Floresan-aktif hücre sıralama ile ınsan derisinden papiller ve Reiküler fibroblastların izolasyonu

Özet

Bu yazıda insan derisinden papiller ve retiküler fibroblastların yalıtımına yönelik FACS tabanlı bir protokol açıklanmaktadır. Eksplant kültürler aracılığıyla yaygın olarak kullanılan izolasyon protokolüyle kaçınılmaz olan in vitro kültürünü bozur. Yayılımlı fibroblast alt setleri işlevsel olarak farklıdır ve dermis içinde diferansiyel gen ifadesi ve lokalizasyonu görüntüler.

Özet

Fibroblastlar, birçok insan hastalığının patogenezine bulaşmış son derece heterojen bir hücre popülasyonlarıdır. İnsan derisi dermis, fibroblastlar geleneksel olarak Yüzeysel Papiller veya alt retiküler dermis histolojik lokalizasyonu göre atfedilir. Fare dermis, papiller ve retiküler fibroblastlar, fizyolojik ve patolojik süreçler ve ayırt edilebilir ayrı bir hücre yüzeyi Marker ifade profili ile ilgili fonksiyonları uzaklaşan ile iki farklı sırlardan kaynaklanır.

Daha da önemlisi, yüzeysel ve alt dermal tabakalardan gelen eksplant kültürlerinden gelen kanıtlar, en az iki fonksiyonel olarak farklı dermal fibroblastların, insan derisi dermis içinde de bulunduğunu göstermektedir. Ancak, fare derisinin aksine, farklı fibroblast alt kümeleri ayrımcılığı sağlayan hücre yüzey işaretçileri henüz insan derisi için kurulmadı. İki hücreli yüzey belirteçleri fibroblast aktivasyon proteini (FAP) ve thymocyte antijeni 1 (Thy1)/CD90 kullanarak floresan aktif hücre sıralama (FACS) yoluyla insan papiller ve retiküler fibroblast nüfus yalıtımı için yeni bir protokol geliştirdik. Bu yöntem, gen ifadesini etkilemek için gösterilen in vitro manipülasyon olmadan saf fibroblast alt kümeleri yalıtımı sağlar, böylece doku homeostazı veya hastalık açısından insan dermal fibroblast alt kümeleri doğru işlevsel analiz izin Patoloji.

Giriş

Bağ dokusunun ana hücresel bileşeni olarak, fibroblastlar öncelikle kollajen ve elastik liflerin birikmesi nedeniyle sonuç olarak hücre dışı matris¹oluşturur ve böylece, doku homeostasis, rejenerasyon ve uzun zamandır hafife alınmış bir hastalıktır. Ancak, fibroblastlar son zamanlarda araştırmacıların spot altında, çünkü onlar indüklenen pluripotent kök hücreleri için belirgin bir hücresel kaynak temsil sadece geldi² ama aynı zamanda onların yüksek plastisite ve karışması nedeniyle patogenezi organ fibrozis^3,4,5 veya cancer gibi çok sayıda hastalıklar^6,7.

İnsan derisi bir çok katmanlı epitelin oluşur, epidermis, ve temel bağ dokusu, dermis, hangi histolojik üst papiller ve alt retiküler dermis içine bölünebilir ve ağırlıklı olarak fibroblastlar oluşur ve hücre dışı matris⁸ ve hipodermis. Doku içindeki konumlarına göre, dermal fibroblastlar kabaca papiller ve retiküler fibroblastlara¹olarak sınıflandırılmıştır.

Önemlisi, son veriler bu dermal fibroblast alt nüfus sadece histolojik ayırt değil, aynı zamanda onların fonksiyon önemli ölçüde farklı olduğunu gösterir. Fare derinde, papiller ve retiküler fibroblastlar embriyogenesis sırasında iki farklı sırlardan ortaya çıkar⁹. Birkaç kanıt çizgisi, iki sırların sadece doku homeostasis, saç folikül morfogeni, yara tamiri ve fibrozis^7,9,10' da farklı roller gösterdikleri, ancak aynı zamanda farklı neoplastik epidermal kök hücrelerinden gelen sinyaller¹¹, kanser patogenezinde roller uzaklaşan düşündürmektedir. Rahat, her iki soylar yetişkin fare cilt karşılıklı olarak bağımsız hücresel işaretçileri ayrı bir dizi ifade, böylece saf dermal fibroblast nüfus yalıtımı ve kendi özel fonksiyonları sonraki geniş analiz etkinleştirme vitro^{9 , 11}' den itibaren.

Buna karşılık, farklı morfoloji ve fonksiyonları ile en az iki farklı fibroblast alt kümeleri, proliferasyon oranları uzaklaşan dahil, doku remodeling kapasiteleri^12,13, yanı sıra büyüme destek yeteneği Epidermal kök hücreler in vitro, insan derisi dermis için tanımlanmıştır^14,15. Ancak, insan dermal fibroblastlar üzerinde yayınlanan çalışmaların çoğu, deriüstü deriden gelen ekbitki kültürlerinden izole edilmiş karışık fibroblast nüfus kullanılarak yapılmıştır, çünkü belirli hücre yüzeyi işaretleyici setleri saf insan papiller izolasyonu sağlar ya da fare dermis benzetme retiküler fibroblast altnüfus henüz kurulamadı.

