Öğrenme ve hafıza testleri için düşük maliyetli, koku-ödül ilişkilendirme görevi

Özet

Fizyolojik manipülasyonun uzun süreli ve kısa süreli hafıza üzerindeki farklı etkilerini araştırmak için koku ödüllü, ilişkisel bir öğrenme görevi kullanıldı.

Özet

İştah açıcı, çağrışımsal belleğin sağlam ve basit davranışsal paradigmaları, belleğin hücresel ve moleküler mekanizmalarıyla ilgilenen araştırmacılar için çok önemlidir. Bu yazıda, fizyolojik manipülasyonun (farmakolojik ajanların infüzyonu gibi) koku-ödül hafızasının öğrenme oranı ve süresi üzerindeki etkilerini incelemek için etkili ve düşük maliyetli bir fare davranış protokolü tanımlanmıştır. Tirozin kinaz reseptör aktivitesinin kısa süreli (STM) ve uzun süreli bellekte (LTM) diferansiyel rolünü inceleyen bir çalışmadan temsili sonuçlar sağlanmıştır. Erkek fareler, iki kokudan biriyle bir ödülü (şeker topağı) ilişkilendirmek üzere şartlandırıldı ve ilişkilendirme için hafızaları 2 veya 48 saat sonra test edildi. Eğitimden hemen önce, koku soğancığına (OB) bir tirozin kinaz (Trk) reseptör inhibitörü veya araç infüzyonları verildi. İnfüzyonun öğrenme hızı üzerinde herhangi bir etkisi olmamasına rağmen, OB'deki Trk reseptörlerinin blokajı, kısa süreli hafızayı (STM; 2 saat) değil, LTM'yi (48 saat) seçici olarak bozdu. LTM bozukluğu, kazma süresinin uzunluğu ile ölçülen azalan koku seçiciliğine bağlandı. Bu deneyin sonuçlarının doruk noktası, OB'deki Trk reseptör aktivasyonunun koku alma hafızası konsolidasyonunda anahtar olduğunu gösterdi.

Giriş

İlişkisel bellek oluşum mekanizmaları daha önce ağırlıklı olarak tek denemeli korku koşullandırma çalışmalarına dayanarak araştırılmıştır. Bununla birlikte, birçok sıradan görev tipik olarak daha karmaşık edinim modellerine sahiptir ve tekrarlanan karşılaşmalara dayanır. Bu protokolün amacı, çok denemeli iştah açıcı öğrenme ve hafızanın hücresel ve moleküler mekanizmalarını anlamak için kullanılan uygun maliyetli bir kemirgen davranış paradigması sağlamaktır.

Ana koku soğancığına (OB) bağlı koku öğrenme, çok denemeli iştah açıcı hafızanın incelenmesi için çeşitli avantajlar sağlar. Birincisi, OB'ye bağımlı anıların değişen süreleri vardır (STM, LTM ve orta süreli bellek¹) ve nöromodülasyon⁴, uzun süreli potansiyasyon⁵ ve yetişkin nörojenezi ^6,7,8 dahil olmak üzere beynin başka yerlerinde olduğu gibi aynı moleküler ^2,3 ve yapısal mekanizmaya dayanır. İkincisi, hipokampus gibi daha yüksek dereceli bölgelerin aksine, OB'ye bağımlı anılar, algısal ortamın deneyci manipülasyonları ile öğrenmeden sorumlu nöral devredeki değişiklikler arasında daha doğrudan bir yazışmanın gözlemlenmesine izin verir 8,9,10,11 . Bu yazıda, genel moleküler ve yapısal mekanizmaları incelemek için kullanılabilecek OB'ye bağımlı bir ilişkisel öğrenme ve bellek paradigması detaylandırılmıştır. Araştırmacıların, hafızanın hücresel ve moleküler mekanizmalarının incelenmesi için koku öğrenmenin avantajlarına erişmelerini sağlamak için geliştirilmiştir.

Son yayınımız^3'te, burada açıklanan protokol, iştah açıcı koku öğreniminin konsolidasyonunun OB içindeki Trk reseptör aktivasyonuna bağlı olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Aşağıdaki protokolde, davranışsal paradigmanın farklı deneysel ihtiyaçlar için ayarlanabileceği alanlar da tartışılmaktadır.

