Oclusão de artéria Cerebral média, permitindo a reperfusão através de reparação de artéria carótida comum em ratos

Resumo

Oclusão de filamento intraluminal da artéria cerebral média é o modelo mais frequentemente utilizadas na vivo do acidente vascular cerebral experimental em roedores. Uma abordagem alternativa cirúrgica para permitir a reparação de artéria carótida comum é realizada aqui, que permite a reperfusão da artéria carótida comum e uma reperfusão completa no território da artéria cerebral média.

Resumo

O acidente vascular cerebral isquêmico é das principais causas de incapacidade a longo prazo adulta e morte em todo o mundo. Os tratamentos atuais disponíveis são limitados, com apenas ativador do plasminogênio tecidual (tPA) como um tratamento de droga aprovada para o alvo Derrames isquêmicos. A pesquisa atual em matéria de acidente vascular cerebral isquêmico centra-se na melhor compreensão da fisiopatologia do curso, para desenvolver e investigar novos alvos farmacêuticos. Modelos de curso experimental confiança são cruciais para a progressão de potenciais tratamentos. O modelo de oclusão (MCAO) da artéria cerebral média é clinicamente relevante e o mais frequentemente usado modelo cirúrgico de acidente vascular cerebral isquêmico em roedores. No entanto, os resultados deste modelo, tais como o volume da lesão, estão associados com altos níveis de variabilidade, particularmente em camundongos. O modelo alternativo de MCAO descrito aqui permite a reperfusão da artéria carótida comum (CCA) e a perfusão aumentada do território da artéria cerebral média (MCA), usando uma almofada de tecido com selante baseado em fibrinogênio para reparar o navio e o melhor bem-estar dos ratos, evitando a ligadura da artéria carótida externa (ECA). Isto reduz a dependência sobre o círculo de Willis, que é conhecido por ser anatomicamente altamente variável em camundongos. Dados representativos mostram que usar esta abordagem alternativa cirúrgica diminui a variabilidade em volumes de lesão entre a abordagem tradicional de MCAO e a abordagem alternativa descrita aqui.

Introdução

Das principais causas de derrame cerebral é isquemia focal no território da artéria cerebral média. Ativador de plasminogênio tecidual (tPA) é o tratamento farmacológico somente disponível com eficácia comprovada, apesar de numerosos testes clínicos direcionados para acidente vascular cerebral isquêmico^1,2. No entanto, devido a preocupações de segurança e uma janela terapêutica estreita (< 4,5 h), apenas ~ 15% de todos os pacientes com AVC são elegíveis para receber o tPA, e as taxas de recanalização podem ser < 50%^3,4.

Reprodutíveis e clinicamente relevantes de modelos animais de AVC são considerados essenciais para informar o desenvolvimento de tratamentos terapêuticos de tempos novos e potenciais. No entanto, devido a preocupações sobre a consistência e a variabilidade nos resultados com modelos animais, continua a ser importante refinar os modelos na vivo existente para melhorar a tradução de estudos pré-clínicos para a clínica. A falta de tradução da eficácia pré-clínica experimental de tratamentos potenciais para uso clínico é uma preocupação constante para o curso de pesquisa⁵. Razões do fracasso da tradução são susceptíveis de ser múltiplo e podem estar relacionadas com, por exemplo, o delineamento experimental, atrasos de tratamento, heterogeneidade clínica de acidente vascular cerebral, e as limitações dos modelos animais utilizados⁶. Um desafio fundamental para a investigação de acidente vascular cerebral continua a ser o desenvolvimento de tratamentos seguros e eficazes.

Oclusão da artéria cerebral média (MCAO) pela inserção de filamento intraluminal é o mais frequentemente usadas em vivo modelo roedor do curso experimental. Esse modelo permite que a restauração do fluxo sanguíneo após uma indução de isquemia, imitando os eventos que ocorrem no curso humano⁷. No entanto, em particular nos ratos, volumes de lesão heterogênea com variados desvios-padrão ocorrerem apesar de definidos protocolos cirúrgicos são aplicadas^8,9,10. É comum ver uma distribuição bimodal de pequeno striatal e lesão striato-cortical grandes volumes¹¹. Para induzir isquemia, o filamento é normalmente inserido através de uma incisão do CCA ou ECA que então permanecem permanentemente ligados¹². A ligadura permanente do CCA impede o restabelecimento do fluxo sanguíneo na artéria carótida interna (ACI) e, posteriormente, o território MCA. Isso faz com que a reperfusão ser dependente do suprimento colateral dentro do círculo de Willis (vaca). A estrutura de vaca tem variabilidade anatômica entre animais individuais, particularmente em C57BL/6 ratos-a cepa normalmente usada na vivo derrame pesquisa¹³. Um método alternativo, da inserção de filamento através do ECA, que permite a perfusão contínua através do CCA, mas compromissos deste método o suprimento arterial para o território do TCE, que mostrou, em ratos, para ter um efeito prejudicial sobre do animal bem-estar¹⁴.

