Vivo에서 간세포 암 종 개발에 중간 엽 줄기 세포의 잠재력을 탐험

요약

여기, 우리는 vivo에서 암 모델 셀 시트 기술을 사용 하 여 개발 하는 프로토콜을 제시. 이러한 모델은 항 암 치료제의 평가 위한 매우 유용할 수 있었다.

초록

vivo 동물 모델을 모방한 인간의 암 중요 한 임상 정보를 제공 하는 다양 한 응용 프로그램을 가질 수 있습니다. Vivo에서 암 모델의 개발에 대 한 현재 사용 된 기술에는 상당한 제한이. 따라서, 본이 연구에서는 우리 셀 시트 기술을 vivo에서 암 모델 개발을 구현 하고자 합니다. 간세포 암 (HCC) 누드 쥐 HCC 셀 선 세포에서 만들어진 셀 시트를 사용 하 여 성공적으로 개발 됩니다. 암 셀 시트는 세포내 접착 및 세포 외 매트릭스 제어 층 상된 구조 형성을 통해 생성 됩니다. HCC 시트 이식 간 고 한 달 내 종양-베어링 동물 모델의 생성에 대 한 수 있습니다. 또한,이 암 모델 개발에서 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 역할은 조사. HCC 셀 라인 시트 외에 다른 두 셀 시트 만들어집니다: HCC 세포와 골 MSCs (BMMSCs)와 HCC 전지와 탯 MSCs (UCMSCs)의 시트의 시트. HCC 세포와 MSCs의 시트는 종양 방위 동물을 생산 할 수 있습니다. 그러나, MSCs의 추가 구성 된 종양의 크기 줄이고 종양 개발에 불리 한 영향이 사용된 MSCs의 소스에 따라 달라 집니다. 이 특정 MSC의 만든 셀 시트 종양 관리 및 제어에 활용 될 수 나타냅니다.

서문

HCC는 간 크게 빈약한 예 지와 관련 된 기본 암입니다. 매년, 거의 절반 백만 새로운 환자 진단 HCC, 간 암 환자 세계¹의 85%를 대표 하는. Hepatocarcinogenesis는 단일 형태의 질병; 오히려, 그것은 이외에 다른 histopathological 기능 및 유전자와 게놈 다양성, 질병의 모음 다양 한 전조 결과¹. 따라서, HCC에 대 한 효과적인 치료 전략의 개발의 주요 과제는 HCC 생물학의 제한 된 지식과이 복잡 한 질병을 이해 하는 것을 도울 수 있는 적합 한 실험 동물 모델의 부족. Vivo에서 동물성 모형 인간 암 모방 하는 후보 유전자를 선택 하 고 연루 조사 암 응답에 영향을 미칠 수 있는 다른 요인 뿐만 아니라 암 유도, 전조/예측 마커 식별에 필요한 치료 요원입니다.

시험관에 암 연구는 여전히 주요 한계에 연관 된다. 이 사실은 암 세포 기능의 그들의 비보에 문화에서 유지 될 때 많은 손실입니다. 세포 생체 외에서 결과 비보 전 설정에서 전체 조직 생리학의 부재에서 발생 하는 변경 합니다. 암 세포 세포 상호 작용 (실질, 면역, 맥 관 구조, 상피, 등) 종양 microenvironment 내 암 세포 특성²에 크게 반영합니다. 종양 microenvironment 암 세포 유전자/단백질 표정 및 angiogenetic 및 전이성 잠재력 phenotypic 특성을 변경할 수 있습니다. 2 차원 (2 차원) 생체 외에서 문화 시스템은 또한 종양의 진행을 조절 하는 데 필요한 적합 한 조직 매트릭스를 결여 된다. 따라서, 이러한 제한으로 인해 모델 vivo에서 항상 체 외에 모델의 예비 결과 지원 하기 위해 활용 되어야 합니다. 이 연구에서 우리는 vivo에서 동물 모델을 기본 HCC 완전 한 생물학 과정을 보통 개발 하 셀 시트 기술을 사용 합니다.