Bu çalışmada, kanülasyon sırasında 8 haftalık olan toplam 27 yetişkin erkek CD-1 faresi kullanıldı. Kesin grup dağılımları ve koku seti kullanımı için, önceki yayınımız^3'ün yöntemler bölümüne bakın. Erkek fareler östrojen seviyelerindeki büyük dalgalanmaları önlemek için kullanıldı, çünkü önceki araştırmalar¹² koku hafızasının artan östrojen seviyeleri ile arttığını gösterdi. Bu fareler her zaman 12:12 saatlik ters ışık/karanlık döngüsünde tutuldu ve suya erişimleri vardı. Davranışsal deneyler sırasında, farelerin diyetleri, onları serbest beslenme ağırlıklarının ~% 90'ında tutmak için sınırlandırıldı. Diyet kısıtlaması, davranışsal deneyin başlamasından 3 gün önce başladı. Aşağıda açıklanacağı gibi, aynı fare seti, hayvan kullanımını en aza indirirken uygun istatistiksel güç seviyelerine ulaşmak için farklı koku setleri ile sunulmaktadır. İstatistiksel analiz bölümü, bunun neden olabileceği rastgele varyansın nasıl hesaba katılacağını gösterir.

Protokol

Aşağıdaki protokol, Earlham College'daki IACUC'un hayvan bakımı yönergelerine uygundur.

1. Koku soğanı kanülasyonu

NOT: Bu ameliyatlar büyük kesiler yapılmasını gerektirmediği için steril teknik gerektirmez. Ancak, her kurum kendi gereksinimlerinde farklılık gösterebilir. Deneyciler bu ameliyatı bağışıklığı baskılanmış fare suşları üzerinde gerçekleştiriyorsa, ek hususlar gerekli olabilir. Toplamda, deneycilerin bu protokolü kullanmadan önce veteriner hekimleri ve hayvan bakım ekipleriyle tartışmaları ve her ameliyat arasında tüm aletleri temizlemeleri ve dezenfekte etmeleri teşvik edilir.

1. Kurulum sırasında, kanülleri ve vidaları dezenfekte etmelerini sağlamak için %32 klorheksidin içeren küçük bir beher veya Petri kabına batırın.
2. Fareleri saf oksijen içinde gaz halinde% 4 izofluran ile uyuşturun ve stereotaksik bir cihaza sabitleyin. Ameliyat sırasında, farelerin bir burun konisi yoluyla sağlanan% 1.5-2 izofluran anestezisi altında tutulduğundan emin olun. Ameliyat boyunca solunumu izleyin. Anestezi altındayken göz kuruluğunu önlemek için göz merhemi kullanın.
3. Fare sabitlendikten ve artık arka ayağın sıkı bir şekilde sıkıştırılmasına yanıt vermedikten sonra, kesi yüzeyini temizlemek için başın üst kısmını ovalamak için% 32 klorheksidin kullanın.
4. Daha sonra, başın üst kısmını rostralde lidokain (topikal analjezi) ile kaudal yöne ovalayın.
5. Temiz bir neşter bıçağı ile orta hatta tek bir kesi yapmak için sıkıca bastırın.
6. Stereotaksiye bağlı bir matkap kullanarak, bregmaya göre AP +26 mm, ML +/- 5.0 mm koordinatlarını kullanarak kılavuz kanül (0.75 G) için koku alma ampullerinin üzerine iki delik açın.
7. Serebellar oluşumun üzerine iki delik açın.
   NOT: Bu vidaların konumunun kesin olması gerekmez, orta hat boyunca simetrik olduklarından emin olun.
8. Vidaları serebellar oluşumun üzerindeki iki deliğe yerleştirin ve bu vidaları kafatasına sabitlemek için bir doku yapıştırıcısı kullanın.
9. Kılavuz kanülü (26 G) koku soğancıklarının üzerine açılan deliklere yerleştirmek için stereotaksik kullanın (adım 1.6). DV kanülünü 1.0 mm indirin.
10. Diş çimentosunu bir Petri kabında karıştırın. Diş çimentosunu kanülün etrafına yavaşça yığmak için küçük bir metal kepçe kullanın. 5 saniye kurumaya bırakın. Ardından, işlem sırasında kılavuz kanülü dışarı çekmemeye dikkat ederek stereotaksik cihazın kollarını çıkarın. Küçük bir kapak oluşana kadar diş çimentosunu tüm kesi boyunca yığmaya devam edin (Bkz. Şekil 1A).
11. Tıkanmayı önlemek için bu noktada kılavuz kanüle sahte tapalar yerleştirin.
12. Ameliyattan hemen sonra ağrıyı azaltmak ve rehidrat etmek için ketoprofen (0.2 mg / kg) ve salin (200 μL) enjekte edin. Ameliyattan sonra farelere yumuşatılmış yiyecek veya hidrojel sağlayın. Sternal yaslanmayı sürdürmek için bilinçlerini geri kazanana kadar fareleri gözetimsiz bırakmayın.
    NOT: Fareler de bu noktadan itibaren tek başlarına barındırılır.
13. Ameliyattan sonraki iki gün boyunca günde bir kez salin (200 μL) ve ketoprofen (0.2 mg / kg) enjekte edin.
14. Ameliyattan sonra 2 gün ve 5 güne kadar (gerektiğinde) fareleri tartın ve ağırlıklarını izleyin. Ağırlık iki veya üç gün içinde ameliyat öncesi seviyelere dönmezse, uygun besleme yöntemi hakkında veteriner hekime danışın.
15. Davranış eğitimine başlamadan önce farelerin en az 7 gün iyileşmesine izin verin.

