Isolamento de fibroblastos papilares e reticular da pele humana por triagem celular ativada por fluorescência

Resumo

Este manuscrito descreve um protocolo FACS-baseado para a isolação de fibroblasto Papillary e reticular da pele humana. Contorna a cultura in vitro que era inevitável com o protocolo comumente usado da isolação através das culturas do explante. Os subconjuntos emanando do fibroblasto são funcionalmente distintos e indicam a expressão e a localização diferenciais do gene dentro da derma.

Resumo

Os fibroblastos são uma população de células altamente heterogênea implicada na patogênese de muitas doenças humanas. Na derme da pele humana, os fibroblastos têm sido tradicionalmente atribuídos à derme reticular superficial papilar ou inferior de acordo com a sua localização histológica. Na derme do rato, os fibroblasto Papillary e reticular originam de duas linhagens diferentes com funções divergentes a respeito dos processos fisiológicos e patológicos e de um perfil distinto da expressão do marcador da superfície da pilha por que podem ser distinguidos.

Importante, a evidência das culturas do explante das camadas cutâneas superficiais e mais baixas sugere que pelo menos duas linhagens dérmicas funcional distintas dos fibroblasto existam na derma da pele humana também. No entanto, ao contrário da pele do rato, marcadores de superfície celular que permitem a discriminação de diferentes subconjuntos de fibroblastos ainda não foram estabelecidos para a pele humana. Nós desenvolvemos um protocolo novo para a isolação de populações Papillary e reticular humanas do fibroblasto através da separação fluorescência-ativada da pilha (FACS) usando os dois marcadores de superfície da pilha proteína da ativação do fibroblasto (FAP) e antígeno 1 do Thymocyte (Thy1)/CD90. Este método permite o isolamento de subconjuntos de fibroblastos puros sem manipulação in vitro, o que demonstrou afetar a expressão gênica, permitindo assim uma análise funcional precisa de subconjuntos de fibroblastos dérmicos humanos em relação à homeostase ou doença tecidual Patologia.

Introdução

Como principal componente celular do tecido conjuntivo, os fibroblastos são os principais responsáveis pela deposição de colágeno e fibras elásticas que, em última instância, formam a matriz extracelular¹, e assim, seu papel na homeostase tecidual, regeneração e doença foi subestimada por um longo período de tempo. Entretanto, os fibroblasto vêm recentemente o projector dos investigadores, não somente porque representam uma fonte celular proeminente para pilhas de haste pluripotentes induzidas² mas igualmente por causa de sua plasticidade e implicação elevadas na patogénese de um grande número de doenças como a fibrose dos órgãos^3,4,5 ou câncer^6,7.

A pele humana é compor de um epitélio multi-camadas, da epiderme, e de seu tecido conexivo subjacente, a derma, que pode ser histològica subdividido no Papillary superior e na derma reticular mais baixa e é compor principalmente dos fibroblasto e matriz extracelular⁸ e a hipodermis. De acordo com sua posição dentro do tecido, os fibroblasto cutâneos foram classific aproximadamente em fibroblasto Papillary e reticular¹.

Importante, os dados recentes indicam que estas subpopulações dérmicas do fibroblasto são não somente histològica distinguíveis, mas igualmente que sua função é consideravelmente diversa. Na pele do rato, os fibroblasto Papillary e reticular levantam-se de duas linhagens distintas durante a embriogênese⁹. Várias linhas de evidência sugerem que as duas linhagens exercem papéis diferentes não apenas na homeostase tecidual, morfogênese do folículo piloso, reparo de feridase fibrose^7,9,10, mas também respondem a diferentes sinais de células-tronco epidérmicas neoplásicas¹¹, sugerindo papéis divergentes na patogênese do câncer. Convenientemente, ambas as linhagens expressam um conjunto distinto de marcadores celulares mutuamente exclusivos na pele de ratos adultos, permitindo assim o isolamento de populações de fibroblastos puros e a subsequente análise extensiva de suas funções específicas in vitro^{9 , onze}anos.

Correspondentemente, pelo menos dois subconjuntos distintos de fibroblastos com morfologia e funções distintas, incluindo taxas de proliferação divergentes, capacidades de remodelação tecidual^12,13, bem como a capacidade de apoiar o crescimento de células estaminais epidérmicas in vitro, têm sido descritas para a pele humana DermIS^14,15. No entanto, a maioria dos estudos publicados sobre fibroblastos dérmicos humanos foram conduzidos usando populações mistas de fibroblastos isoladas de culturas explantes de pele dermatomed, uma vez que conjuntos específicos de marcadores de superfície celular permitem o isolamento de puro humano papilar ou subpopulações reticular do fibroblasto na analogia à derma do rato estavam ainda para ser estabelecidas.

