Orta serebral arter tıkanıklığı ortak karotid arter onarım ile reperfüzyon farelerde izin

Özet

Intraluminal filaman tıkanıklığı orta serebral arter deneysel kontur rodents en sık kullanılan vivo içinde modeldir. Ortak karotid arter onarım izin vermek için başka bir cerrahi yaklaşım burada, reperfüzyon ortak karotid arter ve orta serebral arter bölge tam bir reperfüzyon veren gerçekleştirilir.

Özet

İskemik inme yetişkin uzun vadeli sakatlık ve ölüm dünya çapında önemli bir nedenidir. Mevcut tedaviler mevcut, sadece doku plazminojen aktivatör (ton) iskemik inme hedeflemek için bir onaylı uyuşturucu tedavi olarak ile sınırlıdır. İskemik inme alanında mevcut araştırma daha iyi geliştirmek ve yeni ilaç hedefleri araştırmak için kontur, patofizyoloji anlamayla ilgili odaklanır. Güvenilir deneysel kontur modelleri potansiyel tedaviler ilerleme için büyük önem taşımaktadır. Orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) model klinik ve en sık kullanılan cerrahi modeli iskemik inme kemirgen. Ancak, lezyon cilt gibi bu modeli sonucunu değişkenliği, özellikle farelerde yüksek düzeyleri ile ilişkilidir. Burada açıklanan alternatif MCAO model reperfüzyon ortak karotid arter (CCA) ve fibrinojen-esaslı dolgu macunu ile gemi ve geliştirilmiş onarmak için bir doku panelini kullanma orta serebral arter (MCA) topraklarının artan perfüzyon sağlar refah farelerin dış karotid arter (ECA) ligasyonu kaçınarak. Bu da son derece anatomik olarak değişken farelerde olduğu bilinmektedir Willis daire üzerine güven azaltır. Bu alternatif cerrahi yaklaşım kullanarak geleneksel MCAO yaklaşım ve burada açıklanan alternatif yaklaşım arasında lezyon cilt değişkenliği azaltır temsilcisi verileri görüntüleyin.

Giriş

Serebral felç bir büyük orta serebral arter ülkesinde odak iskemi nedeni. Doku plazminojen aktivatör (ton) çok sayıda klinik ilaç denemeleri için iskemik inme^1,2hedeflenen rağmen kanıtlanmış etkinliği ile kullanılabilir sadece farmakolojik tedavi yöntemidir. Ancak, güvenlik endişeleri ve dar terapötik pencere (< 4.5 h), nedeniyle tüm inme hastalarında sadece % ~ 15 ton almak uygundur ve recanalization gore < %50^3,4olabilir.

Kontur tekrarlanabilir ve klinik hayvan modelleri yeni ve potansiyel felç tedavi tedaviler gelişimi bilgilendirmek için temel olarak kabul edilir. Ancak, tutarlılık ve değişkenlik hayvan modelleri ile sonuçları ile ilgili endişeleri nedeniyle klinik preklinik çalışmalar çeviri geliştirmek için varolan vivo içinde modelleri geliştirmek önemli kalır. Preklinik deneysel etkinlik klinik kullanım için çeviri potansiyel tedaviler eksikliği kontur araştırma⁵için devam eden bir konusudur. Çeviri başarısızlık nedenlerini birden fazla olması muhtemeldir ve ilgili olabilir Örneğin, deneme tasarım, tedavi gecikmeler, klinik kontur heterojenite, için ve hayvan modellerin sınırlarını⁶kullanılır. Kontur araştırma için anahtar bir meydan okuma güvenli ve etkili tedaviler gelişimi kalır.

Orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) intraluminal filaman ekleme tarafından deneysel darbesinin en sık kullanılan vivo içinde kemirgen modelidir. Bu model kan akımı restorasyon sonra insan kontur⁷' de meydana gelen olayları taklit eden bir iskemi indüksiyon sağlar. Ancak, özellikle farelerde, türdeş olmayan lezyon birimleri çeşitli standart sapmalar ile tanımlanan olsa bile uygulanan^8,9,10cerrahi kurallarıdır oluşur. Biomodel dağılımı küçük striatal ve büyük striato-kortikal lezyon birimleri¹¹görmek için normaldir. İskemi ikna etmek için filaman genellikle CCA veya kalıcı olarak ve birleştirilmiş¹²kalması ECA bir kesi eklenir. CCA kalıcı ligasyonu iç karotis arter (ICA) ve daha sonra MCA bölge kan akışına yeniden kurulması engeller. Bu reperfüzyon Willis daire (inek) içinde ikincil arz güvenen olmak neden olur. İnek yapısı bireysel hayvanlarda genellikle vivo içinde kontur araştırma¹³' te kullanılan özellikle C57BL/6 fareler bir zorlanma arasındaki anatomik değişkenlik vardır. Alternatif bir yöntem, ECA, aracılığıyla filaman ekleme CCA, ancak bu yöntem uzlaşma yoluyla devam eden perfüzyon arteryel kaynağı, fareler, hayvanın üzerinde zararlı bir etkisi olduğu gösterilmiştir ECA bölge izin vermez su kuyusu-varlık¹⁴.

İnek ikincil arz ve reperfüzyon kurulan MCAO modeli için güvenilmesi kısmen tıkanıklığı takip lezyon cilt değişkenliği için sorumlu olabilir. Biz burada ECA ligasyonu kaçınılması ve CCA kesi onarıldıktan, bir alternatif fare cerrahi böylece reperfüzyon CCA, inek bağımsız aracılığıyla izin açıklayınız. CCA kesi tamiri daha önce de, fareler ile CCA¹⁵başarılı bir reperfüzyon neden olduğu gösterilmiştir. Biz bu yaklaşımda fareler¹¹ başarıyla uygulamış olan ve lezyon cilt, deneysel kontur çalışmalarda kullanılan ana sonuç ölçü azaltılmış bir değişkenlik sonuçlanır Protokolü rapor burada.