A dependência da vaca para suprimento colateral e reperfusão no modelo MCAO estabelecido, em parte, explica a variabilidade de volume de lesão após a oclusão. Descrevemos um procedimento cirúrgico murino alternativo onde ligadura ECA é evitada e a incisão de CCA é reparada, permitindo assim a reperfusão através do CCA, independente da vaca. O reparo da incisão CCA tem demonstrado anteriormente em ratos para resultar em uma bem sucedida reperfusão através do CCA¹⁵. Podemos ter aplicado essa abordagem com êxito em ratos¹¹ e apresente-se aqui o protocolo que resulta em uma variabilidade reduzida no volume da lesão, as principais medidas utilizadas em estudos experimentais de AVC.

Neste protocolo, demonstramos como empreender MCAO através da inserção de filamentos de navio CCA seguida de reparação de embarcação CCA, que envolve uma aplicação de selante e almofada de tecido para permitir a reperfusão.

Protocolo

Este protocolo e os dados relatados foram conduzidos de acordo com a lei de UK animais (procedimentos científicos), 1986 (licença do projecto 60/4315) e após a aprovação ética institucional. Todas as experiências são comunicadas em conformidade com a pesquisa Animal: relato de In Vivo de diretrizes de experimentos (chegada)¹⁶.

1. preparação

1. Familiarizar o adulto masculino C57BL/6 ratos para cuidados pós-operatórios (por exemplo, ambiente, roupa de cama, alimentos de recuperação) pelo menos 48 h antes da cirurgia.
   Nota: Post-MCAO animais muitas vezes têm dificuldade em comer e beber após a cirurgia.
   1. Para evitar a perda de excesso de peso após a cirurgia, aclimatar os animais para qualquer dieta post-MCAO por, por exemplo, colocação de reidratação gel, gel de comida e pelotas de dieta normal/úmido embebido directamente para o chão da gaiola.
   2. Mude a roupa de cama de gaiola para cama no pós-operatório, tais como chip de papel branco.
2. Antes de iniciar a instalação cirúrgica ou procedimentos é necessário esterilize todos os instrumentos cirúrgicos.
   1. Para fazer isso, esterilizando as ferramentas (com um mínimo de 121 ° C, 15 psi, para 15 min) ou através da utilização de óxido de etileno (seguindo as corretas instruções do fabricante, para 8 – 10 h).
   2. Desinfete todas as superfícies antes da criação do procedimento. Cubra as superfícies com cortinas cirúrgicas estéril ou folha autoclavada para itens que exigem manipulação durante a cirurgia. Utilize técnica asséptica para a duração do procedimento.
      Nota: A folha autoclavada pode ser usada para cobrir os instrumentos ou equipamentos que precisam ser realizadas durante a cirurgia. Usando técnicas e luvas estéreis, a folha pode ser aplicada e, em seguida, o item pode ser colocado no campo estéril. Em seguida, uma mudança de luva estéril será necessária.