Nós demonstramos recentemente, que os fibroblasto Papillary e reticular da pele humana são caracterizados por marcadores específicos da superfície da pilha que permitem a isolação das subpopulações respectivas através da triagem celular fluorescência-ativada (FACS)¹⁶: FAP ⁺ CD90^- fibroblasto representam os fibroblasto Papillary situados primeiramente na derma superior, apresentando umas taxas mais elevadas da proliferação, uma assinatura distinta do gene mas nenhum potencial adipogênica. FAP⁺CD90⁺ e FAP^-CD90⁺ fibroblastos pertencem à linhagem reticular dos compartimentos dérmicos inferiores, que são menos proliferativos, mas prontamente submetidos à adipogênese — uma marca registrada para fibroblastos reticular. Este método permite estudar extensivamente estas subpopulações distintas do fibroblasto não somente em relação a suas funções específicas circunstâncias physiological mas também no contexto da patogénese de doenças cutaneous que incluem o cancro de pele.

Entretanto, como os fibroblastos alteram a expressão do marcador de superfície celular na cultura bidimensional in vitro¹⁶,¹⁷,¹⁹, a aplicação do nosso protocolo limita-se ao isolamento de fibroblastos primários de humanos derme e não permite a identificação de fibroblasto Papillary ou reticular em populações misturadas da cultura de pilha. É importante ressaltar que, embora a expressão de marcadores de superfície celular mude in vitro, demonstramos que os subconjuntos de fibroblastos isolados de acordo com o protocolo descrito a seguir mantêm sua funcionalidade específica quando cultivadas¹⁶, possibilitando assim estudos in vitro de propriedades específicas de subconjunto em condições fisiológicas ou patológicas.

Em conclusão, nós desenvolvemos um protocolo para a isolação de subconjuntos distintos do fibroblasto através de FACS que permite pela primeira vez a isolação de populações puras do fibroblasto da derma humana da pele em um estado ingénuo.

Protocolo

A pele humana foi obtida dos homens e das mulheres caucasianos envelhecidos 26 a 61 anos (pele sol-protegida; correções abdominais, reduções do peito). O consentimento informado por escrito do paciente foi obtido antes da coleta de tecido de acordo com a declaração de Helsínquia, e com aprovação do Conselho de revisão institucional da universidade médica de Viena.

Nota: Nós fornecemos um protocolo para a isolação de subpopulações funcionalmente distintas do fibroblasto da derma da espessura cheia (refira por favor a seção 1) ou após ter seccionamento a derma da pele humana em suas camadas diferentes (salte a seção 1 e refira diretamente a seção 2) .

1. preparação da derme de espessura total

1. Coloque uma parte da pele humana de 10 cm x 10 cm (por exemplo, de correções abdominais ou reduções de mama) com a epiderme virada para baixo em papel de filtro espesso.
2. Segure a epiderme firmemente em suas bordas com fórceps e raspar a camada de gordura subcutânea com um bisturi. Em seguida, corte o tecido em tiras de 5 mm de largura antes de colocá-los em uma placa de Petri.
   Nota: Isto facilita a penetração de Dispase II (referido como a enzima dissociar doravante, vê a seção 3) e é usado se a epiderme precisa de ser separada da derma inteira. Para esta seção de pular 2 e consulte diretamente a seção 3. Para evitar a contaminação, mantenha o tecido estéril após a remoção cirúrgica ou limpe-o completamente com etanol ou solução de iodo. Se em tudo, o tratamento do ethanol da superfície da pele causa somente a morte pequena da pilha. Trabalhe circunstâncias estéreis em uma capa do fluxo da cultura do tecido.

2. seccionamento da pele humana DermIS em camadas papilares e reticulares com um Dermatome

