Mittlere zerebrale Arterie Okklusion so dass Reperfusion über gemeinsame Halsschlagader Reparatur bei Mäusen

Zusammenfassung

Intraluminal Filament Okklusion der mittleren zerebralen Arterie ist das am häufigsten verwendete in Vivo Modell der experimentellen Schlaganfall bei Nagetieren. Ein alternativer chirurgischer Ansatz ermöglichen gemeinsame Halsschlagader Reparatur erfolgt hier, wodurch der Reperfusion der gemeinsame Halsschlagader und eine vollständige Reperfusion auf das mittlere zerebrale Arterie-Gebiet.

Zusammenfassung

Der ischämische Schlaganfall ist eine der Hauptursachen von Erwachsenen Erwerbsunfähigkeit und Tod weltweit. Die aktuellen Behandlungsmöglichkeiten sind begrenzt, mit nur Tissue Plasminogen Activator (tPA) als zugelassenes Medikament Behandlung ischämischer Schlaganfälle ausrichten. Aktuelle Forschung auf dem Gebiet des ischämischen Schlaganfalls konzentriert sich auf das bessere Verständnis der Pathophysiologie des Schlaganfalls zu entwickeln und neuartige pharmazeutische Ziele zu untersuchen. Zuverlässige experimentelle Schlaganfall Modelle sind entscheidend für das Fortschreiten der möglichen Behandlungen. Das mittlere zerebrale Arterie Okklusion (MCAO) Modell ist klinisch relevant und die am häufigsten verwendeten chirurgischen Modell des ischämischen Schlaganfalls bei Nagetieren. Jedoch sind die Ergebnisse dieses Modells, wie Läsion Lautstärke, verbunden mit hoher Variabilität, besonders bei Mäusen. Hier beschriebenen alternative MCAO Modell ermöglicht die Reperfusion der gemeinsame Halsschlagader (CCA) und die erhöhte Durchblutung des Gebiets mittlere zerebrale Arterie (MCA), mit einem Gewebe-Pad mit Fibrinogen-basiertes Dichtungsmittel, das Schiff und der verbesserte reparieren Wohlergehen der Mäuse durch äußere Halsschlagader (ECA) Ligatur zu vermeiden. Dies reduziert die Abhängigkeit von Kreis von Willis, die als bekannt ist sehr anatomisch Variable bei Mäusen. Repräsentative Daten zeigen, dass bei dieser alternative chirurgische Vorgehensweise die Variabilität der Läsion Bände zwischen dem traditionellen MCAO-Ansatz und die alternative der hier beschriebene Ansatz verringert.

Einleitung

Eine der Hauptursachen für zerebrale Schlaganfall ist fokale Ischämie im Gebiet der mittleren zerebralen Arterie. Tissue Plasminogen Activator (tPA) ist die nur pharmakologische Behandlung mit nachgewiesener Wirksamkeit, obwohl zahlreiche klinische Medikamentenstudien gezielt zu ischämischen Schlaganfall^1,2. Jedoch können aufgrund von Sicherheitsbedenken und ein schmales therapeutisches Fenster (< 4,5 h), nur ca. 15 % aller Schlaganfall-Patienten sind berechtigt tPA zu erhalten, und die Rekanalisation Raten < 50 %^3,4.

Reproduzierbar und klinisch relevante Tiermodellen der Schlaganfall gelten als wesentlich für die Entwicklung von neuen und potenziellen Schlaganfall therapeutische Behandlungen zu informieren. Jedoch aufgrund von Bedenken hinsichtlich Konsistenz und Variabilität in den Ergebnissen mit Tiermodellen bleibt es wichtig, bestehende in Vivo Modelle zur Verbesserung der Übersetzung aus präklinischen Studien in die Klinik zu verfeinern. Das Fehlen einer Übersetzung von der präklinischen experimentelle Wirksamkeit der möglichen Behandlungen, klinische Anwendung ist ein ständiges Anliegen für Schlaganfall-Forschung-⁵. Gründe für das Scheitern der Übersetzung dürften mehrere sein und können mit zusammenhängen, z. B. das Studiendesign, Behandlung Verspätungen, klinischen Schlaganfall Heterogenität und die Grenzen der Tiermodelle verwendet⁶. Eine zentrale Herausforderung für Schlaganfall-Forschung bleibt die Entwicklung von sicheren und wirksamen Behandlungen.

Mittlere zerebrale Arterie Okklusion (MCAO) durch Intraluminal Filament Einfügung ist das am häufigsten verwendete in Vivo Nagetier Modell der experimentellen Schlaganfall. Dieses Modell ermöglicht die Wiederherstellung der Durchblutung nach einer Ischämie-Induktion, imitiert die Ereignisse, die in menschlichen Takt⁷auftreten. Jedoch auftreten, insbesondere bei Mäusen, heterogene Läsion Bände mit abwechslungsreichen Standardabweichungen obwohl definiert chirurgischen Protokolle angewandte^8,9,10sind. Es ist typisch für eine bimodale Verteilung von kleinen striatalen und große Striato-kortikale Läsion Bände¹¹zu sehen. Ischämie zu induzieren, wird der Faden in der Regel durch einen Schnitt der CCA oder ECA, die dann dauerhaft aufgespaltenen¹²bleiben eingefügt. Die dauerhafte Unterbindung des CCA verhindert die Wiederherstellung des Blutflusses in der inneren Halsschlagader (ICA) und anschließend die MCA-Gebiet. Dies bewirkt, dass Reperfusion der Sicherheiten Versorgung innerhalb der Kreis von Willis (Kuh) abhängig sein. Die Kuh-Struktur hat anatomische Variabilität zwischen einzelnen Tieren, vor allem in C57BL/6 Mäusen-a Belastung in der Regel in in Vivo Schlaganfall Forschung¹³verwendet. Eine alternative Methode der Glühfaden Einfügung durch die ECA, lässt der kontinuierliche Perfusion durch die zuständige Behörde, aber diese Methode Kompromisse die arterielle Versorgung der ECA-Gebiet die bei Ratten gezeigt wurde, hat eine nachteilige Wirkung auf des Tieres zu haben Wohlbefinden,¹⁴.