Bu protokol için reperfüzyon izin vermek için bir doku pad ve dolgu macunu uygulama içerir CCA gemi onarım tarafından takip CCA gemi filaman ekleme ile MCAO taahhüt nasıl gerçekleştirileceğini gösterir.

Protokol

Bu protokol ve rapor verileri aşağıdaki kurumsal etik onay ve İngiltere'de hayvanlar (bilimsel yordamlar) Yasası, 1986 (proje lisans 60/4315) uygun olarak yapılmıştır. Tüm deneylerin hayvan araştırma uygun olarak raporlanır: In Vivo deneyler (varış) yönergeleri¹⁶tane raporlama.

1. hazırlık

1. Yetişkin erkek C57BL/6 fareler için ameliyat sonrası bakım (Örneğin, çevre, yatak takımları, kurtarma gıdalar) hakkında bilgi edinin ameliyattan önce en az 48 saat.
   Not: Post-MCAO hayvanlar kez ameliyat içme ve yemek yeme ile zorluk.
   1. Ameliyatı takiben aşırı kilo kaybını önlemek için hayvanlar tarafından herhangi bir post-MCAO diyet için örneğin, rehidrasyon jel, jel gıda ve batırılmış/ıslak normal diyet peletler doğrudan kafes yere yerleştirerek parkenizin.
   2. Beyaz kağıt çip gibi ameliyat sonrası yatak için kafes yatak takımları değiştirmek.
2. Tüm cerrahi alet cerrahi ayarı veya yordamlar başlamadan önce sterilize.
   1. Isıyla tarafından araçlarla (121 ° C, 15 PSI, 15dk için en az) bunu veya etilen oksit (8-10 h için doğru üretici talimatları izleyerek).
   2. Kadar prosedürü ayarlama önce tüm yüzeyler dezenfekte. Steril Cerrahi perdeler veya ameliyat sırasında işleme gerektiren öğeler için autoclaved folyo ile tüm yüzeyler kapsar. Aseptik teknik işlem süresi için kullanın.
      Not: Autoclaved folyo aletleri veya ameliyat sırasında tutulmaları gerekir ekipman karşılamak için kullanılabilir. Steril eldiven ve teknikleri kullanarak, folyo ve uygulanabilir, daha sonra öğeyi steril alana yerleştirilebilir. Bunu steril eldiven değişiklik gerekli olacaktır.