1. Colocar um pedaço de pele de 10 cm x 10 cm (por exemplo, a partir de correções abdominais ou reduções de mama) em papel de filtro espesso, com a epiderme virada para cima. Segure a pele firmemente em suas bordas com fórceps.
2. Fatie a pele com um dermátomo elétrico, ajustado a uma espessura de corte/profundidade de 300 μm, deslizando a cabeça do dermátomo longe de si mesmo, com a lâmina a um ângulo de 90 ° em relação à superfície da pele.
3. Tomar a primeira camada consistindo de epiderme e derme papilar (300 μm de espessura, "camada cutânea 1", Figura 1 e Figura 2) e colocá-lo em uma placa de Petri. Proceder imediatamente à secção 3 ou adicionar 1X PBS para evitar que o tecido seque.
   Nota: Para evitar a contaminação, mantenha o tecido estéril após a remoção cirúrgica ou limpe-o completamente com etanol ou solução de iodo. Trabalhe circunstâncias estéreis em uma capa do fluxo da cultura do tecido.
   Cuidado: Manuseie dermátomo cuidadosamente, uma vez que as lâminas são muito afiadas.
4. Repita a etapa 2,2 ajustando o dermátomo a uma espessura de corte de 700 μm e Fatie a derme restante. Coloque a fatia superior que é definida como a derme reticular superior ("camada cutânea 2", Figura 2) em uma placa de Petri separada. Proceder imediatamente à secção 4 ou adicionar 1X PBS para evitar que o tecido seque.
5. Raspar a camada de gordura subcutânea com um bisturi da camada dérmica reticular inferior residual (> 1000 μm) e descartá-la. Colete a derme reticular inferior ("camada cutânea 3", Figura 2) em outra placa de Petri. Proceder imediatamente à secção 4 ou adicionar 1X PBS para evitar que o tecido seque.
   Nota: Alternativamente, em vez de raspar a gordura fora com um bisturi, retire a camada de gordura com tesouras. Pode ajudar a colocar a derme reticular no gelo antes de raspar a gordura de distância.

3. separação da epiderme e derme

1. Prepare uma solução de dissociação da enzima 3 U/mL (i.e., Dispase II) em PBS 1x estéril. Colocar as riscas cutâneas de 5 mm (da secção 1), ou a epiderme/derme papilar (a partir do passo 2,2), com a epiderme virada para cima num prato de Petri de 10 cm com 10 mL de solução enzimática dissociadora de 3 U/mL. Incubar o prato de Petri a 37 ° c durante 1 h.
   1. O protocolo pode ser pausado aqui. Incubar a epiderme/derme Papillary na protease no refrigerador em 4 ° c durante a noite preferivelmente. Como necessário armazenar as outras camadas (camada dérmica 1, 2 e 3) durante a noite imerso em 1X PBS em 50 mL tubos a 4 ° c.
      Cuidado: Trabalhe com cuidado com protease, pode irritar a pele e os olhos em cima do contato.
2. Após a incubação, transferir a epiderme/derme papilar para a tampa seca da placa de Petri e separar a epiderme da derme superior (camada dérmica 1) com dois fórceps cada segurando a borda da epiderme ou derme.

4. digestão enzimática de tecido dérmico

1. Mince cada camada dérmica (camada dérmica 1, 2 e 3) separadamente com tesouras/bisturi tão completamente quanto possível; Quanto menor as peças, melhor a digestão do tecido.
   Nota: A dureza da derme pode variar dependendo da parte do corpo que origina (por exemplo, a pele do braço abdominal ou superior).
2. Prepare a mistura de digestão combinando 1,25 mg/mL de colagenase I, 0,5 mg/mL de colagenase II, 0,5 mg/mL de colagenase IV e 0,1 mg/mL de hialuronidase no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com L-glutamina (ver tabela de materiais), soro de bezerro 10% fetal ( FCS) e 1% penicilina/estreptomicina (P/S).
   Cuidado: Trabalhe cuidadosamente com colagenases, uma vez que estes podem irritar a pele e os olhos ao contacto.
3. Coloque cada um dos tecidos triturados com 10 mL da mistura de digestão preparada num tubo de 50 mL e incubar num banho de água quente de 37 ° c durante 1 h agitação permanente. Durante a digestão inverta os tubos várias vezes.
   Nota: Um deve considerar ajustar o volume da digestão de acordo com o tamanho da parte picada da pele. Não sobrecarregar 10 mL mistura de digestão com muito tecido caso contrário, o rendimento da célula será mínimo. Menos de um terço do tecido dentro do volume total é recomendado (1:2 w/v).