2. İlişkisel ayrımcılık görevi

1. Infüzyon
   1. Farelere tirozin kinaz reseptör inhibitörü, K252a (50 μM; salin içinde% 5 DMSO) veya aracın (salin içinde% 5 DMSO) OB-spesifik infüzyonlarını uygulayın.
      1. İnfüzyonu farelerin OB'sine iki taraflı olarak verin. Çift enjektörlü bir pompa kullanarak 0,2 μL/dk infüzyon hızı ve 10 dakikalık toplam infüzyon süresi ile ampul başına 2,0 μL nihai hacim enjekte edin.
         NOT: Manipülasyonun zamanlaması, gerçekleştirilen davranışsal çalışmanın türüne bağlı olarak ayarlanabilir. Kesin infüzyon adımları her enjektör pompasına özeldir ve üreticinin kılavuzunda verilmiştir.
      2. Geri akışı engellemek ve difüzyonu teşvik etmek için enjektörleri doğumdan sonra yaklaşık 5 dakika kanüllerin içinde bıraktığınızdan emin olun. (yani, her infüzyon için toplam 15 dakika planlayın).
2. Koku setleri.
   1. Tüm koku maddelerini hafif mineral yağda, buhar basıncına dayalı önceden hesaplanmış bir oran kullanarak 1.0 Pa'lık kısmi bir basınca seyreltin (Tablo 1).
   2. Tablo 1'deki 5 ayrı koku çiftini kullanın (tablodaki sayılar, 1.0 Pa için 50 mL mineral yağda karıştırmak için μL cinsinden hacmi gösterir).
   3. Davranışsal adımlar (Bölüm 2.3 ve 3) sırasında kullanılacak kokulu kumu hazırlamak için, her 100 g oyun kumu için Adım 2.2.2'deki 1.0 Pa koku vericinin 400 μL'sini karıştırın.
3. Şekillendirme
   NOT: Fareler, aşağıda tarif edildiği gibi 10 günlük bir süre boyunca şekillendirilmelidir.
   1. Fareleri işlem odasına getirin ve ameliyattan sonra iyileşmeyi takip eden ilk iki gün boyunca günde 10 dakika boyunca tutun.
   2. 3. Günde, farelerin ev kafeslerine (+)-limonen kokulu kumla doldurulmuş ve her biri 5 mg kütle halinde yaklaşık 10 sükroz peleti ile doldurulmuş bir Petri kabı yerleştirin.
      NOT: Ödüllü koku olarak 1.0 Pa (+) - limonen (102 μL'yi 50 mL mineral yağda karıştırın) ve ödülsüz koku olarak sade mineral yağ (kokuları test etmek için seyreltici madde) kullanın. Monomoleküler koku vericilerin seçilmesi de önerilir, çünkü bunların fareler için yeni olma olasılığı yüksektir.
   3. 4. Günde hem kumu hem de peletleri yenileyin.
   4. 5. ve 6. günlerde, fareleri özel yapım davranış aparatına alıştırın, onları aparatın içine yerleştirin ve alanı keşfetmelerine izin verin (Şekil 1B,C). Aparatı standart bir ev kafesi ve iki kapak ve siyah bir merkez bölücü oluşturmak için poli (metil metakrilat) kullanarak yapın. Hem kapakların hem de orta bölücünün ev kafesinden 1-2 cm daha büyük olduğundan emin olun.
   5. Limonen kokulu kumdan bir Petri kabı ve mineral yağ içeren kumla başka bir Petri kabı hazırlayın. Hem 5. hem de 6. günde alıştıktan sonra, her iki kum tabağını da test odasına koyun ve ödül olarak hizmet etmek için limonen kokulu tabağa 10 sakaroz peletini karıştırın. Her fareyi 10 dakika boyunca test odasına yerleştirin ve ödül peletlerini özgürce keşfetmesine ve tüketmesine izin verin.
   6. 7. Günde, limonen kokulu ve mineral yağ kokulu kum içeren kapları davranışsal aparata yerleştirerek fareleri son test prosedürünün kısaltılmış bir versiyonuyla tanıştırın. Bu sefer merkez bölücüyü dahil edin.
      1. Limonen kokulu kumun üzerine tek bir ödül koyun ve fareyi dinlenme odasına yerleştirin.
      2. Fare dinlenme odasına yerleştirildikten sonra, farenin kum dolu tabakları araştırmak ve kazmak için test odasına girmesine izin vermek için orta bölücüyü kaldırın. Fareyi, ödül peletini aldıktan sonra veya 5 dakika geçtikten sonra dinlenme odasına geri koyun.
      3. Bu işlemi her bir fare için toplam 10 deneme için tekrarlayın. Rastgele bir sayı üreteci kullanarak ödüllendirilen yemeğin sol veya sağ tarafa yerleştirilmesini dengeleyin. Denemeler arasında dinlenme süresi yoktur.
   7. 8. Günde, 7. günün denemelerini tekrarlayın, ancak peleti aşamalı olarak kumun daha derinlerine ve daha derinlerine gömün.
      NOT: Çoğu fare, 8. gündeki 10^{. denemeye kadar} görünmeyen ödül peletini kazmalıdır.
   8. 9. Günde, sakaroz peletinin tam derin gömülmesi ve farelerin deneme başına 1 dakika boyunca test odasına sokulması ile her fare için deneme sayısını 20 denemeye çıkarın. Ödül için farelerin her iki tabağı da kazmasına izin verin.
   9. 10. Günde, her fare için 20 denemeyi tekrarlayın, ancak ödüllendirilmemiş tabağı kazarlarsa, ödüllü tabağı kazmadan önce bir sonraki denemeye başlayın. Ödüllü (limonen kokulu) tabağı ilk kez kazan farelerin, onları dinlenme odasına geri göndermeden önce ödül peletini almalarına izin verin.