2. Orta serebral arter tıkanıklığı cerrahisi

1. Ameliyat anda 24-31 g ağırlığında yetişkin erkek C57BL/6 fare kullanın. 2 L/min O₂, kırmızı plastik anestezi odasında %5 isoflurane kullanarak anestezi neden.
2. İndüksiyon, takip azaltmak cerrahın düşürmek için bir hazine sistemiyle birlikte yüz maskesi tarafından sunulan bir yeterli anestezi derinliği (Örneğin, 1.5-%2 %70 N₂O₂/30% O₂), ameliyat için korumak için isoflurane isoflurane maruz.
   Not: nitrojen (N₂O₂) oksijen (O₂) ile birlikte isoflurane yeterli anestezi derinliği için gerekli azaltmak için kullanılabilir.
3. Pre-operatively sistemik analjezi yönetmek [carprofen, 10 mg/kg subkutan (SC)] ve belgili tanımlık kesme için lokal anestezi site (bupivacaine, 2 mg/kg SC, % 0,9 serum seyreltilmiş 1:10) peri-çimentosu.
4. Sıvı pre-operatively mayi (IP.) tarafından steril prewarmed % 0,9 NaCl çözüm 200 µL enjeksiyonlari yönetmek.
5. Sağdaki kürk tıraş temporal bölge ve ventral boyun bölgesi deri ortaya çıkarmak için küçük saç kesme makineleri kullanarak. Ameliyat sırasında kurumasını önlemek için 3 dk. Uygula oküler yağ üzerine her iki gözde, %5 klorheksidin çözüm kullanıp cerrahi Cilt alanını dezenfekte.
   Not: Nabız oksimetri okuma monitör kan oksijen doygunluğu, nabız ve solunum hızı için gerekirse, arka bacak saç temizlemek için saç dökücü krem kullanın. Temiz pamuk kullanarak krem uygulamak tomurcukları ve, epilasyon sonra alan seyreltik klorheksidin çözüm ile yıkayın. Pre-operative bir alanda steril cerrahi alan bulaşıcı gevşek kürk riskini en aza indirmek için bu adımı gerçekleştirin. Araştırmacılar diğer cerrahi sitesi hazırlıklar yerel uygulama göre kullanmayı tercih edebilirsiniz.
6. Fare için cerrahi alan transfer ve yüzükoyun steril bir örtüsü ile kaplı bir homeothermic ısı mat yerleştirin. Anestezi ile burun konisi korumak. Fare vücut sıcaklığını izlemek ve 37,0 ± sürdürmek bir rektal sonda eklemek 0,6 ° C.
   1. Herhangi bir cerrahi kesik önce arka pençe çekilme refleks denetleyin ve refleks anestezi derinliği onaylamak için yanıp.
7. MCA bölge kan akışını kaydetmek için bir lazer Doppler flowmetry (LDF) sonda takmak.
   1. Diseksiyon stereoscope kullanarak, bir kesi < 1 cm sağ göz ve kulak No 15 neşter kullanarak maruz kalan geçici deri arasındaki orta nokta yaptırın. Açık açık kafatası kapsayan, yavaşça bu kemik uzak kazıma ve steril pamuk temizleme bezi ile yüzey kurutma temel dokusu incelemek.
      Not: Temporalis kas zarar vermemeye özen göstermelidir.
   2. 0.7 mm, düz bir kenar elde, bu çörek şeklinde sonda sahibi ile itmek ve optik eşleşen jel az miktarda lif sonuna yerleştirin keskin bir neşter kullanarak sona cut LDF monitör bağlı esnek tek fiber optik sonda tut.
   3. Su geçirmez süper yapıştırıcı tutkal sonda tutucu alt kenarında küçük bir miktar yerleştirin; Bu kısmen kuru ve yapışkan hale izin.
   4. Kafatası temporal kemik üzerinde kuru ve kemik bir daireye topikal doku yapıştırıcı az miktarda yer prob sahibi için yetecek kadar.
   5. Sonda tutucu, fiber optik sonda zaten yerde, bu alanındaki (6 mm lateral ve 2 mm bregma distal) yerleştirin.
   6. Yapıştırıcının kuruması zaman tanıyın; bir kez kuru ve ekli, LDF veri kaydetmeye başlayın.
8. Yavaşça hayvan lazer Doppler sonda destek ve onun dekolmanı önlemek için dikkat çekici bir sırtüstü konumuna çevirin. Yavaşça iki forepaws gözenekli tıbbi bant alan Asansör ve gerginlik yaratmak için pamuk tomurcukları (veya benzeri gibi kapalı forseps,) boyun altında bir çift sürgülü ile aşağı bant. Fare aseptik kapsama korumak için steril bir örtü ile kapak.
9. Diseksiyon ve maruz kalma CCA başlar.
   1. 1,5 cm ensizyon maruz ventral boyunda bir No 15 neşter bıçak kullanarak olun.
   2. Nazik künt diseksiyon teknikleri kullanarak, yavaşça tükürük bezleri trakea açığa yanlara, geri çek.
   3. Künt diseksiyon kullanarak, CCA çevreleyen doku ve Vagus sinir ücretsiz incelemek.
      Not: herhangi bir hasar Vagus sinir besleme ve nefes hareketlilik, zarar verebilir gibi doğrudan, Vagus sinir dokunmaktan kaçının.
10. İki küçük (2 cm) bölümlerini bir sigara-eriyen 6-0 dikiş CCA, gemi ve ventral Vagus sinir dorsal aşağıda geçmek. Cerrah için bir ipek kravat daha yakın çizmek ve CCA (proksimal kravat) sıkıca bağla. Gevşek ICA/ECA bifurkasyon doğru ikinci ipek kravat (distal kravat) bağla.
11. CCA bir bölümünü yalıtmak başlamak için mikrovasküler klipi distal kravat ama bifurkasyon tıkayan değil hemen üzerinde uygulayın. Mikro kenasen makas kullanırken, CCA küçük bir delik açmak.
    Not: Her zaman ECA patent kalması gerekir. CCA kesi gemi ve kolayca erişilebilir bir ventral konumda genişliği en fazla % 40 olması gerekir; Bu gemi onarım sahne post-MCAO içinde önemli bir rol oynayacaktır.
12. Mikrovasküler klip doğru ilerleyen CCA, silikon kaplı bir 7-0 monofilament takın.
    Not: Fare ağırlık ameliyat öncesi temel filaman boyutu oluşturulmalıdır; üreticinin yönergeleri için başvurun.
    1. Distal kravat, yeterince zarar vermeden yerine filaman tutturmak için sıkın. Mikrovasküler klip Clip sahipleri kullanarak kaldırın.
       Not: Bu noktada hiçbir kan kaybı etmeliydim. Bir geri tepme kan ise, filaman tutan kravat yeterince sıkı değil.
13. Filaman ICA ilerlemek.
    1. Filament ICA içinde kalır ve pterygopalatine arter (PPA) geçmek değil emin olun. Bunu biraz kaldırma ve hayvanın vücut, dış tarafına ipek kravat birini kullanarak CCA çekerek ve filament PPA dahili olarak karşılıklı açılması geçmiş viraj yönlendirmek.
       Not: Bir kez MCA şube kaynağı için gelişmiş, bir damla göreli kan akışı sağlanan bölge LDF değerleri görünür hale gelir; Bu filaman yerleşim onaylar.
14. Filaman güvenli Bu ipe distal ipek kravat ile daha sıkı yerleştirin. Tıkanıklığı zaman dilimi süresince yerinde bırakmak.
    Not: Bağımlı bireysel protokol, hayvan kurtarma kafese hareket edebilir, aşağıdaki kurtarmak için dikiş yarası ya da anestezi altında tıkanıklığı dönemi süresince kalır. İkinci durumda, yara steril prewarmed % 0,9 NaCl salin kullanarak kurutma üzerinden engellenir sağlamak.