5. preparação de suspensão de célula única e lise de eritrócitos

1. Pare a digestão enzimática do tecido adicionando o meio do fibroblasto de 10 mL (DMEM com L-Glutamine, 10% FCS e 1% P/S) ao tecido digerido. Trabalhe no gelo daqui em diante.
2. Despeje o conteúdo de cada tubo através de um filtro de chá inoxidável estéril regular e recolher a suspensão celular em uma placa de Petri limpo. Lave o filtro com as partes de tecido não digeridas do meio e do mash com a borda de uma seringa-atuador.
3. Em seguida, a pipeta recolheu a suspensão da pilha através de um filtro da pilha de 70 μm em um tubo de 50 mL. Enxague o filtro da pilha com o meio e recolha o fluxo completamente no mesmo tubo.
4. Tubos de centrifugação a 500 x g a 4 ° c durante 10 min. Retire e descarte o sobrenadante e a pelota da célula de lavagem com um meio de fibroblastos de 5 ml. Repita o passo de centrifugação.
5. Retire e descarte o sobrenadante e ressuspender a pelota em 1 mL de tampão de lise de eritrócitos ACK self-made (0,15 M NH₄CL, 10 mm KHCO₃, 0,1 mm na₂EDTA; pH 7.2 \ u 20127.4). Deixar as células em tampão de Lise por aproximadamente 1 min à temperatura ambiente (20 \ u201222 ° c).
6. Pare de Lise adicionando 9 mL de 1X PBS com 10% FCS e centrifugue os tubos novamente a 500 x g a 4 ° c durante 5 min. descarte o sobrenadante.
   Cuidado: O tempo de incubação na lise do eritrócite pode ser ajustado se a Lise parece incompleta (pelota vermelha). No entanto, não deixe as células em tampão de Lise eritrocitária por muito tempo para evitar a lise de fibroblastos e células imunes.

6. bloqueio e coloração de fibroblastos para FACS

1. Preparar 5 μL de solução de bloqueio do receptor FC humano em 100 μL de 1X PBS com 10% de FCS e suspender as células em 100 μL de bloqueador FC humano. Incubar no gelo por 10 min.
2. Projetar um painel de coloração FACS para manchar fibroblastos dérmicos humanos. Misture o anti-Human FAP APC (1:20), CD90 AF700 (1:30), anti-humanos E-caderina PE (1:20), CD31 FITC (1:30), anti-humanos CD45 Pacífico azul (1:20), anti-humanos ITGA6 PE (1:20), anti-humanos CD235ab Pacífico azul (1:1000) e anti-humano CD106 Pacífico azul (1:100) em 1X PBS com 10% FCS.
3. Após o bloqueio do receptor FC, as células de rotação para baixo em 500 x g a 4 ° c durante 3 min. remover e descartar o sobrenadante e suspender as células em 100 μl de mistura de anticorpos. Incubar as células no escuro a 4 ° c durante 20 min.
   1. Antes da coloração, retire 20 μL de uma amostra com um número elevado de células para controlos FACS não manchados e de nódoas simples.
4. Lave as células manchadas e os controles FACS duas vezes com 500 μL 1X PBS com 10% FCS e centrifugue a 500 x g a 4 ° c durante 3 min. Entretanto, adicione 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) a 1X PBS com 10% FCS para fazer uma concentração final de 1 μg/mL.
5. Retire e descarte o sobrenadante, resuspente as células em 200 μL de solução de DAPI e filtre cada suspensão celular através de um filtro de células de 70 μm em um tubo FACS de 5 mL.
   Nota: Se FACS vai ser realizada com atraso, adicione DAPI e filtrar pouco antes de gravar.

7. estratégia de gating para o isolamento cutâneo humano do subconjunto do fibroblasto e o FACS

1. Controles de citometria de fluxo de registro, definir as configurações de tensão correta e executar a compensação adequada. Portão para células únicas e células vivas (DAPI^-), azuis do Pacífico, PE e FITC negativas (CD45^-, CD31^-, CD235ab^-, CD106^-, ITGA6^- e e-CADERINA^-) para obter três populações de fibroblastos: FAP⁺ CD90^-, FAP⁺CD90⁺ e FAP^-CD90⁺ células. Veja a Figura 3.
2. Classificar três subpopulações de fibroblastos em separado 1,5 mL tampão de rosca microcentrífuga tubos preenchidos com 350 μL de tampão de Lise para isolamento de RNA ou preenchido com 350 μL de meio de crescimento de fibroblastos (ver a tabela de materiais) para a cultura celular. Inverta os tubos imediatamente após a sorte e põr os tubos do tampão do lysis no nitrogênio líquido para a congelação instantânea ou põr os tubos médios no gelo.
   Cuidado: Prepare o tampão do lysis com 0,1% b-mercaptoethanol na capa das emanações e evite a inalação.