Son zamanlarda, insan derisi papiller ve retiküler fibroblastlar, ilgili alt kitlelerin floresan-aktif hücre sıralama (FACS)¹⁶: FAP ile yalıtımını sağlayan belirli hücre yüzeyi işaretçileri ile karakterize edildiğini göstermiştir. ⁺ CD90^- fibroblastlar, öncelikle üst dermis kısmında bulunan papiller fibroblastları temsil eder, daha yüksek proliferasyon oranları, farklı bir gen imzası ancak Adipojenik potansiyel yoktur. FAP⁺CD90⁺ ve FAP^-CD90⁺ fibroblastlar daha az proliferatif ancak kolayca Adipogenesis — retiküler fibroblastları için bir damgasını olan alt dermal bölmeler, retiküler soy aittir. Bu yöntem, sadece fizyolojik koşullar altında özel fonksiyonları değil, aynı zamanda deri kanseri dahil olmak üzere kutanöz hastalıkların patogenezi bağlamında bu farklı fibroblast alt kitlelerini kapsamlı bir şekilde incelemenizi sağlar.

Ancak, fibroblastlar iki boyutlu in vitro kültür^16,17,19, hücre yüzeyi Marker ifade değiştirmek bu yana, bizim protokol uygulama insan gelen primer fibroblastların yalıtım ile sınırlıdır dermis ve karma hücre kültürü nüfuslarında papiller veya retiküler fibroblastların tanımlanması izin vermez. Daha da önemlisi, hücre yüzeyi işaretleri içinde vitro değişikliklerin ifadesi olsa da, aşağıda açıklanan protokole göre izole fibroblast alt kümeleri¹⁶yetiştirilmiş zaman kendi özel işlevselliği korumak, böylece etkinleştirme göstermiştir fizyolojik veya patolojik koşullarda alt kümesine özgü özelliklerin in vitro çalışmaları.

Sonuç olarak, biz ilk kez Pure bir durumda insan cilt dermis saf fibroblast nüfusun yalıtım izin FACS aracılığıyla farklı fibroblast alt kümeleri yalıtım için bir protokol geliştirdik.

Protokol

İnsan derisi, 26 ila 61 yaş arası Kafkas erkek ve kadınlardan elde edilmiştir (Güneş korumalı deri; abdominal düzeltmeler, meme indirimleri). Yazılı bilgilendirilmiş hasta onayı, Helsinki beyannamesi uyarınca doku koleksiyonundan önce ve Viyana Tıp Üniversitesi Kurumsal Inceleme Kurulu onayı ile elde edildi.

Not: Biz işlevsel olarak ayrı fibroblast alt kitlelerin yalıtım için bir protokol sağlamak tam kalınlıkta dermis (lütfen Bölüm 1 bakın) veya farklı katmanları içine insan cilt dermis kesişim sonra (Bölüm 1 atlayın ve doğrudan Bölüm 2 bakın) .

1. tam kalınlık DermIS hazırlanması

1. Bir 10 cm x 10 cm insan cilt parçası (örneğin, abdominal düzeltmeler veya meme indirimleri), epidermis kalın filtre kağıt üzerinde aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
2. Epidermis forseps ile kenarları sıkıca tutun ve bir neşter ile subkutan yağ tabakası kapalı kazımak. Sonra bir petri çanak içine koyarak önce 5 mm genişliğinde şeritler içine doku dilim.
   Not: Bu dispase II nüfuz kolaylaştırır (bundan sonra enzim bunalımları olarak anılacaktır, Bölüm 3 bakın) ve epidermis tüm dermis ayrılmış olması gerekiyorsa kullanılır. Bu bölüm 2 atlamak için ve doğrudan Bölüm 3 bakın. Kontaminasyonu önlemek için, cerrahi kaldırma işleminden sonra dokuyu steril tutun veya etanol veya iyot çözeltisi ile iyice temizleyin. Eğer hiç, cilt yüzeyinin etanol tedavisi sadece küçük hücre ölümü neden olur. Bir doku kültürü akış kaputu steril koşullarda çalışır.