2. cirurgia de oclusão de artéria Cerebral média

1. Use C57BL/6 ratos machos adultos pesando 24 – 31 g no momento da cirurgia. Induzi anestesia usando 5% de isoflurano em 2 L/min de O₂, em uma câmara de anestesia de plástico vermelho.
2. Após a indução, reduzir o isoflurano manter uma profundidade de anestesia adequada para a cirurgia (e.g., 1.5-2% em 70% N₂O₂30% O₂), entregue por máscara facial combinada com um sistema de limpador para abaixar do cirurgião exposição ao isoflurano.
   Nota: o óxido nitroso (N₂O₂) pode ser usado em combinação com o oxigênio (O₂) para reduzir a quantidade necessária de isoflurano para uma profundidade de anestesia adequada.
3. Administrar analgesia sistêmica operatório [carprofeno, 10 mg/kg subcutâneo (SC)] e anestesia local para a incisão do site (bupivacaína, SC. 2 mg/kg, diluídos 01:10 em soro fisiológico a 0,9%) peri-operatório.
4. Administre fluidos por injeções intraperitoneal (ip.) de 200 µ l de solução de NaCl 0,9% escaldada estéril pré-operatório.
5. Raspar o pelo do direito temporal e região ventral do pescoço usando tesoura pequena para expor a pele. Desinfete a área cirúrgica da pele, usando uma solução de clorexidina 5% por 3 min. aplicar lubrificante ocular em ambos os olhos, para evitar que sequem durante a cirurgia.
   Nota: Se necessário, para leituras de oximetria de pulso para monitor saturation do oxigênio do sangue, frequência cardíaca e ritmo respiratório, use creme depilatório para limpar a pata traseira do cabelo. Aplicar o creme usando algodão limpo os botões e, após a remoção do cabelo, lave a área com a solução de clorexidina diluída. Execute esta etapa em uma área pré-operatório para minimizar o risco de contaminação do campo cirúrgico estéril de pele solta. Pesquisadores podem preferir usar outras preparações do sítio cirúrgico de acordo com a prática local.
6. Transferir o mouse para a área cirúrgica e coloque-o na posição de bruços em uma esteira de calor homeotérmicos coberta por um pano estéril. Manter a anestesia através de um cone de nariz. Inserir uma sonda rectal para monitorar a temperatura do corpo do rato e mantê-lo a 37,0 ± 0,6 ° C.
   1. Antes de qualquer incisões cirúrgicas, verificar o reflexo de retirada de pata traseiras e piscar reflexo para confirmar a profundidade de anestesia.
7. Conecte uma ponta de prova do laser Doppler flowmetry (LDF) para gravar o fluxo de sangue para o território MCA.
   1. Usando um estereoscópio de dissecação, faça uma incisão de 1 cm de < no ponto médio entre o olho direito e ouvido sobre a pele exposta temporal usando um bisturi n º 15. Sem rodeios, disse o tecido subjacente, cobrindo o crânio, delicadamente raspando isso longe do osso e secar a superfície com cotonetes estéreis.
      Nota: Tenha cuidado para não danificar o músculo temporalis.
   2. Segure a 0,7 mm, flexível única sonda de fibra óptica anexada ao monitor LDF, corte sua extremidade usando um bisturi afiado para ganhar uma borda lisa, empurre isso através da porta-sonda em forma de donut e coloque uma pequena quantidade de gel correspondente óptico na extremidade da fibra.
   3. Coloque uma pequena quantidade de cola super adesiva impermeável ao redor da borda inferior do titular da sonda; permitir que isto parcialmente seco e se tornar brega.
   4. Secar o crânio acima do osso temporal e coloque uma pequena quantidade de cola de tecido tópica em um círculo para o osso, apenas o suficiente para a porta-sonda.
   5. Coloque o suporte da sonda, com a sonda de fibra óptica já em vigor, nesta área (lateral de 6 mm e 2 mm distal do bregma).
   6. Dê tempo para que a cola secar; uma vez seco e anexado, começa a gravar os dados LDF.
8. Vire suavemente o animal para uma posição supina, tendo o cuidado de apoiar a sonda Doppler laser e evitar o seu destacamento. Fita suavemente as duas dianteiras para baixo com esparadrapo microporoso, deslizando um par de algodão gomos (ou algo semelhante, tais como fórceps fechado) sob o pescoço para levantar a área e criar tensão. Cobrir o mouse com um pano estéril para manter a cobertura asséptica.
9. Iniciar a dissecação e exposição do CCA.
   1. Fazer uma incisão de 1,5 cm no pescoço ventral exposto usando uma lâmina de bisturi n º 15.
   2. Usando técnicas de dissecção romba suave, suavemente retrai as glândulas salivares para os lados, expondo a traqueia.
   3. Usando a dissecção romba, disse o CCA livre do tecido circundante e do nervo vagal.
      Nota: Evite tocar o nervo vagal diretamente, por qualquer dano ao nervo vagal pode afectar a mobilidade, alimentação e respiração.
10. Passe duas seções de pequeno (2 cm) de uma não-solúvel 6-0 sutura abaixo o CCA, dorsal para o vaso e ventral do nervo vagal. Desenhe uma gravata de seda mais perto para o cirurgião e amarrá-lo firmemente em torno da CCA (empate proximal). Vagamente amarre o laço de seda segundo (empate distal) em direção a bifurcação da ICA/Tribunal de contas.
11. Para começar, para isolar uma seção do CCA, aplica um clipe microvascular logo acima o empate distal mas não obstruir a bifurcação. Usando micro Tesoura Vannas, faça um pequeno furo para o CCA.
    Nota: O Tribunal de contas deve permanecer patente em todos os momentos. A incisão de CCA deve ser não mais do que 40% da largura da embarcação e numa posição ventral facilmente acessível; Este desempenhará um papel importante no navio reparo fase post-MCAO.
12. Insira um monofilamento de silicone revestido de 7-0 o CCA, avançando para o clipe microvascular.
    Nota: O tamanho do filamento deve ser estabelecido com base no peso do rato antes da cirurgia; Consulte as orientações do fabricante.
    1. Aperte a gravata distal, suficiente para fixar o filamento no lugar sem danificá-lo. Remova o clipe microvascular usando suportes de clip.
       Nota: Não há perda de sangue deve ser vista neste momento. Se há um refluxo de sangue, segurando o filamento a gravata não é suficientemente apertada.
13. Avance o filamento para o ICA.
    1. Certifique-se o filamento permanece dentro do ICA e não passa na artéria pterigopalatina (PPA). Fazer isso pouco levantando e puxando o CCA, usando um dos laços de seda, para o lado externo do corpo do animal, e orientar o filamento para dobrar passado a frente internamente para abertura do PPA.
       Nota: Uma vez avançou para a origem do ramo MCA, uma queda no fluxo sanguíneo relativo ao território fornecido será visível nos valores LDF; Isto confirma o posicionamento do filamento.
14. Segura o filamento no lugar com a gravata de seda distal, amarrando esta mais apertado. Deixá-lo no lugar durante a período de tempo de oclusão.
    Nota: Dependente em protocolos individuais, o animal pode ser movido para uma gaiola de recuperação, a seguir ferida sutura, para recuperar, ou permanecem sob anestesia, para a duração do período de oclusão. Neste último caso, certifique-se de que ferida é impedida de secar usando escaldadas 0,9% NaCl soro fisiológico estéril.