8. cultivo de fibroblastos e ensaio de Adipogênese

1. Após FACS, as células de rotação para baixo em 500 x g para 3 min a 4 ° c e placa de números de células iguais (5000 \ u201210, 000 células/bem) no meio de crescimento de fibroblastos (ver a tabela de materiais) em 48-poços de cultura de células de pratos. Deixe as células crescerem até atingirem 70% de confluência.
2. Adicionar 5 μg/mL de insulina, 5 μM de troglitazona, 0,5 mM 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) e 1 μM de dexametasona para meio de crescimento de fibroblastos para preparar o meio de diferenciação adipocíte.
3. Substitua o meio das pilhas cultivadas com o meio da diferenciação do adipócitos e deixe pilhas diferenciar-se por 14 dias. Meio de troca após o 2º dia com meio de adipogênese reduzido contendo 5 μg/mL de insulina e 5 μM de troglitazona. Reabasteça o meio a cada 3^RD ou 4^º dia.
4. Fixar as células com 4% de PFA por 20 min à temperatura ambiente (20 \ u201222 ° c) no dia da diferenciação 14. Lave os poços com 60% isopropanol e deixe evaporar completamente. Células de mancha com 5 mM de óleo vermelho O (filtro antes de usar) por 20 min. Lave as células manchadas quatro vezes com água destilada. Proceder para realizar microscopia.
   Cuidado: PFA é tóxico e prejudicial. Manuseie com cuidado.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. As células fixas podem ser armazenadas em PBS 1x a 4 ° c até que a coloração do óleo vermelho O seja realizada. Cubra o prato com a película da parafina antes do armazenamento para evitar a evaporação.
5. Células de imagem imersas em água com um microscópio invertido com ampliação de 10x com luz transmitida.

Resultados

Uma visão geral das principais etapas para o processamento do tecido cutâneo para obtenção de uma única suspensão celular é mostrada na Figura 1, exibindo a dermatação da pele (Figura 1a), diferentes camadas dérmicas (Figura 1b), remoção da gordura subcutânea camada (figura1C) e a separação da epiderme e da derme papilar (Figura 1D), bem como as diferentes etapas da dissociação manual e enzimática do tecido (Figura 1e, F). Um esquema das três camadas dérmicas é fornecido na Figura 2.

A Figura 3 exibe a estratégia de gating de um painel de coloração de citometria de fluxo para a análise de diferentes subconjuntos de fibroblastos da pele humana. Marcadores adicionais de superfície celular que não são expressos em fibroblastos permitem a exclusão de várias outras células presentes na pele, tais como células imunes, células epidérmicas, células-tronco mesenquimais (MSCs), glóbulos vermelhos ou células endoteliais para atingir a pureza máxima nas populações isoladas. Não é crítico utilizar o painel FACS idêntico utilizado na Figura 2 para a identificação dessas subpopulações de fibroblastos, porém esta é a nossa recomendação. Pode-se usar anticorpos rotulados com diferentes corantes fluorescentes ou alterar a combinação de marcadores de exclusão.

De notar, esse protocolo possibilita a identificação de três populações de fibroblastos na pele humana que apresentam diferentes localizações intradérmicas, perfis de expressão gênica e também funções (Figura 4). FAP⁺CD90^- são enriquecidos na derme papilar, enquanto FAP⁺CD90⁺ e FAP^-CD90⁺ são mais abundantes na derme reticular (figura 4a). Todas as três subpopulações exibem a morfologia típica de fibroblastos na triagem da cultura celular (Figura 4B). Curiosamente, eles diferem em relação a sua capacidade de diferenciar em adipócitos, que é uma marca registrada para fibroblastos reticular. Combinando estes resultados com o perfil da expressão de gene através da reacção em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR)¹⁶ (Figura 4C), mostrando que FAP⁺CD90^- Cells expressam altos níveis de marcadores comumente atribuídos a os fibroblasto Papillary tais como CD26, NTN e PDPN quando CD90⁺ Cells expressam os marcadores reticular conhecidos tais como CD36, ACTA2 e PPARγ em níveis elevados, nós CONCLUÍMOS que FAP⁺CD90^- Cells pertencem ao Papillary e ao CD90⁺ células pertencem à linhagem reticular.