이상 10 년 전, 오 카노의 실험실 설립 셀 시트 기술³에 따라 조직 공학의 새로운 방법. 이 기술은 표면 hydrophobicity를 제어 하 여 가역 세포 접착/분리 수 있도록 온도 응답 문화 플라스틱을 이용 한다. 이 메서드는 잘된 세포 외 기질 (ECM) 및 셀 상호 그대로 3 차원 (3 차원) 형식 (i.e.,cell 시트), 배양된 세포의 부드러운 수확을 수 있습니다. 셀 시트 기술은 상업적으로 사용할 수 및 사용할 준비가 문화 요리 (PIPA) 오전, 온도 반응 중합체 poly(N-isopropylacrylamide) precoating을 해야 합니다. 온도 20 ° c에서 PIPA 오전 고분자 화 되 고 반면, 더 높은 온도 (37 ° C)에서 중합체 탈수 되 고 혼 탁 한 침전 변환 수성 솔루션에 용 해. 고분자는 친수성 아 미드 체인 및 소수 성 측 쇄 (이소프로필 그룹)를 포함합니다. 높은 온도에서 물 분자의 브라운 운동 강화입니다, 반면에, 낮은 온도에서 수산화 구조 분석의 이소프로필 그룹 및 소수 성 이소프로필 그룹을 둘러싼 물의 분자 집계 때문에 소수 성 상호 작용. 따라서, 고분자의 전체 체인 집계 하 고 침전 물이⁴.

제시 연구에서이 기술은 세 가지 다른 셀 시트를 사용 하 여 HCC 동물 모델 개발 채택 된다. 첫 번째 시트 고용 이루어져 HCC 셀 라인만, 반면 다른 두 시트 HCC 셀 라인 셀과 두 개의 서로 다른 소스에서 MSCs의 조합으로 구성: 골 MSCs (BMMSCs) 및 탯 MSCs (UCMSCs). MSCs는 비 조 혈 stromal 세포 adipocytes, 등 osteocytes, chondrocytes, myocytes⁵엽 혈통의 intocell 파생 상품을 차별화 할 수 있다. 암 셀 시트를 만들 때 이러한 세포를 사용 하는 우리가 하는 이유는 암에 MSCs의 효과에 일치 하지 않는 보고. MSCs가 두 가지 고기를 가질 수 있습니다 제안 되었습니다: "MSC1", proinflammatory 표현 형 및 "MSC2", 면역 표현 형⁶. MSCs는 수용 체 통행세 같이 (TLRs)를 표현 한다. MSCs의 TLR4 못쓰게 TLR3 못쓰게 면역 요인⁶의 그들의 분 비를 증가 하는 반면 proinflammatory 요인의 그들의 분 비를 증가 시킵니다. 이러한 두 고기의 생체 외에서 연구 보고 MSC2 공동 문화 반대 효과⁷를 했다 하는 동안 암 세포 라인 MSC1의 공동 문화 암 세포 성장를 감쇠. 이 연루 MSCs 프로 암 또는 항 암 제, 그들의 표현 형에 따라 될 수 있습니다. 따라서, 셀 시트 기술을 사용 하 여 HCC 동물 모델 개발, 뿐만 아니라 우리 종양 개발에 MSC 이식의 효과 탐험 하고자 이러한 세포를 사용 하 여 것입니다 향상 여부 등이 모델의 개발을 줄이기 위해.

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프로토콜

프로토콜의 킹 사우드 대학 윤리 위원회 동물 보호 지침을 따릅니다. 수술 절차, 마 취약, 그리고 동물에 이용 된 다른 약물 킹 사우드 대학 윤리 위원회에 의해 승인 됩니다. 모든 실험 작업은 적절 하 게 훈련 된 직원에 의해 수행 됩니다.

1. 셀 시트 건설

1. Undiluted 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 문화 요리 (3.5 cm 온도 응답 문화 요리) 코트와 접시의 모든 표면을 커버를.
   참고:이 단계는 단층에는 세포의 성장을 지원 하 고 셀 집계를 방지 이후 셀 시트의 분리에 대 한 중요 하다.
2. 포함 하는 5% CO₂ 와 95% 공기 습도 분위기에서 37 ° C에서 24 시간을 위한 요리를 품 어.
3. 코팅된 요리에서 초과 FBS를 제거 하 고 요리 1 시간 이상 실 온 (RT)에서 건조를 허용 합니다.
4. 3 셀 정지 준비: 1 x 10⁶ HepG2 세포, BMMSCs, 1 x 10⁶ HepG2 세포 및 (BMMSCs와 UCMSCs에 4: 1의 비율)에서 UCMSCs 가진 1 x 10⁶ HepG2 세포.
5. 씨 각 레이블이 접시에 적절 한 세포 현 탁 액.
6. DMEM 배양 10 %FBS 1% 페니실린/스 보충에 있는 모든 셀을 일시 중단 합니다.
7. 셀을 포함 하는 5% CO₂ 와 95% 공기 습도 분위기에서 37 ° C에서 품 어.