2. Insan derisi DermIS 'nin bir dermatomla papiller ve retiküler katmanlara bölünme

1. Kalın filtre kağıdında, epidermis yukarı bakacak şekilde 10 cm x 10 cm 'lik bir cilt parçası (örn. karın düzeltmeleri veya meme azaltmaları) yerleştirin. Derileri forseps ile kenarları sıkıca tutun.
2. Cilt yüzeyi ile ilgili olarak bir 90 ° açı olan bıçak ile, kendi kendine uzak dermatomun kafasını kaydırarak, 300 μm bir kesme kalınlığı/derinliği ayarlanmış bir elektrik dermatom ile cildi dilim.
3. Epidermis ve papiller dermis (300 μm kalınlığında, "dermal katman 1", Şekil 1 ve Şekil 2) oluşan ilk tabaka alın ve bir petri tabak koydu. Hemen Bölüm 3 ' e geçin veya dokuyu kurumadan tutmak için 1x PBS ekleyin.
   Not: Kontaminasyonu önlemek için, cerrahi kaldırma işleminden sonra dokuyu sterilize edin veya etanol veya iyot çözeltisi ile iyice temizleyin. Bir doku kültürü akış kaputu steril koşullarda çalışır.
   Dikkat: Bıçaklar çok keskin olduğundan dikkatli bir şekilde dermatomu ele.
4. Bir kesme kalınlığı 700 μm için dermatom ayarlama ve kalan dermis dilim 2,2 tekrarlayın. Üst reiküler dermis ("dermal katman 2", Şekil 2) olarak tanımlanan üst dilimi ayrı bir petri tabağına yerleştirin. Hemen Bölüm 4 ' e geçin veya dokuyu kurumadan tutmak için 1x PBS ekleyin.
5. Subkutan yağ katmanını, kalıntı alt retiküler dermal tabakasından (> 1000 μm) bir neşter ile uzaklaştırın ve atın. Alt retiküler dermis toplamak ("dermal katman 3", Şekil 2) başka bir petri çanak. Hemen Bölüm 4 ' e geçin veya dokuyu kurumadan tutmak için 1x PBS ekleyin.
   Not: Alternatif olarak, bir neşter ile yağ kapalı kazınma yerine, makas ile yağ tabakası çıkarın. Yağ uzağa kazıma önce buz üzerinde retiküler dermis koymak için yardımcı olabilir.

3. epidermis ve DermIS ayrılması

1. Steril 1x PBS 'de 3 U/ml bunalımları enzim (örn. dispase II) çözeltisi hazırlayın. 5 mm Cilt çizgili (Bölüm 1) veya epidermis/papiller dermis (adım 2,2), 10 ml 3 U/ml bunalımları enzim çözeltisi ile 10 cm Petri çanak yukarı dönük epidermis ile yerleştirin. 37 °C ' de Petri çanağını 1 saat boyunca inkulat.
   1. Protokol burada duraklatılmış olabilir. Epidermis/papiller dermis buzdolabında proteaz içinde 4 °C gece yerine inkübe. Gerektiğinde diğer katmanları saklamak (dermal katman 1, 2 ve 3) bir gecede 4 °C 50 mL tüpler içinde 1x PBS batırılmış.
      Dikkat: Proteaz ile dikkatlice çalışın, temas üzerine cilt ve gözleri tahriş edebilir.
2. Kuluçkenden sonra, epidermis/papiller dermis Petri çanak kuru kapağına transfer ve üst dermis epidermis ayırmak (dermal katman 1) her iki epidermis ya da dermis kenarı tutan Iki forseps ile.

4. dermal doku enzimatik sindirim

1. Her dermal tabakayı (dermal katman 1, 2 ve 3) ayrı olarak makas/neşter ile olabildiğince iyice Mince; küçük parçalar, daha iyi doku sindirimi.
   Not: Dermis tokluğu, kaynaklanan vücut parçasına (örneğin, karın veya üst kol derisi) bağlı olarak değişebilir.
2. Birleştirerek sindirim karışımı hazırlamak 1,25 mg/ml kolajenaz ı, 0,5 mg/ml kolajenaz II, 0,5 mg/ml kolajenaz IV ve 0,1 mg/ml hiyalüronidaz içinde Dulbecco modifiye kartal Orta (dmem) ile L-glutamin (bkz . malzeme tablosu), 10% fetal buzağı serumu ( FCS) ve 1% penisilin/streptomisin (P/S).
   Dikkat: Bu cilt ve gözler temas üzerine tahriş olabilir gibi kolajenazlar ile dikkatle çalışın.
3. Bir 50 mL tüp içine hazırlanan sindirim karışımı 10 mL ile kıyılmış dokuların her koyun ve kalıcı ajitasyon altında 1 saat için bir 37 °C sıcak su banyosunda inkük. Sindirim sırasında birkaç kez tüpler tersine çevirir.
   Not: Bir kıyılmış cilt parçasının boyutuna göre sindirim hacmi ayarlama düşünmelisiniz. Çok fazla doku ile 10 mL sindirim karışımı aşırı yüklenmez Aksi takdirde hücre verimi minimal olacaktır. Toplam hacim içinde doku üçte biri daha az tavsiye edilir (1:2 w/v).