Das Vertrauen auf die Kuh für Sicherheiten und Reperfusion in der etablierten MCAO-Modell kann die Läsion Volumen Variabilität nach Okklusion teilweise entfallen. Wir beschreiben eine alternative murine chirurgische Verfahren wo ECA Ligatur wird vermieden und die CCA-Inzision wird repariert, so dass Reperfusion durch CCA, unabhängig von der Kuh. Die Reparatur von der CCA-Schnitt hat zuvor bei Ratten gezeigt, zu einer erfolgreichen Reperfusion durch die CCA¹⁵führen. Wir haben diesen Ansatz erfolgreich in Mäusen¹¹ angewendet und berichten hier das Protokoll führt zu einer reduzierten Variabilität in der Läsion Volumen, das Hauptergebnis Maß in experimentellen Schlaganfall Studien verwendet.

In diesem Protokoll führen wir MCAO durch CCA Schiff Filament einsetzen, gefolgt von CCA Schiff Reparatur, beinhaltet eine Gewebe-Pad und Dichtstoff Anwendung erlauben Reperfusion verpflichten.

Protokoll

Dieses Protokoll und die gemeldeten Daten wurden gemäß dem Gesetz UK Tiere (wissenschaftliche Verfahren), 1986 (Projekt Lizenz 60/4315) und nach der institutionellen ethischen Genehmigung durchgeführt. Alle Experimente sind in Übereinstimmung mit dem Animal Research berichtet: Meldung von In Vivo Experimente (Ankunft) Leitlinien¹⁶.

1. Vorbereitung

1. Vertraut zu machen Erwachsene männlichen C57BL/6 Mäusen, postoperative Versorgung (z.B. Umwelt, Bettwäsche, Erholung Lebensmittel) mindestens 48 Stunden vor der Operation.
   Hinweis: Post-MCAO Tiere haben oft Schwierigkeiten beim Essen und trinken nach der Operation.
   1. Zur Vermeidung übermäßiger Gewichtsverlust Chirurgie folgend akklimatisieren Sie die Tiere zu einer Post-MCAO-Diät durch, z. B. Rehydratation Gel, Gel Essen und normale Ernährung nass/nass-Pellets direkt auf dem Boden platzieren.
   2. Ändern Sie die Käfig-Bettwäsche in postoperative Bettwaren, wie White-Paper-Chip.
2. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente vor Beginn der chirurgischen Einrichtung oder Verfahren.
   1. Zu diesem Zweck Autoklavieren die Werkzeuge (mit einem Minimum von 121 ° C, 15 Psi für 15 min) oder durch den Einsatz von Ethylenoxid (nach den richtigen Anweisungen des Herstellers, für 8 – 10 h).
   2. Desinfizieren Sie alle Oberflächen vor der Einrichtung des Verfahrens. Decken Sie alle Oberflächen mit sterilen OP-Tüchern oder autoklaviert Folie für Gegenstände, die während der Operation erfordern. Verwenden Sie aseptischen Technik für die Dauer des Verfahrens.
      Hinweis: Autoklaviert Folie kann verwendet werden, zur Deckung der Instrumente oder Geräte, die während der Operation stattfinden müssen. Mit sterilen Handschuhen und Techniken, die Folie aufgebracht werden und dann das Element in den sterilen Bereich platziert werden kann. Im Anschluss daran wird eine sterile Handschuh Änderung erforderlich sein.