3. pós-oclusão

1. No final do período de MCAO, recue imediatamente o filamento até a cabeça de filamento branco é claramente visível.
2. Em seguida, afrouxe o CCA distal amarrar o suficiente para remover o filamento cabeça maior parte do caminho fora do navio.
   Nota: O filamento pode ser totalmente removido neste ponto se o cirurgião está confiante com velocidade para amarrar o laço distal para evitar a perda de sangue.
3. Coloque um clip microvascular na posição horizontal em direção a bifurcação de CCA junto a gravata distal. Afrouxar a gravata distal e remova o filamento totalmente. Adicione outro clip microvascular abaixo a gravata CCA proximal em direção ao cirurgião.
   Nota: Certifique-se que o navio está longe o suficiente para as pontas da pinça para evitar qualquer deslizamento. A colocação dos grampos é essencial garantir removedores clip fácil acesso durante as etapas posteriores. Os clipes podem ser usados para ajudar a levantar o navio para permitir um melhor apuramento e colocação do patch do tecido, colocar os clipes horizontalmente os músculos circundantes.
4. Retire os dois laços de seda usando Dumont #5 pinças ou micro Vannas para cuidadosamente e secar a área usando cotonetes estéreis.
   Nota: Tenha cuidado para não cortar através de/para o recipiente.
5. Em uma placa de Petri estéril, adicione o fibrinogênio e trombina selante soluções 1 e 2 (veja a Tabela de materiais), garantindo as duas substâncias ficar separadas, prontos para a mistura mais tarde.
   Nota: Só muito pequenos volumes dos agentes são necessário (< 0,25 mL cada). Mantendo as soluções separadas impede uma reação prematura entre os dois constituintes. Certifique-se de que PAC é substituída da mesma forma como ele foi removido para evitar contaminação cruzada de duas seringas, que causaria o agente reagir e situado no interior da seringa. Antes da utilização, armazenar as soluções a-20 ° C. Quando for necessário para a primeira cirurgia, descongele o selante à temperatura ambiente. Não volte a congelar o selante; Ele deve permanecer em temperatura ambiente e pode ser armazenado desta maneira. A seringa pode ser usada em cirurgias múltiplas, tornando-o custo-benefício; no entanto, recomendamos que não utilize o mesmo frasco por mais de 1 semana para evitar a contaminação.
6. Use dissecção romba ao longo do músculo com fórceps Dumont não 5 e micro Vannas para obter uma fatia fina ventral do músculo esternocleidomastoideo para usar para a almofada de tecido, garantindo a fatia é não mais de 1 mm de espessura e corre ao longo das fibras superiores do músculo.
   Nota: Não corte através de/do outro lado do músculo, como isto prejudicará significativamente sua função. O tecido deve ser grande o suficiente para cobrir a incisão de CCA confortavelmente.
7. Usando pinças de Dumont #5, levar a almofada de tecido e misturar o tecido uniformemente em todo o fibrinogênio e a trombina duas soluções de selante, formando um canal entre os dois reagentes. Coagulação ocorrerá rapidamente; tão logo começa a coagulação, retire o forro de tecido para a incisão do CCA. Coloque a almofada de tecido liso para baixo com uma pressão firme médio e pinça aberta.
   1. Rapidamente Retire o clip microvascular distal enquanto ainda segurando delicadamente a almofada de tecido no lugar.
      Nota: Isto permite um refluxo de sangue para ativar ainda mais os reagentes de selante de fibrinogênio e trombina. Apenas o suficiente pressão é necessário para prender a almofada no lugar, mas não para bloquear totalmente o navio.
   2. Lentamente, aliviar a pressão da almofada tecido, permitindo que o sangue flua no âmbito da área de incisão. Agora, devagar e suavemente, liberar a pressão do clip microvascular proximal e remover totalmente.
   3. Nota: Para assegurar que o navio se torna totalmente patente, o posicionamento da almofada do tecido e a remoção dos grampos microvasculares devem ocorrer rapidamente para evitar que a almofada de tecido de selagem no interior do CCA. No entanto, se houver uma pequena quantidade de vazamento de sangue, re-coloca uma leve pressão sobre a placa de tecido para permitir mais tempo para a formação de coágulos e selagem para ocorrer. Se o vazamento de sangue é substancial ou a almofada de tecido não parece ser da selagem, manter a pressão para evitar a perda de sangue e substituir os dois clipes microvasculares CCA para isolar a incisão e evitar mais perda de sangue.
8. No caso da almofada de tecido não vedação ao navio, pode ser feita uma segunda tentativa, seguindo passos 3.3 – 3.7.3.
9. Uma vez que o navio está selado, suture a ferida usando suturas dissolvable 6-0. Se a gravação LDF foi continuada em toda cirurgia, remover o LDF do crânio e sutura ferida usando dissolvable sutura de 6-0.

4. no pós-operatório cuidados

1. Coloque o animal em uma gaiola de recuperação escaldadas (situada em uma prateleira/esteira aquecida a 35 ° C, ou dentro de uma câmara aquecida).
   Nota: Os investigadores podem preferir usar outras temperaturas e durações de acordo com a prática local.
2. Fornece todos os animais com 200 µ l de escaldadas 0,9% NaCl salina SC. imediatamente pós operação, no pós-operação 4 h e 2 x diariamente por 72 h.
   Nota: A administração de escaldadas 0,9% NaCl é animal levado. Se mais é necessário, mais fluidos podem ser administrados para garantir uma boa recuperação.
3. A gaiola de recuperação, dar o acesso irrestrito de animais para dieta empapado de Pelotas, pelotas de dieta seca, gel de hidratação e alimento do gel, ao lado de ad libitum acesso à água.
4. Repetir a injecção de carprofeno SC. no pós operação 24 h (ver passo 2.3).
   Nota: Todos os animais receberam a mesma dose de carprofeno; qualquer efeito neuroprotetor é provável que seja insignificante.
5. Em intervalos regulares de 48 h, execute careta pós-operatório rato marcando¹⁷ para avaliar os níveis de dor para auxiliar a decisão de administrar mais analgesia.
6. Pese os animais imediatamente antes da cirurgia e então diariamente, seguindo o procedimento. Realize observações diárias e folhas de bem-estar completo para monitorar seus alimentos e ingestão de água e sinais clínicos.
7. Realizar observações funcionais em 24 h e 48 h após operação. Avalie os ratos em uma escala de déficit focal. Avalie sua simetria do corpo, circulando obrigatória, marcha, grade de 45°, escalada, circulando o comportamento, assimetria dos membros dianteiros e whisker toque resposta^18,19,20.