5. tek hücreli süspansiyon ve eritrosit lizis hazırlanması

1. 10 mL fibroblast Orta (L-glutamin ile DMEM,% 10 FCS ve 1% P/S) sindirilmiş dokuya ekleyerek enzimatik doku sindirimi durdurun. Buradan buz üzerinde çalışın.
2. Düzenli steril Paslanmaz çay süzgeci ile her tüp içeriğini dökün ve temiz bir petri tabak hücre süspansiyon toplamak. Bir şırınga-pistonlu kenarı ile orta ve Mash sindirilmemiş doku parçaları ile süzgeci yıkayın.
3. Daha sonra, 70 μm hücre süzgeci ile 50 mL 'Lik bir tüpün içine pipet toplanan hücre süspansiyonu. Hücre süzgeci orta ile durulayın ve aynı tüp içine akışı toplamak.
4. 500 x g 'de 4 °c ' de 10 dakika santrifüj tüpler, 5 ml fibroblast orta ile süpernatant ve yıkama hücresi Pelet çıkarın ve atın. Santrifüjleme adımını tekrarlayın.
5. Kaldır ve süpernatant atın ve 1 ml kendinden Made ACK eritrosit lizis tampon içinde Pelet pelletini (0,15 M NH₄CL, 10 mm KHCO₃, 0,1 mm na₂EDTA; pH 7.2 \ u 20127.4). Hücreleri liziz tamponunun ortam sıcaklığında yaklaşık 1 dakika boyunca bırakın (20 \ u201222 °C).
6. % 10 FCS ile 9 ml 1x PBS ekleyerek lizis 'yi durdurun ve 5 dakika boyunca 4 °c ' de 500 x g 'de tekrar tüpleri santrifüjün. süper natant atın.
   Dikkat: Eritrosit lizin içinde inkübasyon süresi, lizis tamamlanmamış görünüyorsa (kırmızı Pellet) ayarlanabilir. Ancak, fibroblastlar ve bağışıklık hücrelerinin liziz önlemek için çok uzun süre eritrosit lizis tampon hücreleri bırakmayın.

6. FACS için engelleme ve boyama fibroblastlar

1. 5 μL insan FC-reseptör engelleme çözeltisi 100 μL 1x PBS ile 10% FCS ve pelletini hücreleri 100 μL insan FC engelleyici hazırlayın. 10 dakika boyunca buzun üzerinde inküyün.
2. İnsan dermal fibroblastlar lekelenme için bir FACS boyama paneli tasarlayın. Mix anti-insan FAP APC (1:20), anti-human CD90 AF700 (1:30), Anti-insan E-cadherin PE (1:20), Anti-insan CD31 FITC (1:30), Anti-insan CD45 Pasifik mavi (1:20), Anti-insan ITGA6 PE (1:20), anti-human CD235ab Pasifik mavi (1:1000) ve anti-insan CD106 Pasifik % 10 FCS ile 1x PBS mavi (1:100).
3. FC reseptör engelleme sonra, 3 dakika için 4 °c ' de 500 x g 'de hücreleri aşağı spin. kaldırma ve 100 μL antikor karışımı süpernatant ve pelletini hücreleri atın. Karanlıkta hücreleri 4 °C ' de 20 dakika boyunca inkübe etmek.
   1. Boyama öncesinde, lekelenmeli ve tek leke FACS kontrolleri için yüksek hücre numarasına sahip bir numunenin 20 μL 'i çıkarın.
4. 500 μL 1x PBS,% 10 FCS ve 3 dk için 4 °C ' de 500 x g 'de santrifüjler ile lekelenmiş hücreleri ve FACS kontrolleri iki kez yıkayın. Bu arada, ekleyin 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPı) 1x PBS ile 10% FCS son konsantrasyon yapmak için 1 μg/mL.
5. 200 μL dapi çözeltisi içinde supernatant, pelletini hücreleri çıkarın ve atın ve her hücre süspansiyonunu 70 μm hücre süzgeci ile 5 ml FACS tüpüne süzün.
   Not: FACS gecikme ile gerçekleştirilecek, DAPı ve filtre kısa bir süre önce kayıt ekleyin.

7. Insan dermal fibroblast alt yalıtım ve FACS için gating stratejisi

1. Kayıt akışı sitometri kontrolleri, doğru voltaj ayarlarını ayarlayın ve uygun tazminat gerçekleştirin. Tek hücreler için kapı ve canlı (DAPI^-), Pasifik MAVISI, PE ve fitc negatif hücreler (CD45^-, CD31^-, CD235ab^-, CD106^-, ITGA6^- ve E-CADHERIN^-) üç fibroblast nüfus almak için: FAP⁺ CD90^-, FAP⁺CD90⁺ ve FAP^-CD90⁺ hücreler. Bkz. Şekil 3.
2. Üç fibroblast alt kitlesi, RNA yalıtımı için 350 μL liziz tampon veya 350 μL fibroblast büyüme medyası ile dolu ayrı 1,5 mL vida kapağı mikrosantrifüjü borular içine sıralama ( malzeme tablosunabakın) hücre kültürü için. Sıralamayı hemen sonra invert tüpler ve ya lizis tampon tüpler sıvı nitrojen içine Snap dondurma için koymak veya buz orta tüpler koymak.
   Dikkat: 0,1% b-Mercaptoetanol ile lizis tamponunu duman kaputu ile hazırlayın ve inhalasyonu kaçının.