3. Eğitim ve test

NOT: Fareler görünmeyen, kokuya bağlı ödül peletleri için güvenilir bir şekilde kazmaya başladıktan sonra, deney başlayabilir.

1. Antrenman
   NOT: Eğitim aşaması, şekillendirme tamamlandıktan iki gün sonra başlar ve her fare için 20 denemeden oluşur. Eğitimden önce, intrabulbar ilaç/araç infüzyonlarını hemen verin (infüzyon detayları için Bölüm 2.1'e bakınız) ve infüzyonları hemen takiben eğitime başlayın.
   1. Dinlenme odasına bir fare yerleştirin.
   2. Yeni bir koku çifti ile kokulu iki tabak kumu, tabaklardan birine bir ödül peletinin gömüldüğü test odasına yerleştirin.
   3. Test odası hazır olduğunda, opak bariyeri kaldırın ve fareyi test odasına yerleştirin. Fare önce ödüllendirilmemiş tabağı kazarsa, fareyi hemen dinlenme odasına geri koyun (bu denemeleri "0" olarak kaydedin). Fare önce ödüllendirici kokuyu kazarsa, peleti almasına ve dinlenme odasına geri koymasına izin verin. Bu denemeleri "1" olarak kaydedin. Deneme, fare ödülü almadan 1 dakika sürerse, fareyi dinlenme odasına geri gönderin.
   4. Bulaşıkları temizleyip yeniden doldurun ve bir sonraki denemeye başlayın. Aynı işlemi 20 deneme için tekrarlayın.
2. Test etme
   NOT: Bellek testi, araştırmacının ilgilendiği herhangi bir süre boyunca gerçekleştirilebilir. Bu deneyde, K252a'nın STM ve LTM üzerindeki diferansiyel etkisine olan ilgi göz önüne alındığında, eğitimden sonra iki ayrı fare grubu 2 saat (STM) veya 48 saat (LTM) test edildi.
   1. Eğitim için tarif edilenle aynı kokuları ve prosedürü kullanarak test yapın (Bölüm 3.1).
      NOT: Araştırma sorusuna bağlı olarak araştırmacının kontrol gruplarını dahil etmesi gerekebilir. Örneğin, daha önce yayınlanan deneyde, Trk reseptör blokajının hafıza konsolidasyonu üzerindeki etkileri incelenmiştir³. Bu nedenle, etkilerin geri alma ile etkileşime bağlı olmadığını göstermek için 252 saatlik testten önce bir kontrol grubuna K48a enjekte edildi.
3. İstatistiksel analiz
   NOT: Her adım için SPSS 22.0 sözdizimi örnek olarak Ek Dosya olarak verilmiştir.
   1. Doğrusal karışık etki analizini kullanarak istatistiksel analiz yapın. ANOVA'ların aksine, doğrusal karma efekt modelleri rastgele efektleri ve tekrarlanan ölçümleri daha iyi açıklayabilir.
   2. Bağımlı ölçüyü hesaplayın: "doğru oran". 3.1.3'ten, farenin ödüllendirici kokuyu ilk kazdığı denemelere "1" atandığını ve farenin ödüllendirici olmayan kokuyu ilk kazması durumunda "0" atandığını hatırlayın. Dört deneme bloğu oluşturmak için her beş denemede ortalama (TB; örneğin, deneme bloğu 1 veya TB1, deneme bloğu 1-5'in ortalamasıydı, deneme bloğu 2 veya TB 2, 6-10 denemelerinin ortalamasıydı ve benzeri).
   3. Bağımsız değişkenleri veya sabit etkileri ilaç grupları olarak ayarlayın (K252a veya Araç; Bölüm 2.1.1) ve deneme blokları (3.3.1'den itibaren). Aşağıdaki temsili sonuçlarda, her bir analiz için kullanılan değişkenler belirtilmiştir.
   4. Farelerdeki içsel davranış farklılıklarını ve birden fazla koku seti kullanmanın etkilerini telafi etmek için farenin içine yerleştirilmiş tek tek fare ve koku setini "rastgele efektler" olarak dahil edin.
   5. Doğru orantı üzerinde bir logit dönüşümü gerçekleştirin.
      NOT: Doğru orantı, sürekli, ilişkisiz bir bağımlı değişken değildir. Bu nedenle, doğrusal modeller için iki varsayımı ihlal eder. Bu nedenle, logit dönüşümü gerçekleştirilir.
   6. Tam model tarafından tanımlanan önemli etkileşimler üzerinde post hoc testler yapmak için tahmini marjinal araçları kullanın; Post hoc testte çoklu ikili karşılaştırmalar düzeltilmelidir. Tipik olarak Bonferroni veya Šidák kullanılır.