3. sonrası tıkanıklığı

1. Beyaz filaman baş açıkça görünene kadar MCAO dönemin sonunda filaman hemen geri çekin.
2. O zaman, gevşetin distal CCA filaman damar yolundan baş çoğunu kaldırmak için sadece yeterli bağla.
   Not: cerrah kan kaybını önlemek için distal kravat kravat hızıyla emindir filaman tam bu noktada kaldırılabilir.
3. CCA çatallanma distal kravat yanındaki doğru yatay bir konumda bir mikrovasküler küçük resim yerleştirin. Distal kravat gevşetin ve filament tamamen kaldırın. Başka bir mikrovasküler kırpmak aşağı doğru Cerrah proksimal CCA kravat ekleyin.
   Not: gemi yeteri kadar herhangi bir kaymayı önlemek için kelepçe dişleri olduğundan emin olun. Küçük resimleri clip sökücüler sırasında sonraki adımlarında kolay erişim sağlamak için gerekli bir yerleşimdir. Küçük resimleri daha iyi bir temizlik ve küçük resimleri yatay çevreleyen kasların yerleştirerek doku düzeltme eki yerleşimini izin vermek için gemi kaldırmak yardımcı olmak için kullanılabilir.
4. Dikkatle Dumont #5 forseps veya mikro kenasen makas kullanılarak her iki ipek kravat kaldırmak ve steril pamuk tomurcukları kullanarak alan kuru.
   Not: Damar / içine kesmemeye özen göstermelidir.
5. Bir steril Petri dish, iki madde sağlanması fibrinojen ve Trombin dolgu macunu çözümleri 1 ve 2, ( Tablo reçetesigörmek) hazır ayrı, daha sonra karıştırma için kal ekleyin.
   Not: Sadece çok küçük birimler ajanlar gerekli (< 0.25 mL her) vardır. Çözümler ayrı tutulması iki bileşenleri arasında erken bir tepki engeller. Çapraz bulaşma tepki ve şırınga içinde ayarla aracı neden iki şırıngaların önlemek için kaldırıldı olarak kapağı aynı şekilde değiştirilir emin olun. Kullanımdan önce çözümleri-20 ° C'de depolayın İlk ameliyat için gerektiğinde, dolgu macunu için oda sıcaklığında erimek. Dolgu macunu refreeze değil; Oda sıcaklığında kalması ve bu şekilde saklanabilir. Şırınga düşük maliyetli yapma birden çok ameliyat kullanılabilir; Ancak, aynı şişe 1 haftadan uzun kontaminasyonu önlemek için kullanmamayı öneririz.
6. Kas boyunca künt diseksiyon Dumont yok 5 forseps ve mikro kenasen makas ile ince bir ventral dilim dilim en fazla 1 mm kalınlığında ve kas lifleri en iyi çalışır sağlanması doku yastık kullanmak için boyun kas elde etmek için kullanın.
   Not: Bu işlevi önemli ölçüde zarar gibi kas / genelinde kesmeyin. Doku CCA kesi rahat karşılamak için yeterli büyüklükte olması gerekir.
7. Dumont #5 forseps kullanarak, doku pad alıp, dolgu macunu çözümleri, iki reaktifler arasında bir kanal oluşturan iki fibrinojen ve Trombin arasında eşit olarak doku karıştırın. Koagulasyon hızla ortaya çıkar; koagülasyon başlar başlamaz, doku pad CCA kesi için kaldırın. Bir orta firma basınç ve açık forseps ile düz aşağı doku yastık yerleştirin.
   1. Hızla distal mikrovasküler klip hala ederken yavaşça doku pad yerinde tutan çıkarmak.
      Not: Bu bazı geri tepme kan fibrinojen ve Trombin dolgu macunu reaktifler daha fazla harekete geçirmek sağlar. Sadece yeterince baskı belgili tanımlık yastık tutmak için ama tam olarak gemi değil engellemek için gereklidir.
   2. Yavaş yavaş kesi alanı altında akışını sağlayan doku pad baskısı hafifletmek. Şimdi, yavaşça ve nazikçe basınç proksimal mikrovasküler klipten ve tamamen kaldırmak.
   3. Not: gemi tam olarak patent olur emin olmak için doku pad yerleştirme ve kaldırma mikrovasküler klip hızlı bir şekilde doku pad üzerinden mühürleme CCA içeriye doğru önlemek için ortaya çıkması gereken. Ancak, bazı hafif basınç daha da pıhtı oluşumu ve sızdırmazlık yapılmasına izin vermek üzere doku yastık üzerine az miktarda kan sızıntısı varsa, yeniden yerleştirin. Kan sızıntısı önemli veya doku pad mühürleme gibi görünmüyor ise, kan kaybını önlemek ve belgili tanımlık kesme yalıtmak ve daha fazla kan dökülmesini önlemek için her iki CCA mikrovasküler klipleri değiştirmek için basınç korumak.
8. Doku pad gemi mühür değil durumunda, ikinci bir deneme, tabi merdiven 3.3 – 3.7.3 yapılabilir.
9. Bir kez gemi kilitlendi, eriyen 6-0 dikişler kullanarak yaranın dikiş. LDF kayıt ameliyat devam edildi LDF kafatasından kaldırın ve dikiş eriyen kullanarak 6-0 dikiş yarası.

4. ameliyat sonrası bakım

1. Hayvan (bir ısıtmalı raf/gıda 35 ° c veya ısıtmalı bir oda içinde yer alan) bir prewarmed kurtarma kafes içine koyun.
   Not: Araştırmacılar diğer sıcaklıklar ve süreler yerel uygulama göre kullanmayı tercih edebilirsiniz.
2. Prewarmed % 0,9 NaCl tuzlu SC 4 h sonrası işlem ve 2 x hemen sonrası işlemi, 200 µL ile tüm hayvanlar, her gün için 72 h sağlar.
   Not: Prewarmed % 0,9 NaCl liderliğindeki hayvan bir ilçedir. Daha fazla gerekli ise, daha fazla sıvı bir iyi sağlamak için uygulanabilir.
3. Kurtarma kafeste vıcık vıcık diyet granül, Kuru diyet granül, rehidrasyon jel ve yanında su ad libitum erişim jel gıda hayvanlar sınırsız erişim sağlar.
4. SC carprofen enjeksiyon, 24 saat sonrası işlemi yineleyin (bkz. Adım 2.3).
   Not: Tüm hayvanlar carprofen aynı doz aldı; herhangi bir nöroprotektif etkisi önemsiz olması muhtemeldir.
5. 48 h için düzenli aralıklarla, ameliyat sonrası fare yüz buruşturma karar daha fazla analjezi yönetmek için yardımcı olmak için ağrı düzeyleri değerlendirmek için¹⁷ Puanlama gerçekleştirin.
6. Hemen cerrahi ve ardından günlük yordamı uygulamadan önce hayvanlar tartın. Günlük gözlemler ve onların yiyecek ve su alımı ve klinik belirtiler izlemek için tam refah sayfaları gerçekleştirin.
7. 24 saat ve 48 saat sonrası işlemi fonksiyonel gözlemler taahhüt etmektedir. Fareler bir odak eksikliği ölçekte değerlendirmek. Değerlendirmek onların vücut simetrisi, zorunlu çember, yürüyüş, tırmanma, davranış, açık bacak asimetri ve bıyık dokunmatik yanıt^18,19,20çember 45 ° kılavuz.