8. fibroblastlar ve Adipogenesis assay kültürü

1. FACS takipte, 500 x g 'de 4 °c ' de 3 dk ve plaka eşit hücre numaraları (5000 \ u201210, 000 hücre/iyi) fibroblast büyüme ortamında ( malzeme tablosunabakın) 48-Well hücre kültürü yemeklerinde aşağı doğru spin hücreleri. % 70 konfluency ulaşana kadar hücreleri büyümeye bırakın.
2. 5 μg/ml insülin, 5 μM troglitazon, 0,5 mm 3-isobutyl-1-methylxanthine (ıbmx) ve 1 μM dexametasone fibroblast büyüme orta eklemek adiposit farklılaşma orta hazırlamak
3. Kültürlü hücrelerin orta adiposit farklılaşma orta ile değiştirin ve hücreleri 14 gün ayırt edelim. 5 μg/mL insülin ve 5 μM troglitazon içeren azaltılmış Adipogenesis orta ile gün 2 sonra değişim ortamı. Her 3^RD veya 4 gün Orta doldurmak .
4. % 4 PFA olan hücreleri ortam sıcaklığında 20 dakika (20 \ u201222 °C) ayırt etme günü 14 ' de düzeltin. 60% izopropanol ile yıkayın kuyuları ve tamamen Buharlık izin. 5 mM yağlı kırmızı O (kullanım öncesi filtre) ile leke hücreleri 20 dk. damıtılmış su ile dört kez lekelenmiş hücreleri yıkayın. Mikroskopiye devam edin.
   Dikkat: PFA zehirli ve zararlı. Dikkatle ele.
   Not: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Sabit hücreler yağ kırmızı O boyama gerçekleştirilinceye kadar 4 °C ' de 1x PBS 'de depolanabilir. Buharlaşma önlemek için depolama önce parafin film ile kapak çanak.
5. İletilen ışık ile 10X büyütme ile ters mikroskopla suya batırılmış görüntü hücreleri.

Sonuçlar

Tek hücreli süspansiyon elde etmek için cilt dokusu işleme için ana adımlara genel bir bakış Şekil 1' de gösterilir, cildin dermatini gösteren (Şekil 1a), farklı dermal Katmanlar (Şekil 1B), subkutan yağ çıkarılması katman (Şekil 1C) ve epidermis ve papiller dermis ayrılması (Şekil 1D) yanı sıra manuel ve enzimatik doku ayrışma farklı adımlar (Şekil 1e, F). Şekil 2' de üç dermal katmanın bir şeması sağlanır.

Şekil 3 , insan derisinden farklı fibroblast alt kümeleri analizi için bir akış sitometri boyama panelinin gating stratejisini görüntüler. Fibroblastlar üzerinde ifade edilmeyen ek hücre yüzeyi işaretçileri, bağışıklık hücreleri, epidermal hücreler, mezenkimal kök hücreler (MSCs), kırmızı kan hücreleri veya endotel hücreleri gibi cilt içinde mevcut olan çeşitli hücrelerin hariç tutulması için maksimal saflık elde etmek izole nüfus. Bu fibroblast alt kitlelerin tanımlanması için Şekil 2 ' de kullanılan özdeş FACS panelini kullanmak önemli değildir, ancak bu bizim tavsiyemiz. Biri farklı floresan boyalar ile etiketlenmiş antikorlar kullanabilir veya dışlama işaretçileri kombinasyonunu değiştirebilir.

Bu protokol, insan derisinden farklı intradermal lokalizasyonu, gen ifadesi profilleri ve fonksiyonlar (Şekil 4) ile mevcut olan üç fibroblast nüfusunun tanımlanmasını sağlar. FAP⁺CD90^- papiller dermis içinde ZENGINLEŞTIRILMIŞTIR, ancak FAP⁺CD90⁺ ve FAP^-CD90⁺ retiküler dermis daha bol (Şekil 4A). Tüm üç alt nüfus hücre kültüründe sıralama üzerine tipik fibroblast morfoloji sergiler (Şekil 4b). İlginçtir, onlar retiküler fibroblastlar için bir damgasını adipositler ayırt yeteneğini ilgili farklı. Bu sonuçları, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR)¹⁶ (Şekil 4c) ile gen ifade profillemesi ile birleştirerek, FAP⁺CD90^- Cells ' i k i yüksek seviyelerdeki belirteçleri genel olarak atfedilen CD26, NTN ve PDPN gibi papiller fibroblastlar, CD90⁺ hücreler yüksek düzeyde CD36, ACTA2 ve PPARγ gibi bilinen retiküler belirteçleri ifade ederken, biz FAP⁺CD90^- hücrelerin papiller ve CD90 aittir sonuçlandırmak⁺ hücreler retiküler sıra aittir.