5. imagens de ressonância magnética e processamento de imagem

1. Medir o volume de lesão (LV) usando ressonância magnética estrutural (MRI).
   Nota: Métodos alternativos, tais como coloração histológica com cloreto de triphenyltetrazolium (TTC), têm sido utilizados anteriormente e correlacionam dados estruturais de MRI. No entanto, este método só pode ser usado no ponto de extremidade de um estudo e não longitudinalmente. Usando a varredura de MRI longitudinal irá reduzir o número de animais necessários para um estudo.
   1. Após 48 h, seguindo a indução do MCAO, anestesia o mouse com isoflurano (5% de isoflurano em 1 L/min de O₂ por indução), isoflurano 1,5-2% para manutenção.
   2. Transferir o mouse para o berço de MRI, coloque-o sobre o sensor de respiração para monitorar sua taxa de respiração e implante a sonda de temperatura retal para monitorar a temperatura durante a digitalização. Lugar do cérebro de rato 2-canal RF receber bobina sobre o cérebro para um sinal e lugar o berço em um 9,4 T horizontal furo varredor.
      Nota: Aqui, uma bobina de volume com um diâmetro interno de 72 milímetros foi usada para a transmissão do RF.
   3. T2-weighted digitalizações usando uma sequência spin-eco rápido de adquirir. Definir o tempo de repetição (TR) para 3.000 ms e o tempo de eco (TE) de 40 MS. uso 18 x 18 milímetros como o campo de visão (FOV) e obter uma matriz de 256 x 256 aquisição com fatias de 18 x 0,8 mm e três médias de sinal em cerca de 10 min.
   4. Adquira imagens de tensor de difusão (DTI) usando uma sequência spin-eco rápido. Definir a TR para ms 1.730, SMT de 35 ms, o FOV de 20 mm x 20 mm e obter uma matriz de 128x128 aquisição com fatias de sinal as médias 16 mm x 1, 2, 14 direcções de codificação de difusão e um máximo b-valor de 1.024 s/mm².
   5. Medir o LV nas imagens ponderadas em T2 usando um display de imagem e pacote de software de medição. Meça a área lesada, agrupando os valores para calcular o volume total da lesão, tendo em conta a espessura da fatia de MRI (definida durante a varredura de MRI).
   6. Leve em conta qualquer inchaço e a porcentagem de volumes de lesão de área enquanto o hemisfério ipsilateral e contralateral completa de medição. Correto para qualquer cérebro inchaço devido ao edema, usando um método indireto para medir o volume de lesão como descrito anteriormente^21,22. Inclua apenas as fatias que contêm tecido do córtex e não lobo frontal ou tecido de cerebelo de acordo com um atlas do cérebro de rato padrão para evitar sobrecorreção.
2. Medir os parâmetros de difusão de lesão e obter os núcleo e a penumbra de regiões de interesse.
   1. Gera o coeficiente de difusão aparente (ADC) e mapas de anisotropia fracionária (FA) a partir das imagens de tensor de difusão usando software de análise de MRI apropriado.
   2. Alinhe as imagens DTI com as imagens ponderadas em T2, usando software de análise de imagem apropriado capaz de realizar um registro linear de imagens. Após o registo, subtrai as máscaras de lesão de difusão-tornado mais pesado (núcleo isquêmica) as máscaras de lesão T2 ponderado (núcleo isquêmico e penumbra) para estimar a região de penumbra. Aplicam-se as máscaras resultantes (núcleo e penumbra) para os mapas de ADC e FA de quantificar os parâmetros de difusão dentro do núcleo e penumbra.
   3. Traduza o núcleo ipsilateral e as máscaras de penumbra sobre a linha média do cérebro a fim de obter valores de ADC e FA contralaterais para comparação.

Resultados

Um total de 24 camundongos C57BL/6 machos adultos, pesando entre 24 – 31 g no momento da cirurgia, foram utilizados no estudo. Um animal morreu após a oclusão da artéria cerebral média (MCAO) e um foi excluído devido a complicações cirúrgicas. Os dados aqui apresentados são tomados a partir de um trabalho previamente publicado pelos autores. Estes foram usados para ilustrar o efeito da reparação do navio na MCAO resultados¹¹. Todos os dados são expressos como thr média ± desvio-padrão. Os dados foram avaliados estatisticamente para normalidade através do teste de normalidade "omnibus" D'Agostino-Pearson. Os dados paramétricos foram comparados usando o Student t-teste (para duas médias) e One-Way ANOVA com o teste de Sidak (vários meios). Dados não-paramétricos foram comparados através do teste de Mann-Whitney U. A variabilidade dos dados paramétricos foi avaliada por meio de um F-teste, e variabilidade de dados não-paramétricos foi avaliada utilizando o teste de Levene.