2. mittlere zerebrale Arterie Okklusion Chirurgie

1. Verwenden Sie Erwachsene männlichen C57BL/6 Mäusen mit einem Gewicht von 24 – 31 g zum Zeitpunkt der Operation. Anästhesie mit 5 % Isofluran in 2 L/min O₂, in einer roten Kunststoff-Anästhesie-Kammer zu induzieren.
2. Nach der Induktion, reduzieren die Isofluran weiterhin eine ausreichende Anästhesie Tiefe für die Chirurgie (z.B. 1,5 – 2 % 70 % N₂O₂30 % O₂), geliefert von Gesichtsmaske verbunden mit einem Scavenger, der Chirurg zu senken Exposition gegenüber Isofluran.
   Hinweis: Lachgas (N₂O₂) kann in Verbindung mit Sauerstoff (O₂) verwendet werden, um die erforderliche Menge an Isofluran für eine ausreichende Anästhesie Tiefe zu reduzieren.
3. Systemische Analgesie präoperativ zu verwalten [Carprofen, 10 mg/kg subkutan (sc.)] und örtlicher Betäubung, der Schnitt vor Ort (Bupivacain, 2 mg/kg sc., verdünnte 01:10 in 0,9 % Kochsalzlösung) Peri-operativ.
4. Präoperativ verwalten Sie Flüssigkeiten intraperitoneal (Ip.) Injektionen von 200 µL steriler vorgewärmte 0,9 % NaCl-Lösung.
5. Rasieren, das Fell der rechten Schläfenregion und ventralen Halsregion mit kleinen Haarschneidemaschinen, um die Haut verfügbar zu machen. Desinfizieren Sie die chirurgische Hautareal mit einem 5 % Chlorhexidin-Lösung für 3 min. anwenden okuläre Schmiermittel auf beiden Augen, um sie vor dem Austrocknen während der Operation zu verhindern.
   Hinweis: Wenn für Puls Pulsoxymetrie Lesungen Monitor Sauerstoffsättigung des Blutes, Herzfrequenz und Atemfrequenz erforderlich ist, verwenden Sie Haarentfernungs-Creme, um das Hinterbein des Haares zu löschen. Auftragen der Creme saubere Baumwollhandschuhe mit Knospen und nach der Haarentfernung, waschen Sie den Bereich mit der verdünnten Chlorhexidin-Lösung. Führen Sie diesen Schritt in einer präoperativen Bereich zur Minimierung des Risikos von lose Fell verunreinigen das sterile OP-Feld. Forscher können andere Operationsstelle Zubereitungen nach lokaler Praxis verwenden möchten.
6. Übertragen Sie die Maus auf den OP-Bereich und legen Sie es in Bauchlage auf einer homöotherm Wärme-Matte mit einem sterilen Tuch abgedeckt. Pflegen Sie Anästhesie über eine Nase Kegel. Legen Sie eine rektale Sonde, um die Maus Körpertemperatur überwachen und pflegen sie bei 37,0 ± 0,6 ° C.
   1. Vor jedem chirurgischen Einschnitte Überprüfen des Hinterpfote Rückzug Reflexes und blinken Reflex um die Tiefe der Narkose zu bestätigen.
7. Legen Sie eine Lasersonde Doppler Flowmetry (LDF), um den Blutfluss zu den MCA-Gebiet zu erfassen.
   1. Mit einer Dissektion Stereoskop, machen Sie einen Schnitt von < 1 cm in der Mitte zwischen dem rechten Auge und Ohr auf die zeitliche Haut mit einem Skalpell Nr. 15. Das darunter liegende Gewebe bedeckt den Schädel, sanft kratzen dies vom Knochen und trocknen die Oberfläche mit sterilen Wattestäbchen unverblümt zu sezieren.
      Hinweis: Vorsicht ist geboten, um nicht zu beschädigen die Temporalis Muskel.
   2. Fassen Sie die 0,7 mm, flexible einzelne Glasfaser-Sonde befestigt an den LDF-Monitor, dessen Ende mit einem scharfen Skalpell eine flache Kante, drücken Sie diese durch die Donut-förmigen Sondenhalter, und legen Sie eine kleine Menge optisch passenden Gel am Ende der Faser geschnitten.
   3. Legen Sie eine kleine Menge wasserdicht Super-Kleber Kleber am unteren Rand des Sondenhalter; zulassen, dass dies teilweise trocken und klebrig geworden.
   4. Trocknen den Schädel oberhalb des Schläfenbeins und legen Sie eine kleine Menge von topischen Gewebe Klebstoff in einem Kreis bis auf die Knochen, gerade genug für den Sondenhalter.
   5. Legen Sie die Sondenhalter mit der Faser faseroptische Sonde bereits im Ort, auf diesem Gebiet (6 mm seitlich und 2 mm distal aus der Bregma).
   6. Lassen Sie den Klebstoff trocknen; Sobald trocken und befestigt, mit der Aufnahme der LDF-Daten.
8. Drehen Sie vorsichtig das Tier über in Rückenlage, kümmert sich um die Laser-Doppler-Sonde zu unterstützen und zu verhindern, dass seine Ablösung. Vorsichtig Band die beiden Vorderpfoten hinunter mit mikroporösen medizinisches Klebeband, Schiebe ein paar Baumwolle Knospen (oder etwas ähnlichem, wie z. B. geschlossene Zange) unterhalb des Halses zu heben das Gebiet und Spannung erzeugen. Decken Sie die Maus mit einem sterilen Tuch, aseptische Deckung aufrechtzuerhalten.
9. Beginnen Sie die Dissektion und Exposition des CCA.
   1. Machen Sie einen 1,5 cm Mittellinie Schnitt auf dem exponierten ventralen Hals mit einem Skalpellklinge Nr. 15.
   2. Mit sanften stumpfe Dissektion Techniken sanft Einfahren der Speicheldrüsen an den Seiten, Freilegung der Luftröhre.
   3. Verwenden stumpfe Dissektion, sezieren Sie frei von dem umliegenden Gewebe und Vagusnerv CCA.
      Hinweis: Berühren Sie den Vagusnerv direkt, wie Schäden an den Vagusnerv Mobilität, Ernährung und Atmung beeinträchtigen kann.
10. Übergeben Sie zwei klein (2 cm) Abschnitte eine nicht auflösbare 6-0 Naht unterhalb der CCA, dorsal zum Schiff und Ventral, der Vagusnerv. Zeichnen Sie eine Seidenkrawatte näher zum Chirurgen und binden Sie es eng um die CCA (proximalen Krawatte). Binden Sie lose die zweite Seide Krawatte (distale) in Richtung der Bifurkation des ICA/erh.
11. Zu beginnen, um einen Abschnitt des CCA isolieren, gelten einen mikrovaskulären Clip oberhalb der distalen Krawatte aber die Bifurkation nicht zu behindern. Mit Mikro Vannas Schere, machen Sie ein kleines Loch in der CCA.
    Hinweis: Die ECA muss zu allen Zeiten patent bleiben. Der CCA-Schnitt darf nicht mehr als 40 % der Breite des Schiffes und in eine leicht zugängliche Bauchlage; Dies spielt eine wichtige Rolle in der Schiff Reparatur Bühne Post-MCAO.
12. Einfügen Sie ein 7-0 silikonbeschichteten Monofile in CCA, voran in Richtung des mikrovaskulären Clips.
    Hinweis: Die Filament-Größe muss anhand der Maus Gewicht vor der Operation festgelegt werden. beziehen sich auf die Anweisungen des Herstellers.
    1. Ziehen Sie die distalen Krawatte, genug, um das Filament einrasten zu befestigen, ohne Sie zu beschädigen. Entfernen Sie die mikrovaskuläre Zange mit Clip Halter.
       Hinweis: Kein Blutverlust sollte an dieser Stelle eingesehen werden. Gibt es ein Rückfluss des Blutes, ist die Krawatte hält den Faden nicht fest genug.
13. Den Faden in der ICA vorantreiben.
    1. Stellen Sie sicher das Filament innerhalb der ICA verbleibt und nicht in die Pterygopalatine Arterie (PPA) weitergegeben. Zu diesem Zweck leicht heben und ziehen die CCA, unter Verwendung eines Seidenkrawatten, an der Außenseite des Körpers des Tieres, und lenken das Filament, vorbei an der intern vor Eröffnung des PPA zu biegen.
       Hinweis: Erweiterte einmal zum MCA Zweig Ursprung, werden ein Tropfen auf die relative Durchblutung der mitgelieferten Gebiet die LDF-Werte auf; Dies bestätigt die Filament-Platzierung.
14. Sichern Sie den Faden in Platz mit der distalen Krawatte binden dies enger. Belassen sie für die Dauer der Okklusion Zeitraum.
    Hinweis: Abhängige auf einzelne Protokolle, das Tier zu einem Recovery-Käfig verschoben werden kann, folgende Wunde nähen, um wiederherzustellen, oder bleiben für die Dauer der Okklusion unter Narkose. Sicherzustellen Sie im letzteren Fall, dass die Wunde vor dem Austrocknen durch die Verwendung von sterilen vorgewärmte 0,9 % NaCl Kochsalzlösung verhindert wird.