5. manyetik rezonans görüntüleme ve görüntü işleme

1. Yapısal manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kullanarak lezyon birimi (LV) ölçmek.
   Not: histolojik triphenyltetrazolium klorür (TTC), boyama gibi alternatif yöntemler, daha önce kullanılan ve yapısal MRG veri için aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Ancak, bu yöntem yalnızca bir çalışma ve değil boyuna uç noktada kullanılabilir. Boyuna MRI tarama kullanarak bir çalışma için gerekli hayvan sayısını azaltır.
   1. MCAO, indüksiyon ardından 48 saat sonra fare ile isoflurane (%5 isoflurane 1 L/dak indüksiyon için O₂ ), % 1,5-2 isoflurane bakım için anestezi.
   2. Fare için MRG beşik transfer nefes oranını izlemek için solunum sensör yerleştirin ve tarama sırasında sıcaklık izlemek için Rektal sıcaklık probu implant. Yer 2-kanal fare beyinli RF sinyal için beyin üzerinde rulo almak ve yer bir 9,4 T Yatay beşiğinde tarayıcı taşıyordu.
      Not: Burada, bir ses bobini 72 mm iç çapında RF iletimi için kullanıldı.
   3. T2 ağırlıklı taramaları hızlı spin-eko sırası kullanılarak elde etmek. Tekrarlama zamanı (TR) 3.000 ms ve (TE) yankı vakti 40 Bayan kullanım 18 mm x 18 mm görüş alanı (FOV) olarak ayarlayın ve dilim 18 x 0.8 mm ve yaklaşık 10 dakika içinde üç sinyal ortalamalar 256 x 256 edinme matrisiyle elde edilir.
   4. Hızlı spin-eko sırası kullanılarak difüzyon tensör görüntüleri (DTI) edinin. Ayarla TR 1.730 MS, TE 35 MS, FOV için 20 mm x 20 mm ve 16 mm x 1 mm, iki sinyal ortalamalar, 14 difüzyon kodlama yönergeleri ve en fazla bdilimleri 128 x 128 edinme matrisiyle elde-1.024 s/mm²değeri.
   5. LV T2 ağırlıklı görüntülerde bir görüntü görüntü'yü kullanarak ve yazılım paketi ölçme ölçmek. Tedbir birlikte toplam lezyon cilt (MRI tarama sırasında ayarla) MRG dilim kalınlığı dikkate alarak hesaplamak için değerler harmanlama lesioned alan.
   6. Herhangi bir şişlik ve alan lezyon birimleri yüzdesi tam kontralateral ve Ipsilateral hemisferlerin ölçme sırasında göz önünde. Herhangi bir beyin lezyon birim olarak ölçmek için dolaylı bir yöntem kullanarak ödem nedeniyle şişlik için doğru daha önce açıklanan^21,22. Yalnızca korteks doku değil, frontal lob veya beyincik doku overcorrection önlemek için bir standart fare beyin atlas göre içeren dilimleri içerir.
2. Lezyon difüzyon parametrelerini ölçmek ve faiz çekirdek ve penumbra bölgelerinde elde edilir.
   1. Belirgin difüzyon katsayısı (ADC) ve kesirli anizotropi (FA) haritalar difüzyon tensör görüntüleri uygun MRI analiz yazılımı kullanarak oluşturun.
   2. T2 ağırlıklı görüntüleri uygun görüntü analiz yazılımı görüntülerin doğrusal bir kayıt sahip kullanarak DTI görüntülerle hizalayın. Kayıt, difüzyon ağırlıklı lezyon maskeleri (iskemik çekirdek) T2 ağırlıklı lezyon maskeleri (iskemik çekirdek ve penumbra) penumbra bölge tahmin etmek için çıkarma. Sonuç maskeleri (çekirdek ve penumbra) çekirdek ve penumbra içinde difüzyon parametrelerini ölçmek için ADC ve SK haritalar için geçerlidir.
   3. Ipsilateral çekirdek ve penumbra maskeleri beyin orta hat hakkında karşılaştırma kontralateral ADC ve SK değerlerini elde etmek için çevirmek.

Sonuçlar

24-31 g cerrahi, zaman arasında ağırlığında erkek 24 yetişkin C57BL/6 fareler toplam çalışmada kullanılmıştır. Orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) takip bir hayvan öldü ve bir cerrahi komplikasyonlar nedeniyle bırakıldı. Burada sunulan veri daha önce yayımlanmış bir işten yazarlar tarafından alınır. Bunlar MCAO sonuçlar¹¹gemi onarım etkisini göstermek için kullanılmıştır. Tüm verileri thr ortalama ± standart sapma ifade edilir. Verileri kullanarak D'Agostino-Pearson otobüs normallik test normallik için istatistiksel olarak değerlendirildi. Parametrik veri karşılaştırıldığında öğrencinin tkullanımı-(için iki anlamına gelir) testi ve tek yönlü ANOVA ile Sidak test (birden çok anlamına gelir). Non-parametrik veri Mann-Whitney U testi kullanılarak karşılaştırıldı. Parametrik veri değişkenliği Fkullanarak değerlendirildi-test, ve parametrik olmayan veri değişkenlik değerlendirildi Levene'nın testi kullanma.