Figura 1: isolamento da suspensão dérmica única de células da pele humana intacta. (A) a pele é cortada com um dermátomo elétrico na derma Papillary e reticular. (B) a derme Papillary com epiderme adjacente é 300 μm densamente (parte superior) quando a derma reticular superior for 700 μm densamente (parte inferior). (C) a camada gorda subcutaneous é raspado-fora da derma reticular mais baixa com um bisturi. (D) após a incubação da derme Papillary na solução da enzima da dissociação em 37 ° c por 1 h, a epiderme pode facilmente ser removida com fórceps. (E) diferentes camadas dérmicas são picadas com tesouras e transferidas para uma mistura de digestão enzimática consistindo de colagenase I, II e IV e hialuronidase. (F) após 1 h da dissociação em 37 ° c, a digestão do tecido é parada e a suspensão é derramada através de um filtro do chá para remover partes undiested da pele. (G) a suspensão celular é filtrada mais uma vez através de um filtro de células de 70 μm e centrifugada a 500 x G a 4 ° c durante 10 min. (H) após a centrifugação, o pellet celular é lavado com 1X PBS com 10% FCS e está pronto para FACS mancha. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: seccionamento da derme da pele humana em camadas papilares e reticulares com um Dermatome. Esquema mostrando as três camadas dérmicas obtidas cortando a pele cheia da espessura na derma Papillary (que inclui a epiderme; 0 \ u2012300 μm; camada cutânea 1), reticular superior (300 \ u20121, 000 μm; camada cutânea 2) e mais baixa derme reticular (> 1000 μm; camada cutânea 3) com um dermátomo. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: estratégia de gating de FACS para subpopulações cutâneas humanas do fibroblasto. (A\u2012e) Em primeiro lugar, as células são bloqueadas em células individuais (B) e viáveis (DAPI^-) (C). As células imunes (CD45⁺), as células-tronco MESENQUIMAIS (CD106⁺), as células vermelhas do sangue (CD235ab⁺) são excluídas (C) e as células do Pacífico azul negativo são fechadas mais adiante em e-caderina (ECAD) e ITGA6 células duplas negativas (canal PE, D ). E-caderina e ITGA6 são marcadores expressos em células epidérmicas. Em seguida, as células CD31-FITC positivas (células endoteliais e linfáticas) são excluídas (D) resultando em três populações de fibroblastos expressando um ou ambos os marcadores de fibroblastos de superfície celular FAP e CD90: FAP⁺CD90^-, FAP⁺CD90⁺ e FAP^-CD90⁺ (e). Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: FAP⁺CD90^-, FAP⁺CD90⁺ e FAP^-CD90⁺ fibroblastos diferem na localização dérmica, expressão gênica e funcionalidade. (A) parcelas representativas do FACS de fibroblastos fechados isolados de derme reticular papilífero, superior e inferior. A estratégia de gating é explicada na Figura 3. FAP⁺CD90^- fibroblastos são enriquecidos na derme papilar (19,2%) em comparação com a derme reticular inferior (0,83%). FAP⁺CD90⁺ células podem ser encontradas em toda a derme, mas sua maior abundância está na derme reticular superior (40,7%). FAP^-CD90⁺ são enriquecidos na derme reticular inferior (64,4%). (B) de nota, todas as três subpopulações classificadas exibem morfologia típica de fibroblastos na cultura por 7 dias (esquerda). Curiosamente, eles se comportam de forma diferente em um ensaio de adipogênese. Após 14 dias em cultura, FAP⁺CD90^- não se diferenciam em adipócitos, enquanto FAP⁺CD90⁺ e FAP^-CD90⁺ prontamente sofrem adipogênese (direita; O óleo vermelho O mancha as pilhas do lipido-rolamento vermelhas). Barras de escala = 1.000 μm. (C) classificados diretamente^{FAP +}CD90^- fibroblastos expressam os marcadores PAPILARES de fibroblastos CD26, NTN1 e pdpn, enquanto FAP^-CD90⁺ células expressam CD36, ACTA2 e PPARγ, conhecidos por serem expressa pela linhagem reticular. * p ≤ 0, 5; p ≤ 0, 5 em comparação com FAP⁺/Cd90^- Cells; ^# p ≤ 0, 5; ^{# # #} p ≤ 0, 5 em comparação com FAP^-/CD90⁺ Cells. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Neste artigo, nós descrevemos um método para a isolação de fibroblasto Papillary e reticular da pele humana. CD90 tem sido amplamente utilizado para a identificação ou isolamento de fibroblastos dérmicos^18,20,21. Entretanto, Nós demonstramos que além dos fibroblasto de CD90 +, a derma humana igualmente abriga uma população do CD90^- fibroblasto que expressa FAP¹⁶, que foi estabelecido como um marcador para fibroblasto ativados e fibroblasto cancro-associados ( CAFS)^22,23,^24,25. Importante, nós pudemos identificar três subpopulações de fibroblastos FAP⁺CD90^-, FAP⁺CD90⁺ e FAP^-CD90⁺ em biópsias de pele de todos os doadores humanos saudáveis. Nós concluímos conseqüentemente que FAP não é somente um marcador para fibroblasto ou CAFs ativados mas igualmente fibroblasto normais do tecido.