Sonuçlar

Açıklandığı gibi, bu protokol araştırmacıların bazı manipülasyonların öğrenme, STM ve LTM üzerindeki etkisini değerlendirmelerine olanak tanır. Tong ve ark., 2018^3'ten alınan örnek sonuçlar burada sunulmuştur. Sonuçlar, Trk reseptör blokajının seçici olarak LTM'yi inhibe ettiği, ancak öğrenmeyi veya STM'yi inhibe etmediği hipotezini desteklemektedir.

Şekil 2A , eğitim, STM testi ve LTM testinin şemalarını göstermektedir. İlk olarak, K252a infüzyonlarının bir koku-ödül ilişkisinin öğrenme oranını etkilemediği gösterilmiştir. Şekil 2B (Bölüm 3.1), hem K252a'nın hem de araç gruplarının Eğitimden öğrenme oranını göstermektedir. Doğrusal karma model kullanılarak yapılan istatistiksel analiz, ilaç grubu ve deneme bloğu (TB) olmak üzere iki sabit etki ile gerçekleştirildi; Fare ve fare içinde iç içe geçmiş koku seti rastgele efektlerdi. Testten elde edilen veriler (Bölüm 3.2) analize dahil edilmemiştir. Deneme bloğundan anlamlı bir ana etki görüldü (F (3, 183.692) = 43.735, p < 0.001), ancak ilaç grubundan (F (1, 85.685) = 0.132, p = 0.717) etki görülmedi ve anlamlı bir etkileşim olmadı (F (3, 183.692) = 0.111, p = 0.954). Šidák ayarlamasını kullanan post hoc testler, K252a ve araç gruplarının Eğitim sırasında deneme bloklarının hiçbirinde farklılık göstermediğini doğruladı (tüm karşılaştırmalar için p > 0.05). TB2, TB3 ve TB4, tüm karşılaştırmalar için TB1'den anlamlı derecede yüksekti (tüm durumlarda p ≤ 0.001), bu da her iki grubun da 20 Eğitim denemesinin sonunda koku-ödül ilişkisini başarıyla öğrendiğini gösterdi.