3. Post-Okklusion

1. Am Ende der MCAO Periode zurückziehen Sie das Filament sofort, bis der weiße Faden Kopf deutlich sichtbar ist.
2. Dann lösen Sie den distalen CCA binden gerade genug, um das Filament Kopf Großteil des Weges aus dem Behälter entfernen.
   Hinweis: Das Filament kann vollständig an dieser Stelle entfernt werden wenn der Chirurg zuversichtlich, mit Geschwindigkeit ist, um den distalen Krawatte um Blutverlust zu vermeiden.
3. Platzieren Sie eine mikrovaskuläre Clip in einer horizontalen Position in Richtung der CCA Bifurkation neben der distalen Krawatte. Die distale Krawatte lösen und das Filament vollständig zu entfernen. Fügen Sie ein weiteres mikrovaskulären Clip unter der proximalen CCA-Krawatte in Richtung der Chirurg.
   Hinweis: Sicherstellen Sie, dass das Schiff weit genug in die Zacken der Schelle um jedes Verrutschen zu verhindern ist. Die Platzierung der Clips ist für Clip-Entferner leichten Zugang in späteren Schritten zu gewährleisten. Die Clips können verwendet werden, zu helfen, das Schiff damit eine bessere Abfertigung und Platzierung des Gewebes Patches, platzieren die Clips horizontal über die umliegende Muskulatur kann zu heben.
4. Sorgfältig entfernen Sie beide Seidenkrawatten mit Dumont Nr. 5 Zange oder einer Schere Mikro Vannas und trocknen Sie den Bereich mit sterilen Wattestäbchen.
   Hinweis: Vorsicht ist geboten, nicht zu kürzen durch/in das Gefäß.
5. Fügen Sie in eine sterile Petrischale Fibrinogen und Thrombin Dichtstoff Lösungen 1 und 2 (siehe die Tabelle der Materialien), die beiden Substanzen bereit trennen, bleiben Sie für später mischen hinzu.
   Hinweis: Nur sehr geringe Mengen der Wirkstoffe sind erforderlich (< 0,25 mL). Die Lösungen getrennt zu halten, verhindert eine vorzeitige Reaktion zwischen den beiden Bestandteilen. Sicherstellen Sie, dass die GAP die gleiche Weise ersetzt wird, wie es entfernt wurde, um Cross-Kontamination der zwei Spritzen zu verhindern, die den Agent reagieren und setzen in der Spritze führen würde. Vor dem Gebrauch speichern Sie die Lösungen bei-20 ° C. Wenn für die erste Operation erforderlich ist, tauen Sie das Dichtungsmittel auf Raumtemperatur auf. Die Dichtmasse nicht wieder einfrieren; Es muss bleiben bei Raumtemperatur und kann auf diese Weise gespeichert werden. Die Spritze kann für mehrere Operationen, so dass es wirtschaftlich verwendet werden; Wir empfehlen jedoch das gleiche Fläschchen nicht länger als 1 Woche zu verwenden, um Kontaminationen zu vermeiden.
6. Verwenden Sie stumpfe Dissektion entlang des Muskels mit Dumont Nr. 5 Zangen und Mikro Vannas Schere erhalten eine dünne ventrale Scheibe sternocleidomastoideus Muskel zu verwenden für die Gewebe-Pad, die Scheibe ist nicht mehr als 1 mm dick und verläuft entlang der oberen Fasern des Muskels zu gewährleisten.
   Hinweis: Schneiden Sie nicht durch/über den Muskel, seine Funktion erheblich beeinträchtigen wird. Das Gewebe muss groß genug sein, um der CCA-Schnitt bequem zu decken sein.
7. Mit Dumont Nr. 5 Pinzetten, nehmen Sie das Gewebe-Pad und mischen Sie das Gewebe gleichmäßig über die beiden Fibrinogen und Thrombin Dichtstoff Lösungen, einen Kanal zwischen den beiden Reagenzien bilden. Koagulation wird schnell auftreten; Entfernen Sie Koagulation beginnt, die Gewebe-Elektrode auf der CCA-Schnitt. Legen Sie das Gewebe Pad flach, mit einem festen Mitteldruck und offene Zange.
   1. Schnell entfernen des distalen mikrovaskulären Clips zwar noch sanft das Gewebe-Pad in Position halten.
      Hinweis: Dadurch einige Rückfluss von Blut, weiter die Fibrinogen und Thrombin Dichtstoff Reagenzien zu aktivieren. Gerade genug Druck ist nötig, um das Pad zu halten aber nicht, das Schiff vollständig zu blockieren.
   2. Langsam zu lindern den Druck aus dem Gewebe-Pad, so dass Blut unter die Schnitt-Bereich fließen. Nun, langsam und sanft den Druck aus dem proximalen mikrovaskuläre Clip lösen und vollständig zu entfernen.
   3. Hinweis: Um sicherzustellen, dass das Schiff voll patent wird, müssen die Platzierung der Gewebe-Pad und die Beseitigung der mikrovaskuläre Clips schnell auftreten, um das Gewebe-Pad an der Innenseite des CCA Abdichtung zu verhindern. Allerdings gibt es eine kleine Menge Blut austreten, erneut aufgeben Sie einigen leichten Druck auf das Gewebe-Pad, damit weiter Zeit für Bildung von Blutgerinnseln und Abdichtung auftreten. Wenn das Blut austreten erheblich ist oder das Gewebe Pad erscheint nicht zur Abdichtung werden, behalten Sie den Druck zur Verhinderung Blutverlust und beide CCA mikrovaskuläre Clips um den Schnitt zu isolieren und Verhinderung einer weiteren Blutverlust zu ersetzen.
8. Für den Fall, dass das Gewebe-Pad, das Schiff nicht dicht, kann ein zweiter Versuch, folgende Schritte 3.3 – 3.7.3 erfolgen.
9. Nachdem das Schiff versiegelt ist, Naht der Wunde mit auflösbaren 6-0 Nahtmaterial. Wenn LDF Aufnahme während Operation fortgesetzt wurde, entfernen Sie LDF vom Schädel und Naht mit auflösbaren Wunde Naht 6-0.