Da nota, a população de FAP^-CD90^- Cell restante após a aplicação da estratégia acima-descrita da exclusão-e da gating não contem fibroblasto, desde que estas pilhas não proliferam no meio do cultivo do fibroblasto in vitro, mas a maioria Provavelmente uma população de células mistas, incluindo células linfáticas e pericitos, entre outros¹⁶.

O rendimento celular obtido pelo uso do protocolo descrito acima pode variar dependendo do corpo-parte que a parte da pele usada para o isolamento se origina. Derme de diferentes partes do corpo difere em relação a sua estrutura, espessura, bem como a composição do colágeno. Por exemplo, a pele da face ou o braço superior é muito mais fina do que a pele da barriga ou da coxa, que também freqüentemente exibem uma camada de gordura subcutânea mais espessa. Adicionalmente, a idade e o sexo dos doadores de pele podem ainda não só impactar a eficiência da dissociação tecidual, mas também podem afetar a distribuição das três subpopulações de fibroblastos (Figura 3) quando isoladas da pele de espessura total. Isso resulta do fato de que a derme papilar encolhe e que os números de fibroblastos totais diminuem com a idade^11,26,^27,28. Além disso, a pelota da pilha da derma Papillary será provavelmente maior do que da derma reticular, desde que a derma superior é povoada mais densa por fibroblasto do que a derma reticular. Além disso, a derme inferior também é mais resistente e mais densamente embalado com colágeno, tornando mais difícil para dissociar o tecido e para liberar os fibroblastos. Da nota, a pelota da pilha pode aparecer muito vermelha, que é porque o lysis do glóbulo vermelho é recomendado.

Além da identificação de três subpopulações na pele humana intacta, nós igualmente mostramos que na pele dermatomed, cada subconjunto do fibroblasto está enriquecido na derma Papillary ou reticular¹⁶. O corte preciso da pele com o dermátomo é crítico para obter um enriquecimento adequado de cada subpopulação de diferentes camadas dérmicas. Uma vez que a derme papilar é muito fina, a fatia dermatomed que a representa não deve exceder uma espessura de 300 μm. os fibroblastos reticular e mais baixos reticular superiores representam a linhagem reticular e indicam funções similares e assinaturas do gene, Portanto, pode-se também considerar não separá-los.

Importante, todas as três populações dos fibroblasto são encontradas durante todo a derma e não estão exclusivamente atuais em uma camada, que é porque as culturas do explante da derma Papillary ou reticular resultam em culturas misturadas do fibroblasto. Entretanto, o fibroblasto de FAP⁺CD90 é o mais abundante na derma Papillary e segue um inclinação de superficial para abaixar camadas dérmicas quando FAP⁺CD90⁺ e FAP^-CD90⁺ fibroblasto seguem um gradiente inverso das camadas inferiores para as superficiais¹⁶. Além disso, a maioria de CD90⁺ fibroblasto da derma Papillary é encontrada quase exclusivamente vasos sanguíneos circunvizinhos e expressa o marcador perivascular do FIBROBLASTO CD146²⁹, e assim provavelmente exibe funções diferentes do que o fibroblastos CD146^- reticular remanescentes¹⁶. CD146 poderia ser usado como um marcador adicional na estratégia de gating para excluir esta população.

Após a dissociação das camadas dérmicas, as células isoladas são manchadas com um coquetel de anticorpos especialmente concebidos contendo vários anticorpos para a exclusão de células imunes, células endoteliais e linfáticas, células epidérmicas, eritrócitos e MSCs para obter populações puras de fibroblastos. De notar, a escolha de um marcador para a identificação e exclusão de MSCS pode ser complicada por causa do elevado número de marcadores MSC publicados^30,31. Desde que MSCs expressam CD90 como fibroblasto, os marcadores adicionais do MSC tais como CD105 ou CD271 poderiam revelar-se úteis para sua identificação. Entretanto, os MSCs representam somente uma porcentagem muito baixa de todas as pilhas dérmicas e desde que os fibroblasto de CD90⁺ indicam características morfológicas típicas dos fibroblasto em cima da classificação, se poderia argumentar que a exclusão de MSCS pelo uso de marcadores distintos da superfície da pilha pôde ser desnecessário.

Importante, nós analisamos a expressão de gene de FAP e de CD90 após ter mantido as pilhas na cultura por 7-14 dias após a classificação (dados não mostrados) e encontramos que a expressão de ambos os marcadores está upregulated no positivo único classificado respectivo (FAP⁺CD90^- ou FAP^-CD90⁺) células¹⁶. Nós conseqüentemente emfatizamos que os jogos e o protocolo acima descritos do marcador permitem a isolação de subconjuntos preliminares do fibroblasto diretamente do tecido mas não das populações misturadas previamente cultivadas do fibroblasto.