Resim 1: dermal tek hücreli süspansiyonun bozulmamış insan derisinden yalıtımı. (A) deri, papiller ve retiküler dermis içine elektrik dermatomu ile dilimlenir. (B) bitişik epidermis papiller dermis 300 μm kalınlığında (üst) ise üst retiküler dermis 700 μm kalınlığında (alt). (C) subkutan yağ tabakası bir neşter ile alt retiküler dermis kazınmış-kapalı. (D) 1 h Için 37 °c ' de dissosyasyon enzim çözeltisi içinde papiller dermis kuluçla sonra, epidermis kolayca forseps ile kaldırılabilir. (E) farklı dermal katmanlar makas ile kıyılmış ve bir enzim sindirim karışımı içine aktarılan kolajenaz ı, II ve IV ve hyaluronidaz. (F) 37 °c ' de 1 h ayrışma sonra, doku sindirimi durdu ve süspansiyon bir çay süzgeci ile sindirilmemiş cilt parçaları kaldırmak için dökülür. (G) hücre süspansiyonu bir kez daha 70 μm hücre süzgeci ile filtrelenir ve 4 °c ' de 500 x G 'de Santrifüjden sonra 10 dk (H) santrifüj yaptıktan sonra, hücre Pelet 1x PBS ile% 10 FCS ile yıkanır ve FACS boyama için hazırdır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: insan derisi dermis tabakasının bir dermatomla papiller ve retiküler katmanlara bölünme. Tam kalınlık derisini papiller dermis (epidermis dahil; 0 \ u2012300 μm; Dermal tabaka 1), üst reiküler (300 \ u20121, 000 μm; dermal katman 2) ve daha düşük reiküler dermis (> 1000 μm; dermal katman 3) içine dilimleyerek elde edilen üç dermal katmanı gösteren düzen Dermatom. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 3: insan dermal fibroblast alt nüfus IÇIN FACS gating stratejisi. (A\u2012e) İlk olarak, hücreler tek (B) ve uygulanabilir (DAPI^-) hücrelerinde (C) bulunur. İmmünolojik hücreler (CD45⁺), mezenkimal kök hücreler (CD106⁺), kırmızı kan hücreleri (CD235ab⁺) hariç tutulur (C) ve Pasifik mavisi negatif hücreler E-CADHERIN (ECAD) ve ITGA6 çift negatif hücrelerde (PE kanalı, D ). E-cadherin ve ITGA6 epidermal hücrelerde ifade edilen işaretler. Sonra, CD31-FITC pozitif hücreler (endotel ve lenfatik hücreler) hariç tutulur (D) üç fibroblast nüfus iki hücre yüzeyi fibroblast işaretçileri FAP ve CD90 ya bir veya her ikisini ifade sonucu: FAP⁺CD90^-, FAP⁺CD90⁺ ve FAP^-CD90⁺ (E). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 4: FAP⁺CD90^-, FAP⁺CD90⁺ ve FAP^-CD90⁺ fibroblastlar dermal lokalizasyonu, gen ifadesi ve işlevsellikle farklıdır. (A) papiller, üst retiküler ve alt retiküler dermis izole Gated FIBROBLASTLAR temsilcisi FACS araziler. Gating stratejisi Şekil 3' te açıklanmıştır. FAP⁺CD90^- fibroblastlar papiller dermis (% 19,2) içinde zenginleştirilmiştir düşük retiküler dermis (% 0,83) ile karşılaştırıldığında. FAP⁺CD90⁺ hücreler dermis boyunca bulunabilir ama onların en yüksek bolluk üst retiküler dermis (% 40,7) bulunmaktadır. FAP^-CD90⁺ alt retiküler dermis (% 64,4) zenginleştirilmiştir. (B) Not, her üç sıralanmış alt nüfus 7 gün (sol) için kültür üzerine tipik fibroblast morfoloji görüntüler. İlginçtir, bir Adipogenesis tahlil farklı davranır. Kültür 14 gün sonra, FAP +CD90^- adipositler ayırt etmeyin, FAP⁺CD90⁺ ve FAP^-CD90⁺ kolayca Adipogenesis geçmesi (sağ; Yağ kırmızı O lekeleri lipid taşıyan hücreler kırmızı). Ölçek çubukları = 1.000 μm. (C) doğrudan sıralanan FAP⁺CD90^- fibroblastlar, PAPILLER fibroblast işaretçileri CD26, NTN1 ve pdpn 'i ifade ederken, FAP^-CD90⁺ Cells Express CD36, ACTA2 ve PPARγ, bilinen retiküler soy tarafından ifade edilir. * p ≤ 0,05; p ≤ 0,0005 FAP⁺/Cd90^- hücrelere kıyasla; ^# p ≤ 0,05; ^{# # #} p ≤ 0,0005 FAP^-/CD90⁺ hücrelerine kıyasla. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Tartışmalar

Bu yazıda insan derisinden papiller ve retiküler fibroblastların yalıtımına yönelik bir yöntem açıklanmaktadır. CD90 dermal fibroblastların tanımlanması veya izolasyonu için yaygın olarak kullanılmıştır^18,20,21. Ancak, CD90 + fibroblastlar yanı sıra, insan dermis da bir CD90^- fibroblast nüfus, aktif fibroblastları ve kanser ilişkili fibroblastların için bir marker olarak kurulmuş olan FAP¹⁶, ifade liman olduğunu göstermiştir ( Cafs)^22,23,24,25. En önemlisi, biz üç fibroblast altnüfus FAP⁺CD90^-, FAP⁺CD90⁺ ve FAP^-CD90⁺ tüm sağlıklı insan bağış cilt biyopsilerinde belirlemek başardık. Bu nedenle, FAP sadece aktif fibroblastlar veya CAFs için bir marker değil, aynı zamanda normal doku fibroblastları sonucuna varırız.