4. postoperative Pflege

1. Legen Sie das Tier in eine vorgewärmte Erholung Käfig (gelegen auf einer beheizten Regal/Matte bei 35 ° C oder in einer beheizten Kammer).
   Hinweis: Forscher bevorzugen andere Temperaturen und Dauer entsprechend der lokalen Praxis einzusetzen.
2. Bieten Sie alle Tiere mit 200 µL vorgewärmte 0,9 % NaCl Kochsalzlösung sc. sofort nach der Operation, in 4 h nach der Operation und 2 X täglich für 72 h.
   Hinweis: Die Verwaltung der vorgewärmte 0,9 % NaCl ist Tier geführt. Wenn mehr erforderlich ist, können mehr Flüssigkeit verabreicht werden, um eine gute Erholung zu gewährleisten.
3. Geben Sie in den Käfig Erholung den Tieren ungehinderten Zugang zu matschig Diät Pellets, trocken Diät Pellets und Rehydrierung Gel Gel Essen neben Ad Libitum Zugang zu Wasser.
4. Die SC Carprofen Injektion bei 24 h nach der Operation zu wiederholen (siehe Punkt 2.3).
   Hinweis: Alle Tiere erhalten die gleiche Dosis von Carprofen; eine neuroprotektive Wirkung dürfte vernachlässigbar sein.
5. Führen Sie in regelmäßigen Abständen für 48 h postoperative Maus Grimasse erzielte¹⁷ um Schmerzen Ebenen um die Entscheidung zur weiteren Verwaltung Analgesie Beihilfen zu beurteilen.
6. Wiegen der Tiere unmittelbar vor der Operation und dann täglich nach dem Eingriff. Führen Sie täglichen Beobachtungen und komplette Wohlergehen Blätter, ihre Nahrung und Wasseraufnahme und klinischen Symptome zu überwachen.
7. Verpflichten sich funktionelle Beobachtungen bei 24 h und 48 h nach der Operation. Die Mäuse auf eine fokale Defizit-Skala zu bewerten. Bewerten Sie ihre Körpersymmetrie, obligatorische Kreisen, Gang, 45° Gitter Klettern, Kreisen Verhalten, vorderen Gliedmaßen Asymmetrie und Whisker Touch Response^18,19,20.

5. Magnetresonanz-Bildgebung und Bildverarbeitung

1. Messen Sie die Läsion Volume (LV) mit strukturelle Magnetresonanztomographie (MRT).
   Hinweis: Alternative Methoden, wie histologische Färbung mit Triphenyltetrazolium-Chlorid (TTC), zuvor verwendet wurden und zu strukturellen MRT-Daten korrelieren. Diese Methode ist jedoch nur am Endpunkt einer Studie und nicht längs einsetzbar. Mit längs-MRI Scan verringert die Anzahl der Tiere, die für eine Untersuchung erforderlich.
   1. Nach 48 h nach der Induktion von MCAO die Maus mit Isofluran (5 % Isofluran in 1 L/min O₂ für Induktion), 1,5 – 2 % Isofluran für Wartung zu betäuben.
   2. Übertragen Sie die Maus auf die MRT-Wiege, legen Sie es auf die Atmung-Sensor zur Überwachung der Atemfrequenz und Implantat die rektale Temperaturfühler zur Überwachung der Temperatur während des Scanvorgangs. Platz 2-Kanal-Gehirn der Maus RF Spule über das Gehirn ein Signal empfangen und Ort die Wiege in einem 9,4 T horizontale Bohrung Scanner.
      Hinweis: Hier wurde eine Volumen-Spule mit 72 mm Innendurchmesser für die RF-Übertragung verwendet.
   3. T2-gewichteten Scans mit einer schnellen Spin-Echo-Sequenz zu erwerben. Legen Sie die Wiederholzeit (TR) auf 3.000 ms und die Nachhallzeit (TE) zu 40 Ms. Einsatz 18 mm x 18 mm als das Sichtfeld (FOV) und erhalten Sie eine Matrix 256 x 256 Erwerb mit Scheiben von 18 mm x 0,8 mm und drei Signal-Mittelwerte in ca. 10 min.
   4. Diffusion Tensor Bilder (DTI) mit einer schnellen Spin-Echo-Sequenz zu erwerben. Festlegen der TR bis 1.730 ms, TE 35 MS, FOV, 20 mm x 20 mm, und erhalten eine Übernahme von 128 x 128 Matrix mit Scheiben Signal Durchschnitte 16 mm x 1 mm, 2, 14 Verbreitung Codierung Richtungen und eine maximale b-Wert 1.024 s/mm².
   5. Messen Sie das LV auf den T2-gewichteten Bildern mit einer Bildanzeige und Mess-Software-Paket. Messen Sie den lesioned Bereich, sortieren die Werte zusammen, um das gesamte Läsion Volumen berechnen unter Berücksichtigung der MRI Scheibendicke (während der MRT-Untersuchung festgelegt).
   6. Berücksichtigen Sie keine Schwellung und der Prozentsatz der Bereich Läsion Bände während der Messung die volle kontralateralen und ipsilateralen Hemisphäre. Für jedes Gehirn Schwellung durch Ödem über eine indirekte Methode zur Messung der Läsion Volumen als korrekt beschriebenen^21,22. Schließen Sie nur Scheiben, die Rinde Gewebe und nicht Frontallappen oder Kleinhirn Gewebe nach einer Standardmaus Gehirn Atlas Überkorrektur zu vermeiden enthalten.
2. Die Läsion Verbreitung Parameter zu messen und die Kern- und Halbschatten Regionen von Interesse zu erhalten.
   1. Generieren Sie die scheinbaren Diffusionskoeffizienten (ADC) und fraktionale Anisotropie (FA) Karten aus der Diffusion Tensor Bilder mittels geeigneter MRT-Analyse-Software.
   2. Richten Sie die DTI Bilder mit der T2-gewichteten Bilder mit entsprechenden Bildanalyse-Software in der Lage, eine lineare Registrierung Bilder aus. Subtrahieren Sie nach der Registrierung die diffusionsgewichtete Läsion Masken (ischämische Kern) von der T2-gewichteten Läsion Masken (ischämische Kern- und Halbschatten), die Halbschatten-Region zu schätzen. Gelten Sie die daraus resultierende Masken (Kern- und Halbschatten) für die ADC und FA-Maps, die Diffusion-Parameter in der Kern- und Halbschatten zu quantifizieren.
   3. Die ipsilateral Kern- und Halbschatten Masken über der Mittellinie des Gehirns zu übersetzen, um kontralateralen ADC und FA-Werte für den Vergleich zu erhalten.