2. 셀 시트 분리

1. 100% 셀 합류에서 37 ° C 배양 기에서 요리를 가져가 라.
2. HepG2/BMMSC 및 HepG2/UCMSC 셀 시트 요리 포함 5% CO₂ 와 95% 공기 습도 분위기에서 20 ° C에서 30-40 분 동안 잠복기 동안에 RT, 1 시간에 대 한 HepG2 세포 시트 접시를 품 어.
   참고:만 HepG2에서 만든 셀 시트는 깨지기 쉬운; 20 ° C에 온도 감소 하면 시트의 구조에 손상을.

3입니다. 수술의 성능

참고: 셀 시트 분리에 대 한 보육 시간 동안 동물 절차 시작.

1. 수술의 준비에 대 한 지침
   1. 후드, 층 류 캐비닛, 등 무 균 수술 실, 실험실 내에서 살 균 별도 영역에서 모든 수술 절차를 수행 합니다. 수술의 모든 표면 비 다공성, 봉인, 내구성, 그리고 sanitizable 인지 확인 합니다.
   2. 스크럽, 장갑, 검, 및 머리 및 구두 덮개를 포함 하 여 적절 한 보호 장구를 착용 하십시오.
   3. 수술에 사용 하는 도구는 깨끗 하 고 소독 (압력가 마로 소독을통해 , 높은 압력에서 포화 줄기) 시작 부분에서의 수술.
   4. 장갑을 쥐 사이 변경 합니다.
2. 수술에 대 한 동물의 준비
   1. 8 월에 12 주 된 누드 쥐를 사용 합니다.
   2. 쥐에 대 한 주사 마 취를 만듭니다.
      1. 마 취 솔루션을 준비, 케 타 민-xylazine, 2 mL의 마 취 제 (20 mg/mL의 농도)에 xylazine의 1 mL, 멸 균 생리 식 염 수 (예를 들어, 0.9% 염화 나트륨) 살 균 10 mL 혈 청 컬렉션 유리병에서의 1 mL를 혼합 하 고 전에 잘 흔들어 사용 하 여.
      2. 마 취를 적용 하려면 intraperitoneally 쥐의 몸 무게의 100 g 당 케 타 민 xylazine 솔루션의 0.2 mL를 주사.
         참고: 솔루션의 총 복용량은 100 mg/kg의 마 취 제 및 xylazine의 10 mg/kg 이다.
   3. 수술 사이트에서 보이는 먼지/이물질을 제거 합니다.
   4. 페달 철수 반사 (두 뒷 발에 발 패드 핀치)을 테스트 하 여 마 취의 깊이 확인 합니다.
      참고: 발 패드 핀치에 응답 하면 복용량의 0.05 mL/100 g (약 매 30 분), 반복 다음 마 취 깊이 다시 확인 합니다.
   5. Povidone-요오드/소 프로 파 놀에 의해 2 단계 스크럽으로 수술 영역을 치료.
   6. 절 개의 오염을 피하기 위하여 무 균 드 레이프와 쥐를 커버.
   7. Buprenorphine (0.01-0.05 mg/kg)으로 쥐를 피하 주사⁸ 절 개를 하기 전에.
   8. 살 균 메스를 사용 하는 7-하-10cm 스킨과 간 노출 기본 근육 사이 컷 확인 합니다.
      1. 메스의 편평한 뒤 가장자리 피부에서 복 부 근육을 구분 합니다.
      2. 조심 스럽게 찔 러는 교육 알바 메스를 사용 하 고 날카로운가 위 컷을 확장.

4. 셀 시트 이식

참고: 셀 시트 이식 간에 수행 됩니다.

1. 문화 요리에서 셀 시트를 수집 합니다.
   1. 부드럽게 벤치 시트는 표면에서 분리를 통해 문화 접시를 누릅니다.
   2. 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 30 원에 시트의 가장자리를 된다고 하 여 접시의 표면에서 셀 시트를 구분 합니다.
   3. 부드럽게 문화 접시에서 전체 매체를 제거 합니다.
   4. 어떤 손상도 없이 그대로 시트 확인 그렇지 않으면, 그것은 수 없습니다 (그림 1)을 사용.
      참고: 결과 시트를 직접 눈으로 감지할 수 있습니다.
2. 셀 시트 접시에서 수확 살 균 막 (종이 필터)를 준비 합니다.
   1. 첫째, 일반적인 염 분으로 막 담가. 그런 다음, 메 마른 목화 패드와 함께 과잉 염 분을 제거 합니다.
   2. 주름과 기포 막과 셀 시트 사이 피하 면 서 젖은 막 셀 시트 장소.
   3. 막 그리고 그들을 쉽게 수집 하 셀 시트 정상적인 염 분의 몇 방울을 추가 합니다.
      참고: 셀 시트를 위반을 피하기 위해, 하 하지 차가운 식 염 수를 사용 하 고 집게와 막 셀 시트를 올려.
   4. 셀 시트는 막에 제대로 장착 되었는지 확인 하려면 몇 초 동안 막 두고 그것을 수집 합니다.
3. 간 세포 시트 이식에 대 한 준비.
   1. 간 표면 살 균 목화 패드와 함께 부드럽게 그것을 활용 하 여 건조 하다 다는 것을 확인 하십시오.
   2. 소독 집게를 사용 하 여 셀 시트와 막 쥐의 간 단일 엽 놓습니다.
   3. 살 균 염 분의 몇 방울을 추가 하 고 그것에서 셀 시트 분리 막에 부드러운 압력을 적용.
   4. 신중 하 게 막 제거 하기 전에 5 분 기다립니다.
      참고:이 셀 시트 제대로 간 연결 위해 수행 됩니다.
   5. 마지막으로, 기본 근육 닫고 5-0 나일론 봉합 절 개 피부.
   6. Povidone-요오드와 수술 영역을 치료.
      참고: 그림 2 누드 쥐의 간장에 셀 시트 이식 절차의 다이어그램을 보여 줍니다.