Daha sonra, infüzyonun STM ve LTM üzerindeki etkilerini incelemek için aynı analiz yapıldı ve Testten elde edilen veriler dahil edildi (Bölüm 3.2). İlaç grubu ile deneme bloğu arasında anlamlı bir etkileşim gösterdi (F(2, 77.558) = 4.043, p = 0.021), ilaç grubunun (F(1, 55.629) = 1.438, p = 0.236) veya deneme bloğunun (F(2, 69.979) = 1.360, p = 0.263) anlamlı bir ana etkisi yoktu. Belleği özel olarak incelemek için, Šidák düzeltmesi ile post hoc ikili karşılaştırmalar, Eğitimin son deneme bloğu (Bölüm 3.1) ile Testin ilk deneme bloğu (Bölüm 3.2) arasındaki farkları 2 (STM) veya 48 saat (LTM) sonra karşılaştırdı. Araçla aşılanmış fareler için, karşılaştırmalar, eğitimden sonra hem 2 hem de 48 saat sonra ilişkisel belleğin tutulduğunu gösterdi (eğitim performansı ile yapılan tüm karşılaştırmalar için p > 0.05). K252a ile aşılanmış fareler için, 2 saatlik testin (STM) ilk deneme bloğu, Eğitimin son deneme bloğundan farklı değildi (p > 0.05); Bununla birlikte, hafıza performansları 48 saat sonra önemli ölçüde daha düşüktü (p = 0.018). Ek olarak, 48 saatlik testteki hafıza, 2 saatlik testteki hafızaya (p = 0.009) ve 48 saatlik testteki araç grubunun performansına (p = 0.006) kıyasla önemli ölçüde azalmıştır. Araç ve K252a ile aşılanmış fareler arasında STM'de fark yoktu (p = 0.356). Sonuçlar, koku soğancığındaki Trk reseptörlerinin K252a inhibisyonunun, koku hafızasını seçici olarak bozduğunu, ancak kısa süreli olmadığını göstermektedir (Şekil 3).

Koku seti	Koku 1	Koku 2
1	pentanoik asit	bütanoik asit
	225.1	63.6
2	altıgen	heptanal
	11.1	35.3
3	propil asetat	bütil asetat
	3.1	10.9
4	2-oktanon	2-heptanon
	87.4	28.7
5	pentanol	hekzanol
	37.2	127.3

Tablo 1: Koku setleri için karıştırma hacimleri. Her satır, davranışsal adımlar için bir çift olarak kullanılabilecek iki koku gösterir. Örneğin, ilk "koku setini" kullanmak için pentanoik ve bütanoik asit karışımlarını yapın. Tablodaki sayılar, her kokunun 1.0 Pa konsantrasyonu için 50 mL mineral yağda karıştırılacak μL cinsinden hacmi gösterir. Eğitim ve test sırasında, bir Petri kabı pentanoik asit, diğeri bütanoik asit ile kokuluyacaktır.

Şekil 1: Kanülasyon yerleştirme ve davranışsal aparat. (A) Kanülün, diş çimentosu kapağının ve vidaların farenin kafasına göreceli konumunu gösterir. Kanülün iğnelerinin iki koku ampulüne ulaştığını, kaidenin kendisinin diş çimentosu kapağına gömüldüğünü unutmayın. Vidalar, serebellar oluşum üzerinde kafatasına açılan iki deliğe yerleştirilir. Vidalar beynin kendisine temas etmez, ancak diş çimentosu kapağı için kaudal bir ankraj görevi görürler. Şekil, çimento kapağını yapmak için göreceli boyutu göstermektedir. (B) Monte edilmiş davranış aparatını gösterir. Vücut, tipik bir fare ev kafesidir. Hava delikleri olan kapaklar pleksiglastan yapılmıştır. Merkez bölücü de siyah pleksiglastan yapılmıştır. Kapaklar, denemeler sırasında merkez bölücünün kaldırılması ve yerleştirilmesi için bir kanal görevi görebilecek kadar ağır pleksiglastan yapılmalıdır. (C) Davranışsal aygıtın bir tarafını gösterir. Kaldırma kolaylığı için orta bölücünün kafesten biraz daha uzun olduğunu unutmayın. Petri kum kapları kenar boyunca yerleştirilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Çalışma tasarımı ve öğrenme sonuçları. (A) Etüt tasarımının şemasını gösterir. STM ve LTM gruplarının bağımsız olduğunu unutmayın (yani farklı fare grupları). Blokların başındaki semboller, infüzyonların verildiği zamanı gösterir. (B) Eğitim sırasında Deneme 1-20 için doğru oranı gösterir. Sonuçlar, K252a ve araç gruplarının öğrenme hızlarında (çizgilerin eğimi) farklılık göstermediğini göstermektedir. Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını temsil ediyordu. Yıldız işaretleri, hem araç hem de K1a kohortları için TB252'e kıyasla doğru oranda önemli artışlar göstermektedir (tüm karşılaştırmalar için p ≤ 0.001). Bu rakam Tong et al. 2018,^{izin 3} ile. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Trk reseptör blokajının STM ve LTM üzerindeki diferansiyel etkileri. Hem STM hem de LTM Testinin Eğitim Blok 4 ve Deneme Bloğu 1 için doğru oranı gösterir. Yani, eğitim aşamasının son deneme bloğu sırasında doğru oranı karşılaştırmak için doğrusal bir karma model kullanılır (Şekil 2; Eğitim-TB4), kısa süreli (2 saatlik test) ve uzun süreli (48 saatlik test) hafıza testinin ilk deneme blokları (Test-TB1) sırasındakilere. Doğrusal karma modelin iki sabit etkisi vardı: ilaç grubu ve deneme bloğu (Eğitim-TB4, STM-TB1, LTM-TB1). Rastgele efektler, farenin içine yerleştirilmiş fare ve koku setiydi. Post hoc karşılaştırmalar, K252a farelerinin LTM'yi önemli ölçüde bozduğunu buldu (eğitim TB4 ile karşılaştırma; p = 0.018) ancak STM değil (p > 0.05). K252a ile aşılanmış farelerin LTM performansı, K252a ile aşılanmış farelerin STM'sinden (p = 0.009) ve araç farelerinin LTM'sinden (p = 0.006) önemli ölçüde daha düşüktü. Hata çubukları SEM'i temsil ediyordu. Bu rakam Tong et al. 2018,^{izin 3} ile. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya: İstatistiksel analiz için kullanılan sözdizimi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Tek denemeli korku koşullandırması, belleğin moleküler ve hücresel dinamiklerini incelemek için güçlü bir davranışsal protokoldür, ancak doğal öğrenmenin çoğu artımlıdır ve en iyi şekilde yukarıda tarif edilene benzer bir paradigma aracılığıyla modellenir. OB'deki Trk reseptörlerinin inhibisyonu, daha önce grup³ tarafından gösterildiği gibi, çok denemeli, iştah açıcı bir öğrenme paradigmasında koku hafızasının konsolidasyonunu engelledi. Bulgu, iştah açıcı ve caydırıcı öğrenmede nörotrofinler gibi moleküler mekanizmaların diferansiyel zamanlamasına ilişkin araştırmalar için yeni yollar açıyor.