Não obstante, Nós demonstramos que a funcionalidade de todas as três subpopulações está mantida na cultura de pilha não obstante a alteração da expressão de marcador da superfície da pilha, desde que os fibroblasto classificados como FAP⁺CD90^- Papillary fibroblasto não Adquira a capacidade de sofrer adipogênese após um período mais longo de cultura, enquanto os fibroblastos classificados como FAP⁺CD90⁺ ou FAP^-CD90⁺ fibroblastos reticular mantêm sua capacidade de diferenciar em adipócitos ¹⁶ . Importante, nós igualmente encontramos que os genes Papillary e reticular-específicos são expressos ainda a uma extensão mais elevada em FAP⁺CD90^- e CD90⁺ respectivamente.

Em conclusão, nós estabelecemos um protocolo para a isolação de subconjuntos funcionalmente distintos do fibroblasto através de FACS que permite pela primeira vez a isolação e a análise de subpopulações puras e ingénuas do fibroblasto da derma humana da pele. Este método estabelece um avanço principal ao protocolo comumente usado do isolamento da cultura do explante do fibroblasto da derma superior e mais baixa como (i) um inclinação de oposição de fibroblasto Papillary e reticular existe da superfície da pele ao hipoderme e (II) os fibroblasto mudam sua assinatura do gene in vitro.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material:
3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma	I5879
Ammonium chloride	Sigma	9718	used for selfmade ACK Lysis Buffer
Amniomax-C100 (1x) Basal Medium	Gibco	17001-074	used for fibroblast growth medium
β-Mercaptoethanol	Scharlau	ME0095	! CAUTION
C100 Supplement	Thermo Scientific	12556015	used for fibroblast growth medium
Collagenase I	Thermo Scientific	17100017	! CAUTION
Collagenase II	Gibco	17101015	! CAUTION
Collagenase IV	Sigma	C5138	! CAUTION
DAPI	Thermo Scientific	62248
Dexamethasone	Sigma	D8893
Dispase II	Roche	4942078001	! CAUTION
Dulbecco‘s Modified Eagle Medium + GlutaMAX	Gibco	31966-021
EDTA disodium salt	Sigma	E1644	used for selfmade ACK Lysis Buffer
Fetal bovine serum (heat inactivated)	Gibco	10500-064
Hyaluronidase	Sigma	H4272	! CAUTION
Insulin	Sigma	I5500
Isopropanol	Merck	1,096,341,011
OilRed O	Sigma	O-0625
Paraformaldehyd	Sigma	158127	! CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care.
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15070-063
Phosphate-buffered saline without Ca++ & Mg++	Lonza	BE17-512F
Potassium bicarbonate	Sigma	237205	used for selfmade ACK Lysis Buffer
PureLink RNA MicroKit	Invitrogen	12183-016
SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR	Invitrogen	11752
Taqman 2xUniversal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4324018	! CAUTION Skin and eye irritant.
Troglitazone	Sigma	T2573
Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow cytometry Antibodies:
anti human CD31-AF488	Biolegend	303109	Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075
anti human CD45-Pacific blue	Biolegend	304029	Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123
anit human CD49f/ITGA6-PE	Serotec	MCA699PE	Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833
anti human CD90/Thy-1-AF700	Biolegend	328120	Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302
anti human CD106-AF421	BD	744309	Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x
anti human CD235ab-Pacific blue	Biolegend	306611	Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153
anti-human E-cadherin-PE	Biolegend	147304	Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040
anti human FAP-APC	R&D	FAB3715A	Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x
Human TruStain FcX	Biolegend	422302	Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment:
1.4 mL micronic tubes	Thermo Scientific	4140
1.5 mL screw cap micro tube	Sarstedt	72,692,405
5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap	Falcon	352235
48-well cell culture cluster	Costar	3548
50 mL polypropylene canonical tubes	Falcon	352070
70 µm cell strainer nylon	Falcon	352350
Aesculap Acculan 3Ti Dermatome	VWR	AESCGA670
Aesculap Dermatome blades	VWR	AESCGB228R
MicroAmp Fast Optical 96well	Applied Biosystems	4346906
Primary cell culture dish	Corning	353803
Scalpel blades	F.S.T	10022-00
Tea strainer	x	x
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibroblast growth medium:
AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10 % FCS and 1 % P/S