Genellikle, MCAO yordamlar, occluding filaman CCA eklenir ve ECA ICA yerine ECA içine geçen bu filaman önlemek için bakmaksızın. ECA ligasyonu bir kaçınma ve analjezi eklenmesi gösterdi azaltılmış kilo kaybı doğru bir eğilim 48 h post-MCAO, veri için ise ECA ligasyonu yok analjezi ile kullanarak aynı MCAO kez aynı cerrah tarafından üstlenilen önceki çalışmalardan karşılaştırıldığında LV etkilenmemiş ortaya çıktı, Şekil 1bakınız.

Fareler reperfüzyon CCA gemi onarım veya CCA yaklaşım tipik ligasyonu ile ardından bir 60 dk MCAO kaynaklı iskemi uygulandı. Ve birleştirilmiş ve unligated tamir CCA şeması Şekil 2' de gösterilmiştir.

Lazer Doppler flowmetry kan akışı perfüzyon topraklarında MCA, MCAO, öncesi ve sonrası CCA gemi onarım onaylamak için kullanıldı. Şekil 3 o 5 dk filaman kaldırma, MCA beyin bölgesi önemli ölçüde arttı bölgesel beyin kan akımı (rCBF) takip gösterir. Perfüzyon perfüzyon CCA onarım için güven göre iskemik bölge bir artmış kan perfüzyon izin düşündüren CCA gemi onarım aşağıdaki gösterilen MCA bölge bir artış ile gemi onarım kadar devam edildi Daire, Willis yalnız.

T2 ağırlıklı MRG toplam LV belirlemek için kullanılan ve DTI taramaları çekirdek LV, 48 h MCAO sonra belirlemek için kullanılmıştır. Şekil 4A onarım ve ve birleştirilmiş yordam grupları arasında anlamlı bir fark toplam veya çekirdek LV gösterir. Ancak, her ikisi için de veri değişkenlik toplam ve LV, kullanarak Lavene'nın test için değerlendirildi gibi çekirdek parametrik olmayan veya F-test için parametrik veri, CCA onarım grup içinde önemli ölçüde azaldı. Toplam LV kortikal ve subcortical LV Şekil 4B' gösterildiği gibi ayrılmış. Kortikal bölümünü CCA onarım grubunda daha az değişken iken lezyon alt kortikal bölümünü iki yordam grupları arasında etkilenmedi.

Güç analizi tedavi grubu başına daha az sayıda hayvan CCA onarım karşı tipik CCA bakmaksızın yordamı kullanarak MCAO takip LV % 30 azalma göstermektedir, bkz. Tablo 1için gerekli olacağını belirtti. Bir güç 1-β 0.8 ve önem düzeyi α = 0,05 ve bir tahmin = LV varsayımsal kontrol ve test arasında % 30 azalma, gruplar güç analizi için kullanıldı. Ayrıca, bir eşit varyans gruplar arasında kabul edildi. Tablo 1 test için gerekli hayvan sayısını gösterir ve her iki tipik CCA bakmaksızın yöntemi kullanıldığında denetim grupları veya Güncellenme Zamanı CCA onarım yöntemi, burada açıklandığı gibi kullanılır. Test grup hayvanların varsayımsal bir tedavi grubu ve kontrol grubu gösterir Not bir varsayımsal Denetim Grup gösterir; Her iki grupta MCAO tabi.

