle cellule per sviluppare un in vivo modello animale che delucida il completo processo biologico sottostante HCC.

Più di un decennio fa, laboratorio di Okano stabilito un metodo novello di ingegneria tissutale basata sulla cella foglio tecnologia³. Questa tecnica utilizza una plastica termo-sensibile cultura per consentire l'adesione/distacco cellulare reversibile controllando l'idrofobicità di superficie. Questo metodo consente una delicata raccolta di cellule coltivate nel formato di un intatto tridimensionale (3D) (foglio i.e.,cell), con una curatissima matrice extracellulare (ECM) e le interazioni cellula--cellula. La tecnica di strato delle cellule richiede la spre-spalmatura di piastre di coltura con un polimero termosensibile PNIPPA (PIPA Am), che è commercialmente disponibile e pronto per l'uso. Ad una temperatura inferiore a 20 ° C, PIPA sono polimeri diventano idratati e si dissolvono in soluzioni acquose, considerando che, ad una temperatura superiore (37 ° C), i polimeri diventano disidratati e trasformano in un precipitato torbido. Il polimero contiene catene ammide idrofila e catene laterali idrofobe (gruppi isopropilico). Alle alte temperature, si intensifica il movimento browniano delle molecole d'acqua, considerando che, a bassa temperatura, le molecole dell'acqua che circonda i gruppi isopropilico della ripartizione struttura idratata e i gruppi di isopropile idrofobo aggregare a causa di interazioni idrofobiche. Di conseguenza, l'intera catena del polimero aggrega e precipitati⁴.

Nello studio presentato, questa tecnica è impiegata per sviluppare un modello animale di HCC con tre fogli differenti delle cellule. Il primo foglio impiegato è costituito da cellule di HCC cella linea solo, mentre gli altri due fogli sono costituiti da una combinazione di cellule della linea cellulare HCC e MSCs da due origini diverse: midollo osseo MSCs (BMMSCs) e del cordone ombelicale MSCs (UCMSCs). MSCs sono non-emopoietici cellule stromale che sono capaci di differenziazione intocell derivati del lignaggio mesenchymal, inclusi adipociti, osteociti, condrociti e miociti⁵. La ragione che ci avvaliamo di queste cellule, durante la creazione di strato di cellule di cancro è la segnalazione incoerente sull'effetto di MSCs sui cancri. È stato suggerito che MSCs può avere due fenotipi distinti: "MSC1", un fenotipo proinfiammatorio e "MSC2", un fenotipo immunosoppressivo⁶. MSCs esprimono recettori toll-like (TLR). TLR4 adescamento di MSCs aumenta la secrezione di fattori proinfiammatori, mentre TLR3 innesco aumenta la loro secrezione di fattori immunosoppressivi⁶. Uno studio in vitro di questi due fenotipi ha riferito che una co-coltura di MSC1 con linee cellulari del cancro attenuata la crescita della cellula tumorale, mentre MSC2 co-coltura ha avuto l' effetto opposto⁷. Ciò implica che MSCs può essere Pro-cancro o anticancro, a seconda del loro fenotipo. Così, oltre a sviluppare il modello animale di HCC utilizzando tecnologia dello strato delle cellule, vogliamo esplorare l'effetto del trapianto di MSC sullo sviluppo del tumore, e se utilizzando queste cellule sarà aumentare o ridurre lo sviluppo di questo modello.

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Protocollo

Il protocollo segue le indicazioni di cura degli animali del comitato etico di King Saud University. Le procedure chirurgiche, anestetici e altri farmaci usati sugli animali sono approvati dal comitato etico di King Saud University. Tutto il lavoro sperimentale è eseguito da personale opportunamente addestrato.

1. cella foglio costruzione

1. Spalmate le piastre di coltura (piastre di coltura termosensibile 3.5 cm) non diluito siero bovino fetale (FBS) e garantire per coprire tutta la superficie del piatto.
   Nota: Questo passaggio è importante per il distacco dello strato di cellule dal momento che supporta la crescita delle cellule in un monostrato e impedisce l'aggregazione delle cellule.
2. Incubare i piatti per 24 h a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 5% di CO₂ e il 95% di aria.
3. Rimuovere i FB in eccesso dai piatti rivestiti e consentire i piatti ad asciugare a temperatura ambiente (TA) per almeno 1 h.
4. Preparare le sospensioni tre cellulari: 1 x 10⁶ HepG2 cellule, cellule di 1 x 10⁶ HepG2 con BMMSCs e 1 x 10⁶ HepG2 cellule con UCMSCs (in un rapporto di 4:1 per BMMSCs e UCMSCs).
5. La sospensione di cella appropriata ad ogni piatto con etichetta del seme.
6. Sospendere tutte le cellule in coltura DMEM supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina.
7. Incubare le cellule a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 5% di CO₂ e il 95% di aria.