5. 수술 후 관리

1. 즉시 수술 후, 식인 풍습 또는 질 식, 방지 하려면 개별적으로 쥐를 집 고 그것은 정기적으로 (매 15 분) 모니터링 의식과 완전히 ambulant 때까지.
2. 그런 다음, post-operatively, 합병증을 매일 5-14 d, 5 d 이상에 대 한 쥐를 평가 합니다. 매일 평가 하는 동안 다음의 있는지 확인 합니다.
   1. 상처가 닫히고는 봉합 지나치게 꽉 되지 않고 그대로 있습니다.
   2. 과도 한 열, 등 절 개 사이트에서 감염의 흔적은, 붓기 또는 purulent 방전.
   3. 통증, 음식 및 물 소비를 감소, 체중 감소, 탈수, 피부 tenting, 또는 빠르고 오픈 입 호흡 등와 관련 된 흔적을 확인 하 고 있습니다. 제어 심한 수술 후 통증에 적당 한 경우, 주사 쥐 피하 buprenorphine (0.01-0.05 mg/kg)으로 최소 48-72 h에 대 한 모든 6-8 h⁹ postoperatively.

6입니다. 이식된 지역 분석

1. Scarifice 쥐 이식 후 한 달에 대 한 이식된 지역 수집 조직학 및 immunohistochemical 분석.

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결과

쥐에 이식된 셀 시트 tumorigenicity:

이식 후 1 개월 쥐의 간은에서 모든 이식된 셀 시트 종양 (그림 3)를 개발 했습니다. HepG2, HepG2/BMMSC, HepG2/UCMSC 셀 시트에서 개발 된 종양의 평균 크기 4.5 cm, 4 cm, 및 2.5 cm, 각각¹⁰했다.

간 조직?...

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토론

연구의 광범위 한 금액은 적절 한 비보에 전 임상 동물 모델 인간의 암과 유사한 개발에 전념 하 고 있습니다. 현재, 암 동물 모델을 만드는 데 사용 하는 주요 접근 유전 공학 및 세포 이식¹¹를 포함 한다. 유전자 변형된 동물 모델 식별 및 기본 약물 유발 독성 분자 메커니즘을 이해 뿐만 아니라 대상 유전자의 유효성 검사에 대 한 좋은 도구입니다. 그러나,이 모델은 관련 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
FBS	Gibco/Invitrogen	10270106
DMEM high glucose	Sigma	D5671-500ML
Penicillin/streptomycin	Life Technology	15070063
Sterile physiologic saline	Sigma	S0817-1GA
Human HepG2 cell line	ATCC, USA	HB-8065
Human bone marrow MSCs cell line	PromoCell, USA	C-12974
human umbilical cord tissue MSCs	PromoCell, USA	C-12971
Ketamine 50%	Rompun, Bayer
Xylazine 2%	Rompun	23076-35-9
Alphadine® solution.	Riyadh Pharma	LBL0816
Disposables:
15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube	Falcon	352097
3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane)	Sigma	174904-1CS
100-1000 µl  Pipette Tips	Sigma	CLS4868-1000EA
Basic Procedure Drape	Thermofisher	PMD5293.0
Equipment
Plus pipette, variable volume	Eppendorf® Research®	Z683779-1EA
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2	Any brand
Biological safety cabinet	Any brand
Tissue culture incubator 20 °C, 5% CO2	Any brand
Sterile surgical tools and nude rats:
Forceps
Scissors
scalpel
Nylon Suture  5-0	Accutome	AB-3854S	Monofilament, Lancet
1 ml Tuberculin Syringes	Fisher Scientific	14-826-88
Nude rats	Charles river