Dikkat, yukarıda açıklanan dışlama uygulamadan sonra kalan FAP^-CD90^- Cell nüfus-ve gating stratejisi fibroblastlar içermez, çünkü bu hücreler fibroblast ekimi orta in vitro çoğalırlar değil, ama en Muhtemelen diğerleri arasında lenfatik hücreler ve perikayt dahil olmak üzere karma hücre nüfus¹⁶.

Yukarıda açıklanan protokol kullanılarak elde edilen hücre verimi, izolasyon için kullanılan cilt parçasının kaynaklı olduğu gövdeye bağlı olarak farklılık gösterebilir. Farklı vücut parçalarından DermIS yapısı, kalınlığı yanı sıra kollajen kompozisyon ile ilgili farklıdır. Örneğin, yüz veya üst koldan cilt, aynı zamanda sık kalın bir subkutan yağ tabakası görüntülemek göbek veya uyluk, cilt çok daha ince. Ayrıca, cilt bağış yaş ve seks daha da sadece doku ayrışma verimliliği etkisi olabilir, ama aynı zamanda üç fibroblast alt dağılımı etkileyebilir (Şekil 3) zaman tam kalınlık cilt izole. Bu, papiller dermis küçülür ve toplam fibroblast numaraları yaş^11,26,27,28ile azalma gerçeğini sonuçlanır. Ayrıca, papiller dermis hücre Pelet muhtemelen retiküler dermis daha büyük olacak, üst dermis daha yoğun retiküler dermis daha fibroblastlar tarafından doldurulan beri. Ayrıca, alt dermis da sert ve daha yoğun kollajen ile paketlenmiş, daha zor doku ayırmak ve fibroblastlar serbest bırakmak için yapım. Not, hücre Pelet çok kırmızı görünebilir, bu yüzden kırmızı kan hücresi liziz tavsiye edilir.

Bozulmamış insan derisi üç alt nüfus tanımlaması ek olarak, biz de bu dermatomed cilt, her fibroblast alt ya papiller veya retiküler dermis¹⁶zenginleştirilmiştir gösterir. Dermatomla cildin hassas dilimleme farklı dermal katmanlardan her alt nüfus uygun bir zenginleştirme elde etmek için önemlidir. Papiller dermis çok ince olduğundan, onu temsil eden dermatomed dilim 300 μm kalınlığı aşmamalıdır. üst retiküler ve alt retiküler fibroblastlar hem retiküler sırtı temsil eder, hem de benzer fonksiyonlar ve gen imzaları gösterir, Bu nedenle, bir de onları ayırarak düşünebilirsiniz.

Önemlisi, tüm üç fibroblastlar nüfus dermis boyunca bulunur ve sadece bir katmanda mevcut değildir, bu nedenle karışık fibroblast kültürlerde papiller veya retiküler dermis sonucu eksplant kültürler. Ancak, FAP⁺CD90^- papiller fibroblast papiller dermis en bol olan ve FAP⁺CD90⁺ ve FAP^-CD90⁺ fibroblastlar takip ederken yüzeysel bir gradyan alt dermal katmanları takip yüzeysel katmanlar¹⁶aşağı ters degrade. Ayrıca, papiller dermis CD90⁺ fibroblastların çoğunluğu neredeyse sadece kan damarlarını çevreleyen bulundu ve perivasküler fibroblast Marker CD146²⁹ifade, ve böylece muhtemelen daha farklı fonksiyonlar sergiler kalan CD146^- retiküler fibroblastlar¹⁶. CD146 bu nüfus dışlamak için gating stratejisinde ek bir marker olarak kullanılabilir.

Dermal katmanların kesilmesini takiben, yalıtılmış hücreler, bağışıklık hücrelerinin dışlama, endotel ve lenfatik hücreler, epidermal hücreler, eritrositler ve MSCs için çeşitli antikorlar içeren özel olarak tasarlanmış antikor kokteyli ile lekelenebilir saf fibroblast nüfus elde. Not, MSCS kimlik ve dışlama için bir marker seçimi yayımlanan msc işaretçileri yüksek sayıda nedeniyle zor olabilir^30,31. Bu yana MSCs Express CD90 gibi fibroblastlar, ek MSC işaretçileri gibi CD105 veya CD271 onların kimlik için yararlı olabileceğini kanıtlayabilirim. Ancak, MSCs sadece tüm dermal hücrelerin çok düşük bir yüzdesi temsil ve CD90⁺ fibroblastlar sıralama üzerine fibroblastların tipik morfolojik özellikleri görüntülemek beri, bir iddia olabilir farklı hücre yüzey Işaretçileri kullanarak MSCS dışlama gerekmez.