Şekil 1: kombine analjezi tedavi ve ECA ligasyonu MCAO aşağıdaki sonuçlar üzerine ihmal. (A)vücut ağırlığı, pre-MCAO ağırlığının yüzde olarak gösterilen ilk 2 d MCAO her iki grup için takip azalmıştır. (Analjezi MCAO, hiçbir ECA ligasyonu ile tedavi edilen) ECA unligated grup MCAO ardından ikinci gün azaltılmış kilo kaybı doğru bir eğilim gösterdi. (B) Bu panel 48 saat sonra MCAO boyama standart triphenyltetrazolium klorür (TTC) tarafından ölçülen lezyon cilt (mm³) gösterir. Gösterilen veriler ortalama ± standart sapma vardır. ECA bakmaksızın: n = 17, ECA unligated: n = 10. Bu rakam Trotman-Lucas ve ark. değiştirildi ¹¹. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: Standart CCA yöntemi ve alternatif CCA gösterilen şematik tamir MCAO aşağıdaki yöntemi. (A)bu şema doğru CCA kalıcı ligasyonu içinde kaynaklanan CCA kesi, her iki tarafına uygulanan sigara eriyen dikişler kullanarak kalıcı olarak ve birleştirilmiş bir CCA gösteriyor. (B) bu şematik alternatif CCA onarım yöntemi gösterilmektedir. Bir küçük doku yastık fibrinojen ile kaplı ve Trombin dolgu macunu CCA hakkının tam perfüzyon izin vermek için mühürleme CCA kesi karşılamak için kullanılır. Bu rakam Trotman-Lucas ve ark. değiştirildi ¹¹. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: bölgesel beyin kan akımı (rCBF) parametreleri takip MCAO. MCAO sırasında MCAO filaman kaldırılması için her iki CCA bakmaksızın ve CCA tamir grupları (post-MCAO), rCBF göre ölçülen sonra rCBF 5 dk değişti. Bu panel rCBF veri hemen önce CCA gemi onarım (ön onarım) ve 5 min CCA onarım (sonrası onarım) takip gösterir. RCBF önemli artışlar 5 dk filaman kaldırıldıktan sonra (post-MCAO) her iki gruplar halinde gösterilir. RCBF ek bir artış CCA onarım grubunda CCA onarım (sonrası onarım) aşağıdaki gösterilir. RCBF hiçbir fark 5 dk post-MCAO ve ön onarım arasında gösterilir. Gösterilen veriler anahtar zaman puan, raporlama analiz zaman ders verilerinden ortalama ± standart sapma gibi burada konsantre. Bakmaksızın CCA: n = 10, CCA tamir: n = 10; P < 0,01, ***P < 0,001, ns: önemli olmayan. Bu rakam Trotman-Lucas ve ark. değiştirildi ¹¹. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: lezyon cilt analizi elde MRI tekniklerle. (A)Bu panel, 48 h MCAO, T2 ağırlıklı MR görüntüleri (Toplam LV) alınan toplam LV ve DTI inceden inceye gözden geçirmek ve analiz (çekirdek LV) çekirdek LV lezyon cilt (LV; mm³) gösterir. Temsilcisi görüntüler bir T2 inceden inceye gözden geçirmek dilim görüntüsü toplam lezyon birimden uygulanan DTI çekirdek lezyon cilt maskesi ile göstermektedir. Değişkenlik içindeki grupları için toplam LV azaltılmış anlamlı (P 0,015, CCA onarım =: n = 10, CCA bakmaksızın: n = 10, F-test) ve çekirdek LV (P 0.043, CCA onarım =: n = 9, CCA bakmaksızın: n 6, Lavene'nın test =), bir Fkullanarak değerlendirildi-parametrik veri veya Levene'nın testi için parametrik olmayan veriler için testi. (B) Bu panel LV 48 h MCAO, T2 ağırlıklı MRG görüntülerden alınan ve kortikal ve subcortical lezyon alanlara bölünmüş takip gösterir. CCA onarım veri değişkenlik azaltılacağını (P 0.03, F=-test) lezyon, ancak verileri üzerinde hiçbir etkisi kortikal bölümünü değişkenlik lezyon subcortical bölümünde gösterildi. CCA onarım: n = 10, CCA bakmaksızın: n = 10. Gösterilen veriler ortalama ± standart sapma vardır. ^# P < 0,05 (F-test), ^xP < 0,05 (Lavene'nın testi). Bu rakam Trotman-Lucas ve ark. değiştirildi ¹¹. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yaklaşım	Lezyon cilt (LV; mm3; ortalama ± SD)	Güç	Önem düzeyi	Anticiapted fark	Gerekli Grup boyutu
CCA bakmaksızın (geleneksel yaklaşım)	94.08 ± 53.79	0.8	0,05	% 30	n = 58
CCA tamir (yeni yaklaşım)	51.73 ± 22.78	0.8	0,05	% 30	n = 35

Tablo 1: geleneksel CCA ligasyonu alternatif ile karşılaştırarak temsilcisi güç analizi CCA onarım yöntemi burada açıkladı. Bu tablo LV bir kontrol grubu, geleneksel veya alternatif yaklaşım (yeni) ve (tahmin) bir test grubu arasında önemli bir fark tespit etmek için gerekli beklenen grup boyutunu hesaplamak için yapılan güç analizi gösteriyor. Grup boyutlandırır olarak tabloda gösterildiği gerekli bir güç 0,8 kabul edilir, 0,05 önem düzeyi uygulanır ve tahmin edilen test grubu bir % 30 fark gösteriyorsa LV karşılaştırıldığında kontrol grubu. Tablo (CCA bakmaksızın ve CCA tamir) hayvanların LV bir % 30 fark elde etmek için gerekli sayıda bir fark olup olmadığını belirlemek için her iki MCAO yaklaşım için sonuçlar gösterir Her iki yöntem için de bir eşit varyans testi ile kontrol grubu arasında kabul edilir. Bu rakam Trotman-Lucas ve ark. değiştirildi ¹¹.

Tartışmalar

Bu, klinik iskemik inme⁷takip olayların taklit etkilenen bölge için reperfüzyon Rodents geçici MCAO filaman indüksiyon en sık kullanılan deneysel kontur modeli, önemlidir. Rapor burada filaman kaynaklı geçici MCAO farelerde geleneksel yöntem için alternatif bir cerrahi yaklaşımdır. Alternatif bir yaklaşım, analjezi tedavi, ECA ligasyonu kaçınma ve CCA kesi onarım, MRI ve histolojik boyama yöntemleri¹¹kullanarak değerlendirirken bir azaltılmış LV değişkenlik sonuçlanır.

MCAO büyük ölçüde ikna etmek için geleneksel yaklaşımlar itimat transeksiyon, ya da en azından ligasyonu, fareler, içme davranışı ve vücut kilo kaybı MCAO¹⁴takip bir artış etkiler gösterilmiştir ECA nın. Burada, farelerde, ECA ligasyonu ve analjezi Ayrıca, kaçınma ile tanımlanan protokolü bir azalma vücut kilo kaybı MCAO lezyon cilt üzerinde hiçbir etkisi ile takip önerdi. Analjezi kullanımı önlenebilir veya en azından, deneysel sonuç olası karıştırıcı etkileri nedeniyle deneysel kontur çalışmaların çoğunda rapor değil. Ancak, analjezi tamamen kaçınarak değil her zaman haklı ve hayvan refah gereksinimlerini bilimsel hedefleri başarı ile dengelemek için bir ihtiyaç.