Ergebnisse

Insgesamt 24 erwachsenen männlichen C57BL/6 Mäusen, mit einem Gewicht zwischen 24 – 31 g zum Zeitpunkt der Operation, wurden in der Studie verwendet. Ein Tier starb an den Folgen mittlere zerebrale Arterie Okklusion (MCAO) und einer durch chirurgische Komplikationen ausgeschlossen wurde. Die hier vorgestellten Daten stammen aus einer zuvor veröffentlichte Arbeit von den Autoren. Diese wurden verwendet, um die Wirkung des Schiffes Reparatur auf MCAO Ergebnisse¹¹zu veranschaulichen. Alle Daten werden als Thr Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die Daten wurden statistisch nach Normalität, die mit dem D'Agostino-Pearson Omnibus Normalität Test bewertet. Parametrische Daten wurden verglichen mit der Student t-Test (für zwei Mittel) und einfache ANOVA mit dem Sidak Test (mehrere Möglichkeiten). Nicht-parametrische Daten wurden verglichen mit dem Mann-Whitney U-Test. Die Variabilität der parametrischen Daten wurde anhand einer F-test, und nicht-parametrische Daten Variabilität wurde anhand Levenes-Test.

In der Regel in MCAO Verfahren, die verschließenden Filament wird in der CCA eingefügt und die ECA ist zur Vermeidung dieser Filament aus vorbei in die ECA, anstatt die ICA ligiert. Eine Vermeidung von ECA Ligatur und die Zugabe von Analgesie zeigte eine Tendenz zu geringeren Gewichtsverlust bei 48 h Post-MCAO, im Vergleich zu Daten aus früheren Studien durch den gleichen Chirurgen keine Analgesie ECA Ligatur mit MCAO gleichzeitig, während der LV erschien nicht betroffen, siehe Abbildung 1.

Mäusen wurde ein 60 min MCAO-induzierten Ischämie Reperfusion mit CCA Schiff Reparatur oder mit der typischen Ligatur des CCA-Ansatzes gefolgt. Eine schematische Darstellung der aufgespaltenen und unligated reparierten CCA ist in Abbildung 2dargestellt.

Laser-Doppler-Flowmetry wurde verwendet, um die Strömung Blutperfusion im Gebiet von der MCA bei MCAO, vor und nach der CCA Schiff Reparatur bestätigen. Abbildung 3 zeigt, dass 5 min nach dem Filament entfernen, die regionale Hirndurchblutung (rCBF) in der Region des Gehirns von der MCA erheblich gestiegen. Die Durchblutung wurde beibehalten, bis der Behälter-Reparatur, mit einer Steigerung der Durchblutung, die MCA-Gebiet gezeigt nach CCA Schiff Reparatur, was darauf hindeutet, dass die CCA-Reparatur eine erhöhte Durchblutung der ischämischen Gebiet im Vergleich zu vertrauen erlaubt auf der Kreis von Willis allein.

T2-gewichteten MRT wurde zur Ermittlung die gesamten LV und DTI Scans wurden verwendet, um den Kern LV, 48 h nach der MCAO zu bestimmen. Abbildung 4A zeigt keinen signifikanten Unterschied in der Summe oder Core LV zwischen Reparatur und aufgespaltenen Verfahren Gruppen. Jedoch die Daten Variabilität für beide total und core-LV, wie anhand Lavenes Test für nichtparametrischen oder der F-test für parametrische Daten, wurde innerhalb der CCA-Reparatur-Gruppe deutlich reduziert. Das gesamte LV wurde in kortikalen und subkortikalen LV, zerlegt, wie in Abbildung 4 bdargestellt. Die kortikale Portion war deutlich weniger Variable in der CCA Repair Group, während der Sub kortikale Teil der Läsion zwischen den beiden Verfahren unberührt war.

Eine Kraft-Analyse zeigte, dass weniger Tiere pro Behandlungsgruppe erforderlich wäre, um eine 30 % Verringerung der LV nach MCAO mit CCA Reparatur im Vergleich zu den typischen CCA ligiert Verfahren zeigen, siehe Tabelle 1. Eine Übernahme der macht 1-β = 0,8 und Signifikanzniveau α = 0,05 und eine Vorhersage von 30 % Ermäßigung in der LV zwischen der hypothetischen Prüf- und Testanlagen Gruppen dienten für die Leistungsanalyse. Darüber hinaus wurde eine gleiche Varianz zwischen den Gruppen angenommen. Tabelle 1 zeigt die Anzahl der Tiere, die für die Prüfung erforderlichen und Kontrollgruppen, wenn entweder die typischen CCA ligiert Methode verwendet wird oder die aktualisierte CCA-Repair-Methode, wie hier beschrieben verwendet. Hinweis, die Testgruppe bezieht sich auf eine hypothetische behandelten Tiere und der Kontrollgruppe bezieht sich auf eine hypothetische Kontrollgruppe; Beide Gruppen würden MCAO unterziehen.