Önemlisi, biz (veri gösterilmez) sıralama sonra 7-14 gün için kültürdeki hücreleri tutarken FAP ve CD90 gen ifadesi analiz ve her iki işaretçilerin ifade ilgili sıralanmış tek pozitif (FAP⁺CD90^- veya updüzenlenmiş olduğunu bulundu FAP^-CD90⁺) hücreleri¹⁶. Bu nedenle, yukarıda açıklanan işaret setleri ve protokolünün, primer fibroblast alt setlerinin doğrudan dokudan yalıtılmasına izin vermelerinin dışında, daha önce kültürlü karışık fibroblast nüfusları dışında olduğunu vurguluyoruz.

Yine de, biz her üç alt nüfus işlevselliği hücre yüzey Marker ifade değişikliği ne olursa olsun hücre kültüründe korunur olduğunu göstermek, çünkü fibroblastlar FAP⁺CD90^- papiller fibroblastlar olarak sıralanması değil kültürden daha uzun bir süre sonra Adipogenesis geçmesi yeteneğini elde, Eğer fibroblastlar FAP⁺CD90⁺ veya FAP^-CD90⁺ retiküler fibroblastları adipositler farklılaştırmak için yeteneklerini korumak olarak sıralanmış ¹⁶ . Daha da önemlisi, papiller ve retiküler spesifik genler hala FAP⁺CD90^- ve CD90⁺ sırasıyla daha yüksek ölçüde ifade edildiğini bulduk.

Sonuç olarak, biz ilk kez insan cilt dermis saf ve naif fibroblast Sub, yalıtım ve analiz izin verir FACS aracılığıyla işlevsel olarak farklı fibroblast alt kümeleri yalıtım için bir protokol kurduk. Bu yöntem, üst ve alt dermis gibi yaygın olarak kullanılan fibroblast eksplant kültür yalıtım protokolüne büyük bir ilerleme kurar (i) papiller ve retiküler fibroblastların karşıt gradyanı deri yüzeyinden hipodermis ve (ii) fibroblastlar gen imzasını in vitro olarak değiştirir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material:
3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma	I5879
Ammonium chloride	Sigma	9718	used for selfmade ACK Lysis Buffer
Amniomax-C100 (1x) Basal Medium	Gibco	17001-074	used for fibroblast growth medium
β-Mercaptoethanol	Scharlau	ME0095	! CAUTION
C100 Supplement	Thermo Scientific	12556015	used for fibroblast growth medium
Collagenase I	Thermo Scientific	17100017	! CAUTION
Collagenase II	Gibco	17101015	! CAUTION
Collagenase IV	Sigma	C5138	! CAUTION
DAPI	Thermo Scientific	62248
Dexamethasone	Sigma	D8893
Dispase II	Roche	4942078001	! CAUTION
Dulbecco‘s Modified Eagle Medium + GlutaMAX	Gibco	31966-021
EDTA disodium salt	Sigma	E1644	used for selfmade ACK Lysis Buffer
Fetal bovine serum (heat inactivated)	Gibco	10500-064
Hyaluronidase	Sigma	H4272	! CAUTION
Insulin	Sigma	I5500
Isopropanol	Merck	1,096,341,011
OilRed O	Sigma	O-0625
Paraformaldehyd	Sigma	158127	! CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care.
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15070-063
Phosphate-buffered saline without Ca++ & Mg++	Lonza	BE17-512F
Potassium bicarbonate	Sigma	237205	used for selfmade ACK Lysis Buffer
PureLink RNA MicroKit	Invitrogen	12183-016
SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR	Invitrogen	11752
Taqman 2xUniversal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4324018	! CAUTION Skin and eye irritant.
Troglitazone	Sigma	T2573
Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow cytometry Antibodies:
anti human CD31-AF488	Biolegend	303109	Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075
anti human CD45-Pacific blue	Biolegend	304029	Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123
anit human CD49f/ITGA6-PE	Serotec	MCA699PE	Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833
anti human CD90/Thy-1-AF700	Biolegend	328120	Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302
anti human CD106-AF421	BD	744309	Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x
anti human CD235ab-Pacific blue	Biolegend	306611	Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153
anti-human E-cadherin-PE	Biolegend	147304	Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040
anti human FAP-APC	R&D	FAB3715A	Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x
Human TruStain FcX	Biolegend	422302	Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment:
1.4 mL micronic tubes	Thermo Scientific	4140
1.5 mL screw cap micro tube	Sarstedt	72,692,405
5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap	Falcon	352235
48-well cell culture cluster	Costar	3548
50 mL polypropylene canonical tubes	Falcon	352070
70 µm cell strainer nylon	Falcon	352350
Aesculap Acculan 3Ti Dermatome	VWR	AESCGA670
Aesculap Dermatome blades	VWR	AESCGB228R
MicroAmp Fast Optical 96well	Applied Biosystems	4346906
Primary cell culture dish	Corning	353803
Scalpel blades	F.S.T	10022-00
Tea strainer	x	x
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibroblast growth medium:
AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10 % FCS and 1 % P/S