Normalmente, em procedimentos MCAO, o filamento de oclusão é inserido o CCA e o TCE é ligado para impedir este filamento transformasse em TCE, ao invés de ICA. Uma evasão de ligadura do TCE e a adição de analgesia mostraram uma tendência de perda de peso reduzido em 48 h post-MCAO, quando comparados com dados de estudos anteriores realizados pelo mesmo cirurgião para a mesma hora MCAO usando ligadura de TCE com nenhuma analgesia, Considerando que o LV apareceu não afetado, veja a Figura 1.

Os ratos foram submetidos a uma isquemia induzida por MCAO 60 min, seguida de reperfusão com reparo de navio CCA ou com a ligadura típica da abordagem CCA. Um esquema do CCA reparado ligado e unligated é mostrado na Figura 2.

Laser Doppler flowmetry foi usado para confirmar a fluxo perfusão sanguínea no território da MCA no MCAO, antes e após o reparo de navio do CCA. A Figura 3 demonstra a 5 min após a remoção do filamento, o fluxo sanguíneo cerebral regional (rCBF) aumentada significativamente na região do cérebro do MCA. A perfusão foi mantida até o conserto do navio, com um aumento da perfusão ao território MCA mostrado após o reparo de navio CCA, sugerindo que a reparação do CCA permitiu uma perfusão sanguínea aumentada ao território isquêmico comparado a confiança na o círculo de Willis sozinho.

T2-weighted MRI foi usada para determinar o total LV e DTI exames foram usados para determinar o núcleo LV, 48 h após o MCAO. A figura 4A não mostra nenhuma diferença significativa no LV total ou núcleo entre os grupos de procedimento ligados e reparação. No entanto, a variabilidade de dados para ambos total e LV, do núcleo como avaliada utilizando o teste do Lavene para não-paramétricos ou o F-teste para dados paramétricos, foi significativamente reduzida no seio do grupo de reparação do CCA. O LV total foi dividido em LV cortical e subcortical, conforme mostrado na Figura 4B. A porção cortical foi significativamente menos variável no grupo de reparação CCA, Considerando que a porção cortical secundário da lesão foi afetada entre os dois grupos processuais.

Uma análise do poder indicou que menos animais por grupo de tratamento seria necessários demonstrar uma redução de 30% no LV MCAO usando CCA reparação contra o procedimento típico de CCA-ligado a seguir, consulte a tabela 1. Uma suposição de energia 1-β = 0,8 e nível de significância α = 0,05 e uma previsão de redução de 30% no LV entre o hipotético controle e teste grupos foram utilizados para a análise do poder. Além disso, supunha-se uma variância igual entre os grupos. A tabela 1 mostra o número de animais necessários para o teste e grupos de controle quando é usado também o método típico CCA-ligado ou o método de reparo CCA atualizado, conforme descrito aqui, é usado. Observe que o grupo de teste refere-se a um hipotético grupo tratado dos animais e grupo controle refere-se a um grupo de controle hipotético; ambos os grupos que passam por MCAO.