Abbildung 1: kombinierte Behandlung Analgesie und den Wegfall der ECA Ligatur auf Ergebnisse nach MCAO. (A) des Körpergewichts, dargestellt als Prozentsatz des Pre-MCAO Gewicht verringert den ersten 2 d nach der MCAO für beide Gruppen. Die ECA-unligated Gruppe (Analgesie behandelt mit keine ECA-Ligatur bei MCAO) zeigte einen Trend zu geringeren Gewichtsverlust am zweiten Tag nach der MCAO. (B) dieses Panel zeigt die Läsion Volumen (mm³) gemessen am standard Triphenyltetrazolium-Chlorid (TTC) 48 h nach der MCAO Färbung. Die angezeigten Daten sind der Mittelwert ± Standardabweichung. ECA ligiert: n = 17, erh unligated: n = 10. Diese Zahl wurde von Trotman-Lucas Et Al. modifiziert ¹¹. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Schaltplan zeigt die Standardmethode der CCA und der alternative CCA Reparatur Methode nach MCAO. (A) dieser Schaltplan zeigt eine dauerhaft aufgespaltenen CCA mit nicht auflösbare Nähte angewandt auf beiden Seiten von der CCA-Schnitt, was zu der ständigen Ligatur des richtigen CCA. (B) dieser Schaltplan zeigt die alternative Reparaturmethode CCA. Eine kleine Gewebe Pad beschichtet mit Fibrinogen und Thrombin Versiegelung dient zur Deckung des CCA-Schnitt, Versiegelung, um die volle Perfusion des Rechts CCA ermöglichen. Diese Zahl wurde von Trotman-Lucas Et Al. modifiziert ¹¹. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: regionale zerebrale Blut (rCBF) Strömungsparameter nach MCAO. Der rCBF geändert 5 min nach der MCAO Filament Entfernung für beide die CCA ligiert und CCA repariert Gruppen (Post-MCAO), im Vergleich zu der rCBF während MCAO gemessen. Dieses Fenster zeigt die rCBF Daten unmittelbar vor der CCA Schiff Reparatur (vor Reparatur) und 5 min nach dem CCA-Reparatur (Post-Reparatur). Deutliche Zuwächse in der rCBF werden 5 min nach dem Filament entfernen (Post-MCAO) in beiden Gruppen angezeigt. Eine zusätzliche Steigerung der rCBF zeigt nach der CCA-Reparatur (Post-Reparatur) in der CCA Repair Group. Keinen Unterschied in der rCBF wird zwischen 5 min Post-MCAO und vor Reparatur angezeigt. Die angezeigten Daten werden aus den analysierten Zeitverlauf Daten Schlüsselzeit Meldepunkte, hier als Mittelwert ± Standardabweichung verdichtet. CCA ligiert: n = 10, CCA repariert: n = 10; P < 0,01, ***P < 0,001, ns: nicht signifikant. Diese Zahl wurde von Trotman-Lucas Et Al. modifiziert ¹¹. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: Analyse der Läsion Volumen durch MRT-Verfahren erhalten. (A) dieses Panel zeigt die Läsion Volume (LV; mm³) 48 h nach MCAO, das gesamte LV T2-gewichteten MRT-Aufnahmen (Total LV) entnommen und der Kern-LV DTI Scans und Analyse (Core LV) entnommen. Repräsentative Bilder zeigen das gesamte Läsion Volumen aus einem T2 Scan Scheibe Bild mit der DTI Kern Läsion Volume Maske angewendet. Die Variabilität innerhalb der Gruppen war für beide das gesamte LV deutlich reduziert (P = 0,015, CCA Reparatur: n = 10, CCA ligiert: n = 10, F-test) und dem Kern LV (P = 0,043, CCA Reparatur: n = 9, CCA ligiert: n = 6, Lavene Test), mit Hilfe von einem F-Test für parametrische Daten oder Levene Test für nicht-parametrische Daten. (B) dieses Panel zeigt die LV 48 h nach MCAO, T2-gewichteten MRT-Aufnahmen entnommen und in kortikale und subkortikale Läsion Bereiche unterteilt. Die CCA-Reparatur deutlich reduziert die Variabilität der Daten (P = 0,03, F-test) im kortikalen Bereich der Läsion, aber keine Auswirkung auf die Daten zeigte Variabilität in den subkortikalen Teil der Läsion. CCA-Reparatur: n = 10, CCA ligiert: n = 10. Die angezeigten Daten sind der Mittelwert ± Standardabweichung. ^# P < 0,05 (F-test), ^XP < 0,05 (Lavene Test). Diese Zahl wurde von Trotman-Lucas Et Al. modifiziert ¹¹. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ansatz	Läsion Volumen (LV; mm3Mittelwert ± s.d.)	Macht	Signifikanzniveau	Anticiapted Unterschied	Die Größe der Gruppe erforderlich
CCA ligiert (traditionelle Ansatz)	94.08 ± 53,79	0,8	0.05	30 %	n = 58
CCA repariert (neues Konzept)	51,73 ± 22,78	0,8	0.05	30 %	n = 35

Tabelle 1: repräsentative Power-Analyse traditionelle CCA Ligatur mit dem Alternativen vergleichen CCA Reparatur Methode erklärt hier. Diese Tabelle zeigt die Power-Analyse durchgeführt, um die Berechnung der erwarteten Gruppengröße erforderlich, einen signifikanten Unterschied in der LV zwischen einer Kontrollgruppe, die traditionellen oder Alternativen (neu) Ansatz und eine Testgruppe (vorhergesagt) zu erkennen. Die Tabelle zeigt die Gruppe als Größen erforderlich, wenn eine Leistung von 0,8 wird davon ausgegangen, einem Signifikanzniveau von 0,05 wird angewendet, und wenn die vorhergesagten Testgruppe eine Differenz von 30 % in zeigt die LV im Vergleich zu der Kontrollgruppe. Die Tabelle zeigt die Ergebnisse für beide MCAO Ansätze (CCA-ligiert und die CCA-repariert) um festzustellen, ob es einen Unterschied in der Anzahl der Tiere erforderlich gibt, um eine Differenz von 30 % in der LV zu gewinnen Bei beiden Methoden wird eine gleiche Varianz zwischen dem Test und der Kontrollgruppe angenommen. Diese Zahl wurde von Trotman-Lucas Et Al. modifiziert ¹¹.

Diskussion

Filament Induktion von transienten MCAO bei Nagern ist die am häufigsten verwendeten experimentellen Schlaganfall-Modell, wie es Reperfusion auf die betroffene Stelle, imitiert das Auftreten von Ereignissen, die nach klinischen ischämischen Schlaganfall⁷ermöglicht. Hier berichtet, ist eine chirurgische Alternative zur traditionellen Methode der Filament-induzierte vorübergehende MCAO bei Mäusen. Der alternative Ansatz, eine reduzierte LV-Variabilität beim mittels MRI und histologische Färbung Methoden¹¹Analgesie Behandlung, ECA Ligatur Vermeidung und CCA Einschnitt Reparatur, Ergebnisse beteiligt.

Traditionelle Ansätze induzieren MCAO weitgehend verlassen auf die Durchtrennung oder am wenigsten Ligatur der ECA, die, bei Ratten gezeigt hat, Trinkverhalten und eine Erhöhung der Körper Gewichtsverlust nach der MCAO¹⁴beeinflussen. Das Protokoll definiert hier bei Mäusen, bei der Vermeidung von ECA Ligatur und Analgesie hinaus schlug einen Rückgang der Körper Gewichtsverlust nach der MCAO ohne Auswirkung auf die Lautstärke der Läsion. Die Verwendung der Analgesie ist vermieden oder zumindest nicht gemeldet, in der Mehrzahl der Studien experimentelle Schlaganfall, durch mögliche verwirrende Auswirkungen auf den experimentellen Ergebnissen. Allerdings Analgesie vollständig zu vermeiden ist nicht immer gerechtfertigt und es gilt, die Bedürfnisse der Wohlfahrt der Tiere mit der wissenschaftlichen Ziele auszugleichen.