Bu deney iki kritik bölümden oluşuyordu: (1) kanülasyon ve (2) ilişkisel ayrımcılık görevi (şekillendirme, eğitim ve test etme olarak alt bölümlere ayrılmıştır). Deneyciler bu protokolü kendi özel araştırma sorularına uyarlayabilirler. Örneğin, biz öncelikli olarak OB ile ilgileniyorduk ve kurulan bu protokol diğer OB çalışmalarına da rahatlıkla uygulanabilir. Diğer ilgi alanlarına sahip deneyciler için, bir pilot çalışmada infüzyon bölgelerini doğrulamak önemli olacaktır. Deneycilerin ayrıca infüze ettikleri şeyin yayılma oranını, uzamsal penetrasyonunu ve biyo-aktivite süresini de dikkate almaları gerekebilir.

Protokolde belirtilen şekillendirme adımları, bu protokolün yazarları tarafından yaygın olarak kullanılmıştır. Onlara tarif edildiği gibi bağlı kalmak, farelerin görevi zamanında öğrenmesini sağlamak için önemli görünmektedir. Diğer zaman çizelgelerini kullanarak, yazarlar fareler arasında göreve aşinalıklarında daha fazla farklılık gözlemlediler ve bu, tüm fareleri deneysel kokularla test etmek için bir kritere getirmek için ek eğitim anlamına geliyordu. Eğitim ve test için araştırmacı, araştırma ilgi alanlarına bağlı olarak, deneme sayısı, deneysel kokuların konsantrasyonu ve kokuların birbirine benzerliği konusunda esnekliğe sahiptir. Deney için kullanılan hayvan sayısını azaltmak için, açıkladığımız gibi, mümkün olduğunda birden fazla koku setinin kullanılmasını öneririz. Son analizde birden çok emir setinin kullanımının nasıl hesaba katılacağına ilişkin rehberlik için İstatistiksel Analiz bölümüne bakın. Prensip olarak, koku çiftinin benzerliği, ayrımcılığın zorluğunu ayarlamak için değiştirilebilir. Grup^3'ten daha önce yayınlanan çalışmada, koku çiftleri aynı fonksiyonel gruba sahip ancak birbirlerinden bir karbon uzunluğu ile farklı olan iki koku vericiden oluşmaktadır. Bu ayrımlar, iki veya daha fazla karbon uzunluğu ile farklılık gösteren çiftlerden daha zordur, ancak enantiyomerlerden daha kolaydır (örneğin, (+)-limonen ve (-)-limonen). Farklı fonksiyonel gruplardan gelen koku vericiler algısal olarak oldukça farklıdır. Cleland ve ark.¹³ , daha fazla uyaran varyasyonunu ve bunların belirli öğrenme parametreleri üzerindeki etkilerini tartışır.