Hayvan boyutu, zorlanma ve filament varyasyonları, boyutu ve türü ek olarak serebrovasküler anatomi farklılıkları tüm kontur sonuçları^23,24etkilemek için önerilmektedir. Burada açıklanan alternatif yaklaşım inek üzerinde güven böylece, en azından kısmen, lezyon cilt hayvanlarda arasında görülen değişkenlik azaltarak reperfüzyon sırasında önler. İnek anatomi farelerde, son derece değişken özellikle içinde C57BL / deneysel kontur çalışmalarda sık sık kullanılan₆ zorlanma. C57BL/6 farelerin yüzde 90'ını iskemik hasar nedeniyle MCA bölge^13, dışında yapıların yetersiz perfüzyon hacmi üzerinde bir etkisi olabilir bir çeşitli posterior iletişim arter (PcomA) açıklık, nedeniyle eksik bir inek var. ²⁵. CCA farelerde, burada gösterildiği gibi tamir, üzerinden CCA iskemik alanına daha önce fareler¹⁵' te açıklandığı gibi kan yeniden kurulması sonuçlarında akışı. CCA kan akışında değil doğrudan ölçüldü rağmen temsilcisi veriler burada CCA tamiri reperfüzyon, arttığını göstermektedir. Ancak, proksimal ve distal onarım konuma bir nabız gibi atan ve tam duruma gövde boyunca döner CCA sağlanması gemi onarım takip kanla görselleştirmek cerrah mümkündür. Lazer Doppler flowmetry okumalar iskemik çevrenin birlikte bu görsel doğrulama başarılı onarım geminin onaylamak için kullanılabilir. Doku pad uygulamasını ve CCA gemi klipten kaldırılması arasındaki süreyi azaltmak belgili tanımlık zaman doku pad uygulamasını arasında olarak CCA, elde edilen açıklık üzerinde etkisi olabilir ve klip kaldırma-ecek önlemek belgili tanımlık doku yastık o kalarak CCA tarafında pposite. Her ne kadar teknik olarak zor, burada açıklandığı alternatif MCAO yordam bu farelerde MCAO cerrahi indüksiyon gerçekleştirmek için gereken ek herhangi bir beceri gerektirmez.

Geleneksel olarak yüksek değişkenlik sonucu önlemler ile ilişkili, deneysel kontur çalışmalar yeterince güçlü olmak bir eğilim olabilir. Ekonomik ve pratik endişeleri ile birlikte etik ve sosyal yardım gereksinimleri yeterince güçlü olmak çalışmalara katkıda bulunabilir. Sonuç değişkenliği azaltmak ve bu nedenle, bir deney grubu arasında daha tutarlı bir lezyon sonuçlar üreten, daha etkili güç hesaplamaları uygun şekilde desteklenmektedir varlık çalışmalar nihai amacı ile gerçekleştirilebilir.

Sonuç olarak, deneysel kontur takip lezyon cilt daha az değişkenlik farelerde, bu alternatif CCA onarım yordamı sonuçlanır ve ne zaman uygun bir tedavi etkisi test etmek için gerekli sağlar daha küçük deneysel grupları hesaplamalar güç kullanılır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm flexible single fibre optic probe	Moor Instruments, UK	P10d	Use with master probe code: VP10M200ST
7-0 silicone coated monofilament	Doccol, USA	701956PKRe	Item dependent on animal size and weight - use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article.
9.4T Preclinical MRI system	Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA	MY11520101	Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging
Animal monitoring and gating equipment	SA Instruments, Stony Brook, New York, USA	22124005	MRI compatible temperature and respiration monitoring
Bupivacaine	National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK	512345	Marcaine
C57BL/6 Mice	Charles River, Oxford, UK	B6JSIMA49D
Carprofen	Norbrook Laboratories	143658	Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection
Chlorhexidine 4% hand cleanser solution	VWR International Ltd, Lutterworth, UK	MOLN10008780	HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care
Cotton buds	National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK	213512	Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving.
Dissecting stereoscope	Carl Zeiss	OPMI99	Resident piece of equipment. Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable.
dissolvable 6-0 sutures	National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK	9544	Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981)
Donut probe holder	Moor Instruments, UK	PHDO	Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine.
dumont #5 forceps	World Precision Instruments, Hertfordshire, UK	500342
Fibrinogen and thrombin sealant	Baxter, Berkshire, UK	1502243	TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2 mL
Gel food	Datesand group, Manchester, UK	72065022	Diet Gel Recovery
Image display and measuring software package	3D Slicer	https://www.slicer.org/	Version 4.0
Image display and measuring software package	NIH, Maryland, USA	https://imagej.nih.gov/ij/index.html	NIH/ImageJ
LDF monitor	Moor Instruments, UK	moorVMS-LDF
micro vannas scissors	InterFocus Ltd, Linton, UK	15000-08	Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required.
Microvascular clip	World Precision Instruments, Hertfordshire, UK	15911	10 G Vessel Clip
microvascular clip holders	World Precision Instruments, Hertfordshire, UK	14189
MRI acquisition and analysis software	Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA	VnmrJ Version 4.2	Revision A
no. 15 scalpel	Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK	INS4678	Sterile No15 Scalpel - manufactuer number P305. Other suppliers are available.
Non-disolvable 6-0 suture	National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK	W529	Ethicon Mersilk Sutures
Ocular lubricant	National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK	847288	Lacrilube (5100G13)
Optical matching gel	Moor Instruments, UK	PMG
Pulse Oximetry Reader	Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA	MouseOx	MouseOx - rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor Use with mouse thigh sensor.
Rehydration gel	Datesand group, Manchester, UK	70015022	HydroGel
Small hair clippers	vetproductsuk.com	HS61	Contura Cordless trimmer/clippers
Sterile 0.9 % NaCl Solution	VWR International Ltd, Lutterworth, UK	LOCA3528286	SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS
sterile Petri dish	VWR International Ltd, Lutterworth, UK	5168021	50 mm sterile Petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50 mm diameter is required.
Topical tissue adhesive	World Precision Instruments, Hertfordshire, UK	503763	GLUture topical Tissue Adhesive
Waterproof superglue	Loctite	Loctite Superglue Precision Max	Available at most hardware shops.
White paper chip	Datesand group, Manchester, UK	CS1BPB	Pure-O'Cel