Figura 1: combinado de tratamento de analgesia e a omissão de ligadura do Tribunal de contas sobre os resultados a seguir MCAO. (A) peso de corpo, indicado em percentagem de peso pré-MCAO, diminuiu o primeiro d 2 o MCAO para ambos os grupos a seguir. O grupo de ECA-unligated (analgesia-tratados com nenhuma ligadura de ECA no MCAO) mostrou uma tendência de perda de peso reduzido no segundo dia após a MCAO. (B), este painel mostra o volume de lesão (mm³) medido pelo cloreto de triphenyltetrazolium padrão (TTC) coloração 48 h após o MCAO. Os dados apresentados são o média ± desvio-padrão. ECA ligado: n = 17, ECA unligated: n = 10. Esta figura foi modificada de Trotman-Lucas et al . ¹¹. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: diagrama esquemático mostrando o método padrão do CCA e o CCA alternativo reparar método seguindo MCAO. (A) este esquema retrata uma CCA permanentemente ligado usando suturas não-solúvel, aplicadas a cada lado da incisão CCA, originando a ligadura permanente do CCA certo. (B) este esquema retrata o método alternativo de reparação CCA. Uma almofada pequena tecido revestido com fibrinogênio e trombina vedador é usado para cobrir a incisão de CCA, lacrá-lo para permitir que a perfusão completa do direito CCA. Esta figura foi modificada de Trotman-Lucas et al . ¹¹. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: parâmetros de fluxo (rCBF) sanguíneo cerebral Regional seguindo MCAO. O rCBF mudou 5 min após a remoção do filamento MCAO para ambos os CCA-ligados e CCA-reparado grupos (post-MCAO), em relação a rCBF medido durante MCAO. Este painel mostra os dados do rCBF imediatamente antes do reparo de navio do CCA (pre-reparação) e 5 min após o reparo do CCA (pós-reparo). Aumento significativo da rCBF é mostrado 5 min após a remoção do filamento (post-MCAO) em ambos os grupos. Aumento do rCBF adicional é mostrado após o reparo do CCA (pós-reparo) no grupo de reparação do CCA. Nenhuma diferença no rCBF é mostrada entre 5 min post-MCAO e pre-reparação. Os dados mostrados são condensados a partir dos dados de tempo-curso analisados relatórios pontos chave tempo, aqui como o média ± desvio-padrão. CCA ligado: n = 10, CCA reparada: n = 10; P < 0,01, * * *P < 0,001, ns: não significativo. Esta figura foi modificada de Trotman-Lucas et al . ¹¹. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: análise do volume lesão obtidos por técnicas de MRI. (A) este painel mostra o volume de lesão (LV; mm³) a 48 h após MCAO, o LV total retirado em imagens de T2-weighted MRI (LV Total) e o núcleo LV tiradas do DTI varreduras e análise (núcleo LV). Representante imagens mostram o volume total de lesão de uma imagem de fatia de varredura T2 com a DTI núcleo lesão volume máscara aplicada. A variabilidade dentro dos grupos foi significativamente reduzida para ambos o LV total (P = 0.015, reparação CCA: n = 10, CCA ligado: n = 10, F-teste) e o núcleo LV (P = 0,043, reparação CCA: n = 9, CCA ligado: n = 6, teste do Lavene), avaliada por meio de um F-teste para dados paramétricos ou teste de Levene para dados não-paramétricos. (B) este painel mostra o LV a 48 h após MCAO, tomadas a partir de imagens de T2-weighted MRI e dividido em áreas de lesão cortical e subcortical. A reparação do CCA reduziu significativamente a variabilidade dos dados (P = 0,03, F-test) na porção cortical da lesão, mas nenhum efeito sobre os dados, mostrou-se variabilidade na porção subcortical da lesão. Reparação CCA: n = 10, CCA ligado: n = 10. Os dados apresentados são o média ± desvio-padrão. ^# P < 0,05 (F-test), ^xP < 0,05 (teste do Lavene). Esta figura foi modificada de Trotman-Lucas et al . ¹¹. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Abordagem	Volume de lesão (LV, mm3; média ± d.p.)	Poder	Nível de significância	Diferença de anticiapted	Tamanho do grupo exigido
CCA ligados (abordagem tradicional)	94.08 ± 53.79	0.8	0.05	30%	n = 58
CCA reparada (nova abordagem)	51.73 ± 22,78	0.8	0.05	30%	n = 35

Tabela 1: análise do poder representativo comparando ligadura de CCA tradicional com a alternativa CCA reparar método explicado aqui. Esta tabela mostra a análise de poder realizada para calcular o tamanho de grupo antecipado necessário para detectar uma diferença significativa entre um grupo de controle, (nova) abordagem tradicional ou alternativa e um grupo de teste (previsto) em LV. A tabela mostra o grupo tamanhos como necessário se presume-se uma potência de 0,8, um nível de significância de 0,05 é aplicado, e se o grupo de teste previsto mostra uma diferença de 30% no LV comparados ao grupo controle. A tabela mostra os resultados para ambas as abordagens MCAO (CCA-ligados e o CCA-reparada) para determinar se há uma diferença no número de animais necessários para obter uma diferença de 30% na LV. Para ambos os métodos, presume-se uma variância igual entre o teste e grupo controle. Esta figura foi modificada de Trotman-Lucas et al . ¹¹.

Discussão

Indução de filamento de transiente MCAO em roedores é o mais utilizado modelo de curso experimental, pois permite reperfusão na área afetada, imitando a ocorrência de eventos após acidente vascular cerebral isquêmico clínica⁷. Relatado aqui é uma abordagem cirúrgica alternativa ao método tradicional de induzida por filamento MCAO transitória em ratos. A abordagem alternativa, envolvendo tratamento de analgesia, evasão de ligadura do TCE e reparação de incisão de CCA, resulta em uma reduzida variabilidade de LV quando avaliados usando MRI e métodos de coloração histológica¹¹.

Abordagens tradicionais para induzir MCAO largamente contam sobre a transecção, ou pelo menos a ligadura, do TCE, que mostrou, em ratos, afetam o comportamento de beber e um aumento na perda de peso de corpo seguindo o MCAO¹⁴. O protocolo definido aqui, em ratos, com a vacância de ligadura da ECA e adição de analgesia, sugeriu uma redução na perda de peso de corpo seguindo a MCAO com nenhum efeito sobre o volume da lesão. O uso de analgesia é evitado, ou pelo menos não relatado, na maioria dos estudos experimentais de AVC, devido a possíveis efeitos de confusão sobre os resultados experimentais. No entanto, evitar completamente a analgesia não é sempre justificada e há uma necessidade de equilíbrio entre as necessidades de bem-estar dos animais, com a realização dos objectivos científicos.