2. cella foglio distacco

1. Alla confluenza delle cellule di 100%, prendere i piatti fuori l'incubatore a 37 ° C.
2. Incubare il piatto di strato delle cellule HepG2 per 1h a RT, mentre incubando il HepG2/BMMSC e piatti di strato delle cellule HepG2/UCMSC per 30-40 min a 20 ° C in atmosfera umidificata contenente 5% di CO₂ e il 95% di aria.
   Nota: Strato di cellule fatta da solo HepG2 è fragile; riducendo la temperatura a 20 ° C provoca danni alla struttura del foglio.

3. le prestazioni della procedura chirurgica

Nota: Durante il periodo di incubazione per il distacco del foglio cellulare, avviare la procedura di animale.

1. Istruzioni per la preparazione della zona di chirurgia
   1. Effettuare tutte le procedure chirurgiche in un'area sterile separata all'interno del laboratorio, come un cappuccio, a flusso laminare o una sala di chirurgia asettica. Garantire che tutte le superfici dell'area chirurgia sono non-poroso, sigillato, resistente e sanitizzabile.
   2. Indossare equipaggiamento protettivo adeguato, compreso testa e copriscarpe, guanti, maschere e scrub.
   3. Uso chirurgico strumenti che sono pulita e sterilizzata (tramite autoclave; staminali saturo ad alta pressione) all'inizio dell'ambulatorio.
   4. Cambiare i guanti fra i ratti.
2. Preparazione dell'animale per chirurgia
   1. Utilizzare per 12-week-old 8 nudi ratti.
   2. Creare l'anestesia iniettabile per ratti.
      1. Per preparare la soluzione di anestesia, ketamina-xilazina, mescolare 1 mL di soluzione fisiologica sterile (ad es., cloruro di sodio 0,9%) in una fiala di raccolta sterile 10 mL siero, 1 mL di xilazina (ad una concentrazione di 20 mg/mL) e 2 mL di ketamina e agitare bene prima utilizzare.
      2. Per applicare l'anestesia, iniettare 0,2 mL di soluzione di ketamina-xilazina per 100 g di peso corporeo del ratto per via intraperitoneale.
         Nota: La dose totale della soluzione è di 100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina.
   3. Rimuovere lo sporco/detriti visibili dal sito chirurgico.
   4. Controllare la profondità dell'anestesia testando il riflesso di ritiro pedale (piede pad pizzico su entrambi i piedi posteriori).
      Nota: Se il pizzico di rilievo del piede provoca una risposta, ripetere ad una dose di 0,05 mL/100 g (circa ogni 30 min), quindi controllare nuovamente la profondità anestetica.
   5. Disinfettare l'area operata con una macchia di due stadi di povidone-iodio/isopropanolo.
   6. Coprire il topo con un telino sterile per evitare la contaminazione dell'incisione.
   7. Iniettare per via sottocutanea i ratti con buprenorfina (0,01 - 0,05 mg/kg)⁸ prima di effettuare l'incisione.
   8. Usando un bisturi sterile, fare un 7 - a 10 cm di taglio tra le bucce e i muscoli sottostanti per esporre il fegato.
      1. Separare il muscolo addominale dalla pelle con il bordo posteriore piatta del bisturi.
      2. Attentamente pugnalare il linea alba usando un bisturi ed estendere il taglio con forbici affilate.

4. foglio di trapianto

Nota: Trapianto di cellule foglio viene eseguito sul fegato.

1. Raccogliere il foglio delle cellule dalla piastra di coltura.
   1. Picchiettare delicatamente la piastra di coltura sopra il banco per staccare il foglio dalla sua superficie.
   2. Separare strato di cellule dalla superficie del piatto da raschiare il bordo del foglio in un semicerchio utilizzando una pipetta sterile.
   3. Rimuovere delicatamente il mezzo intero dalla piastra di coltura.
   4. Assicurarsi che il foglio è intatto senza alcun danno; in caso contrario, non può essere utilizzato (Figura 1).
      Nota: I fogli risultanti possono essere rilevati direttamente dall'occhio.
2. Preparare una membrana sterile (carta da filtro) per la raccolta di strato di cellule dal piatto.
   1. In primo luogo, mettere a bagno la membrana con soluzione salina. Quindi, rimuovere la soluzione salina in eccesso con un batuffolo di cotone sterile.
   2. Posizionare la membrana umida sopra strato di cellule, evitando pieghe e bolle d'aria tra la membrana e strato di cellule.
   3. Aggiungere alcune gocce di soluzione fisiologica normale sopra la membrana e strato di cellule per raccoglierli più facile.
      Nota: Per evitare di rompere la strato di cellule, non utilizzare la soluzione salina fredda e sollevare la membrana e strato di cellule con il forcipe.
   4. Lasciare la membrana per pochi secondi per assicurarsi che strato di cellule sia correttamente collegato alla membrana e poi raccoglierlo.
3. Preparare il fegato per trapianto di cellule foglio.
   1. Assicurarsi che la superficie del fegato sia asciutta toccando delicatamente con un batuffolo di cotone sterile.
   2. Utilizzando pinze sterili, collocare la membrana con strato di cellule sopra un singolo lobo del fegato del ratto.
   3. Aggiungere poche gocce di soluzione fisiologica sterile e applicare una leggera pressione sulla membrana per staccare il foglio di cella da esso.
   4. Attendere 5 minuti prima di rimuovere con cura la membrana.
      Nota: Questo viene fatto per garantire che strato di cellule sia collegato correttamente al fegato.
   5. Infine, chiudere i muscoli sottostanti e incisioni con suture in nylon 5-0 la pelle.
   6. Disinfettare la zona di chirurgia con povidone-iodio.
      Nota: La figura 2 Mostra un diagramma della procedura di trapianto di cellule foglio sul fegato di ratto nudo.