Unterschiede in der Tiergröße, Dehnung und zerebrovaskuläre Anatomie, neben Filament Art und Größe werden alle vorgeschlagen, um Einfluss auf Schlaganfall Ergebnisse^23,24. Der hier beschriebene alternative Ansatz vermeidet die Abhängigkeit von der Kuh während Reperfusion, wodurch, mindestens im Teil, die Variabilität zwischen den Tieren in Läsion Band gesehen. Kuh-Anatomie ist sehr variabel in Mäusen, vor allem in der C57BL /₆ -Stamm, der häufig in experimentellen Schlaganfall Studien verwendet wird. 90 % der C57BL/6 Mäusen haben eine unvollständige Kuh durch eine abwechslungsreiche posterior kommunizierende Arterie (PcomA) Durchgängigkeit, die sich auf das Volumen der ischämischen Schäden, die durch die unzureichende Perfusion der Strukturen außerhalb der MCA Gebiet^13, auswirken ²⁵. Reparatur der CCA bei Mäusen, wie hier gezeigt, führt die Wiederherstellung des Blutes fließen über die CCA zum ischämischen Bereich, wie zuvor beschrieben in Ratten¹⁵. Die repräsentativen Daten hier zeigen, dass die Reparatur des CCA Reperfusion, erhöht zwar die Durchblutung in den CCA nicht direkt gemessen wurde. Es ist jedoch möglich, dass der Chirurg, der CCA-Reperfuse mit Blut nach der Schiff-Reparatur, zu visualisieren, wie es zu einem pulsierenden und vollständigen Zustand entlang dem Stamm proximalen und distalen an die Reparatur-Stelle zurück. Diese visuelle Bestätigung, zusammen mit Laser Doppler Flowmetry Lesungen von ischämischen Bereich kann verwendet werden, um die erfolgreiche Reparatur des Schiffes zu bestätigen. Die Zeit zwischen der Gewebe-Pad-Anwendung und die Entfernung von der Gefäß-Clip von der CCA können wirken sich auf die daraus resultierenden Durchgängigkeit des CCA, als Verkürzung der Zeit zwischen der Gewebe-Pad-Anwendung und die Clip-Entfernung wird verhindert, dass das Gewebe-Pad an der o Pposite Seite des CCA. Obwohl technisch anspruchsvoll, erfordert das alternative MCAO-Verfahren wird hier erklärt keine keine zusätzliche Fähigkeiten als erforderlich, um die chirurgische Induktion von MCAO bei Mäusen auszuführen.

Traditionell verbunden mit einer hohen Variabilität der Zielparameter, möglicherweise experimentelle Schlaganfall-Studien eine Tendenz zu schwach sein. Ethik und Tierschutz Anforderungen in Kombination mit wirtschaftlichen und praktischen Bedenken können zu Studien als untermotorisiert beitragen. Durch die Verringerung der Variabilität im Ergebnis und produzieren daher konsequenter Läsion Ergebnisse in einer experimentellen Gruppe, können effektivere macht Berechnungen mit dem letztendlichen Ziel der Studien entsprechend Betrieben durchgeführt werden.

Abschließend diese alternative CCA Reparaturablauf bei Mäusen, führt zu weniger Variabilität in der Läsion Volumen, nach experimentellen Schlaganfall und ermöglicht kleinere Versuchsgruppen zu Testzwecken eine Wirkung der Behandlung gegebenenfalls erforderlich macht Berechnungen dienen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7 mm flexible single fibre optic probe	Moor Instruments, UK	P10d	Use with master probe code: VP10M200ST
7-0 silicone coated monofilament	Doccol, USA	701956PKRe	Item dependent on animal size and weight - use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article.
9.4T Preclinical MRI system	Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA	MY11520101	Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging
Animal monitoring and gating equipment	SA Instruments, Stony Brook, New York, USA	22124005	MRI compatible temperature and respiration monitoring
Bupivacaine	National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK	512345	Marcaine
C57BL/6 Mice	Charles River, Oxford, UK	B6JSIMA49D
Carprofen	Norbrook Laboratories	143658	Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection
Chlorhexidine 4% hand cleanser solution	VWR International Ltd, Lutterworth, UK	MOLN10008780	HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care
Cotton buds	National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK	213512	Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving.
Dissecting stereoscope	Carl Zeiss	OPMI99	Resident piece of equipment. Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable.
dissolvable 6-0 sutures	National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK	9544	Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981)
Donut probe holder	Moor Instruments, UK	PHDO	Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine.
dumont #5 forceps	World Precision Instruments, Hertfordshire, UK	500342
Fibrinogen and thrombin sealant	Baxter, Berkshire, UK	1502243	TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2 mL
Gel food	Datesand group, Manchester, UK	72065022	Diet Gel Recovery
Image display and measuring software package	3D Slicer	https://www.slicer.org/	Version 4.0
Image display and measuring software package	NIH, Maryland, USA	https://imagej.nih.gov/ij/index.html	NIH/ImageJ
LDF monitor	Moor Instruments, UK	moorVMS-LDF
micro vannas scissors	InterFocus Ltd, Linton, UK	15000-08	Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required.
Microvascular clip	World Precision Instruments, Hertfordshire, UK	15911	10 G Vessel Clip
microvascular clip holders	World Precision Instruments, Hertfordshire, UK	14189
MRI acquisition and analysis software	Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA	VnmrJ Version 4.2	Revision A
no. 15 scalpel	Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK	INS4678	Sterile No15 Scalpel - manufactuer number P305. Other suppliers are available.
Non-disolvable 6-0 suture	National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK	W529	Ethicon Mersilk Sutures
Ocular lubricant	National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK	847288	Lacrilube (5100G13)
Optical matching gel	Moor Instruments, UK	PMG
Pulse Oximetry Reader	Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA	MouseOx	MouseOx - rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor Use with mouse thigh sensor.
Rehydration gel	Datesand group, Manchester, UK	70015022	HydroGel
Small hair clippers	vetproductsuk.com	HS61	Contura Cordless trimmer/clippers
Sterile 0.9 % NaCl Solution	VWR International Ltd, Lutterworth, UK	LOCA3528286	SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS
sterile Petri dish	VWR International Ltd, Lutterworth, UK	5168021	50 mm sterile Petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50 mm diameter is required.
Topical tissue adhesive	World Precision Instruments, Hertfordshire, UK	503763	GLUture topical Tissue Adhesive
Waterproof superglue	Loctite	Loctite Superglue Precision Max	Available at most hardware shops.
White paper chip	Datesand group, Manchester, UK	CS1BPB	Pure-O'Cel