Diferenças no tamanho do animal, estirpe e anatomia cerebrovascular, além das variações de tamanho e tipo de filamento, todos são sugeridas para influenciar o curso resultados^23,24. A abordagem alternativa descrita aqui evita a dependência da vaca durante a reperfusão, reduzindo assim, pelo menos em parte, a variabilidade entre animais no volume da lesão. Anatomia de vaca é altamente variável em camundongos, em particular no C57BL /₆ tensão, que é frequentemente utilizada em estudos experimentais de AVC. 90% dos camundongos C57BL/6 têm uma vaca incompleta devido a uma variado posterior comunicação artéria (PcomA) permeabilidade, que pode ter um efeito sobre o volume de danos isquêmicos devido a perfusão insuficiente de estruturas fora do território da MCA,^{13, 25}. reparar o CCA em camundongos, como mostrado aqui, resultados no restabelecimento do sangue fluem através do CCA para a área isquêmica, conforme descrita em ratos¹⁵. Os dados representativos aqui mostram que a reparação do CCA aumenta reperfusão, embora o fluxo de sangue no CCA não foi medido diretamente. No entanto, é possível que o cirurgião Visualizar o CCA reperfusão com sangue após a reparação do navio, como ele retorna para um estado de completo e pulsante ao longo do tronco, proximal e distal para o local de reparação. Esta confirmação visual, juntamente com as leituras de flowmetry Doppler laser da área isquêmica, pode ser usada para confirmar o reparo bem sucedido do navio. O tempo entre a aplicação de almofada de tecido e a remoção do clipe de navio desde o CCA pode ter um impacto sobre a patência resultante do CCA, como reduzir o tempo entre a aplicação de almofada de tecido e a remoção do grampo impedirá a almofada de tecido de aderir ao o lado oposto do CCA. Embora tecnicamente desafiador, o procedimento MCAO alternativo explicado aqui não requer nenhumas habilidades adicionais do que aqueles necessários para realizar a indução cirúrgica de MCAO em camundongos.

Tradicionalmente associado com uma alta variabilidade em medidas de resultados, estudos experimentais de AVC podem ter uma tendência a ser de fraca potência. Requisitos éticos e de bem-estar em combinação com preocupações económicas e práticas podem contribuir para estudos, sendo de fraca potência. Reduzindo a variabilidade no resultado e, portanto, produzindo resultados mais consistentes de lesão do outro lado um grupo experimental, cálculos de energia mais eficazes podem ser executados com o objectivo último de estudos devidamente alimentada.

Em conclusão, este procedimento alternativo de reparação do CCA, em ratos, resulta em menor variabilidade de volume de lesão após acidente vascular cerebral experimental e cálculos de energia permite que pequenos grupos experimentais devem ser exigidas para um efeito de tratamento, quando for o caso de teste são usados.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm flexible single fibre optic probe	Moor Instruments, UK	P10d	Use with master probe code: VP10M200ST
7-0 silicone coated monofilament	Doccol, USA	701956PKRe	Item dependent on animal size and weight - use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article.
9.4T Preclinical MRI system	Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA	MY11520101	Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging
Animal monitoring and gating equipment	SA Instruments, Stony Brook, New York, USA	22124005	MRI compatible temperature and respiration monitoring
Bupivacaine	National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK	512345	Marcaine
C57BL/6 Mice	Charles River, Oxford, UK	B6JSIMA49D
Carprofen	Norbrook Laboratories	143658	Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection
Chlorhexidine 4% hand cleanser solution	VWR International Ltd, Lutterworth, UK	MOLN10008780	HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care
Cotton buds	National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK	213512	Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving.
Dissecting stereoscope	Carl Zeiss	OPMI99	Resident piece of equipment. Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable.
dissolvable 6-0 sutures	National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK	9544	Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981)
Donut probe holder	Moor Instruments, UK	PHDO	Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine.
dumont #5 forceps	World Precision Instruments, Hertfordshire, UK	500342
Fibrinogen and thrombin sealant	Baxter, Berkshire, UK	1502243	TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2 mL
Gel food	Datesand group, Manchester, UK	72065022	Diet Gel Recovery
Image display and measuring software package	3D Slicer	https://www.slicer.org/	Version 4.0
Image display and measuring software package	NIH, Maryland, USA	https://imagej.nih.gov/ij/index.html	NIH/ImageJ
LDF monitor	Moor Instruments, UK	moorVMS-LDF
micro vannas scissors	InterFocus Ltd, Linton, UK	15000-08	Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required.
Microvascular clip	World Precision Instruments, Hertfordshire, UK	15911	10 G Vessel Clip
microvascular clip holders	World Precision Instruments, Hertfordshire, UK	14189
MRI acquisition and analysis software	Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA	VnmrJ Version 4.2	Revision A
no. 15 scalpel	Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK	INS4678	Sterile No15 Scalpel - manufactuer number P305. Other suppliers are available.
Non-disolvable 6-0 suture	National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK	W529	Ethicon Mersilk Sutures
Ocular lubricant	National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK	847288	Lacrilube (5100G13)
Optical matching gel	Moor Instruments, UK	PMG
Pulse Oximetry Reader	Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA	MouseOx	MouseOx - rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor Use with mouse thigh sensor.
Rehydration gel	Datesand group, Manchester, UK	70015022	HydroGel
Small hair clippers	vetproductsuk.com	HS61	Contura Cordless trimmer/clippers
Sterile 0.9 % NaCl Solution	VWR International Ltd, Lutterworth, UK	LOCA3528286	SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS
sterile Petri dish	VWR International Ltd, Lutterworth, UK	5168021	50 mm sterile Petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50 mm diameter is required.
Topical tissue adhesive	World Precision Instruments, Hertfordshire, UK	503763	GLUture topical Tissue Adhesive
Waterproof superglue	Loctite	Loctite Superglue Precision Max	Available at most hardware shops.
White paper chip	Datesand group, Manchester, UK	CS1BPB	Pure-O'Cel