5. cura post-operatoria di

1. Immediatamente dopo l'intervento chirurgico, il ratto singolarmente per evitare cannibalismo o soffocamento della casa e monitorarlo regolarmente (almeno ogni 15 min) fino a quando non è cosciente e completamente ambulanti.
2. Quindi, valutare i ratti al giorno per 5-14 d, almeno 5 d postoperatorio, per garantire che non ci sono complicazioni. Durante la valutazione giornaliera, assicurarsi di quanto segue.
   1. La ferita è chiusa, e le suture sono intatte, senza essere eccessivamente stretto.
   2. Non ci sono nessun segno dell'infezione del sito di incisione, come il calore, eccessivo scarico purulento o gonfiore.
   3. Non ci sono segni associati con dolore, come il consumo di cibo e acqua in diminuzione, perdita di peso, disidratazione, pelle tenting o respirazione con la bocca aperta e rapida. Al controllo da moderata a grave dolore post-operatorio, se del caso, iniettare i ratti per via sottocutanea con buprenorfina (0,01 - 0,05 mg/kg) ogni 6-8 h⁹ per un minimo di 48-72 h postoperatorio.

6. analisi dell'Area trapiantato

1. Un mese dopo il trapianto, il sacrificio del ratto e raccogliere l'area trapiantata per istologico e l'analisi di immunohistochemical.

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Risultati

Carcinogenicità di strati delle cellule trapiantate in ratti:

Un mese dopo il trapianto, tutti i fogli delle cellule trapiantate in fegati di ratti hanno sviluppato tumori (Figura 3). La dimensione media dei tumori sviluppati da HepG2, HepG2/BMMSC e strati delle cellule HepG2/UCMSC erano 4,5 cm, 4 cm e 2,5 cm, rispettivamente¹⁰.

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Discussione

Una vasta quantità di ricerca è dedicata allo sviluppo di un'adeguata in vivo animale modello preclinico analogo cancri umani. Attualmente, gli approcci principali utilizzati per creare modelli animali di cancro coinvolgono ingegneria genetica e delle cellule trapianto¹¹. Modelli animali geneticamente modificati sono buoni strumenti per l'identificazione e la validazione dei geni bersaglio, come pure la comprensione dei meccanismi molecolari alla base di tossicità indotta da farmaci. T...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
FBS	Gibco/Invitrogen	10270106
DMEM high glucose	Sigma	D5671-500ML
Penicillin/streptomycin	Life Technology	15070063
Sterile physiologic saline	Sigma	S0817-1GA
Human HepG2 cell line	ATCC, USA	HB-8065
Human bone marrow MSCs cell line	PromoCell, USA	C-12974
human umbilical cord tissue MSCs	PromoCell, USA	C-12971
Ketamine 50%	Rompun, Bayer
Xylazine 2%	Rompun	23076-35-9
Alphadine® solution.	Riyadh Pharma	LBL0816
Disposables:
15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube	Falcon	352097
3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane)	Sigma	174904-1CS
100-1000 µl  Pipette Tips	Sigma	CLS4868-1000EA
Basic Procedure Drape	Thermofisher	PMD5293.0
Equipment
Plus pipette, variable volume	Eppendorf® Research®	Z683779-1EA
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2	Any brand
Biological safety cabinet	Any brand
Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2	Any brand
Sterile surgical tools and nude rats:
Forceps
Scissors
scalpel
Nylon Suture  5-0	Accutome	AB-3854S	Monofilament, Lancet
1 ml Tuberculin Syringes	Fisher Scientific	14-826-88
Nude rats	Charles river