Bu protokolün önemli bir sınırlaması, birden fazla hayvanın paralel olarak test edilebileceği otomatik ilişkisel öğrenme görevlerine kıyasla çok daha uzun zaman almasıdır. Belirli bir test için, bir araştırmacının bir fare için 20 denemeyi tamamlaması en az 20 dakika sürecektir. Bununla birlikte, protokolün finansal olarak daha erişilebilir olduğu ve birçok kurum için bir öncelik olduğu anlamına gelen bu otomasyon eksikliğidir. Daha da önemlisi, bu deney söz konusu olduğunda, bu protokolün davranışsal sinirbilime ilgi duyan lisans araştırmacılarını eğitmek için oldukça izlenebilir ve etkili olduğu bulunmuştur. Özellikle, bu öğrenciler araştırma katılımının olağan faydalarına ek olarak güçlü hayvan işleme becerileri geliştirirler.

Bu paradigmayı benimsemekle ilgilenen araştırmacılar birkaç parametreyi değiştirebilirler. En belirgin şekilde, mekanizmaların farmakolojik manipülasyonları çeşitlidir ve bu davranışsal protokol kemogenetik tekniklerle veya moleküler ve hücresel yolları manipüle etmenin çeşitli diğer yollarıyla (örneğin optogenetik) kullanılabilir. Paradigmanın kendisi, test edilen öğrenme ve hafıza türünü değiştirmek için ayarlanabilir. Örneğin, araştırmacılar öğrenme oranını kontrol etmek için sunulan iki kokunun benzerliğini ayarlayabilirler. Çalışmamız^3'te koku çiftleri, aynı fonksiyonel gruba sahip ancak birbirlerinden bir karbon boyu ile ayrılan iki koku vericiden oluşmaktadır. Bu ayrımlar, iki veya daha fazla karbon uzunluğu ile farklılık gösteren çiftlerden daha zordur, ancak enantiyomerlerden daha kolaydır (örneğin, (+)-limonen ve (-)-limonen). Farklı fonksiyonel gruplardan gelen koku vericiler algısal olarak oldukça farklıdır. Cleland ve ark.¹³, daha fazla uyaran varyasyonunu ve bunların belirli öğrenme parametreleri üzerindeki etkilerini tartışarak, daha benzer kokuların ayırt edilmesinin daha zor olduğu ve bu nedenle öğrenilmesinin daha uzun sürdüğü sonucuna varmıştır¹⁴. Bu manipülasyonlar aynı zamanda anıların gücünü de etkileyecektir. Bu bağlamda, araştırmacılar öğrendikten sonra hafızayı farklı zaman noktalarında test etmekle ilgilenebilirler. Örneğin, iki çalışma^15,16, tek denemeli caydırıcı bir öğrenme görevi için LTM kalıcılığında BDNF'nin rolünü inceledi. BDNF, TrkB'nin bir ligandıdır. Çalışmalar, öğrenmeden 12 saat sonra hipokampusta anti-BDNF antisens oligonükleotid infüzyonunun 7 gün sonra LTM'yi bloke ettiğini, ancak 2 gün sonra olmadığını gösterdi. Bu çalışma, ilk öğrenmeden sonraki moleküler mekanizmaların zaman ölçeğinin LTM'de ilginç ve henüz anlaşılmamış roller oynadığını göstermektedir. Bu makale, bu zaman ölçeklerinin araştırılmasına izin verecek bir davranışsal protokolü açıklamaktadır. Gelecekteki uygulama için ilgi çekici diğer parametreler, kullanılan fare modelini içerir. Örneğin, dişi memelilerin kokulara karşı daha yüksek bir duyarlılığa ve seçiciliğe sahip olması nedeniyle, öğrenme oranı, STM ve LTM'deki varyasyonları incelemek için gelecekteki çalışmalarda erkek fareleri (önemli ölçüde daha iyi çalışılmış bir nörobiyolojiye sahip)¹⁷ dişi farelerle değiştirmek ilginç olacaktır¹⁸. Tabii ki, kemirgen hastalık modelleri de bu protokol ile etkili bir şekilde kullanılabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double guide cannula	PlasticsOne	C235GS-5-1.5/SPC	Custom order
(-)-limonene	Sigma-Aldrich	218367-50G
(+)-limonene	Sigma-Aldrich	183164-100ML
2-hetanone	Sigma-Aldrich	537683
2-octanone	Sigma-Aldrich	O4709
5mg sucrose pellets	Test Diet	1811560	Custom size. Used for rewards
Butanoic acid	Sigma-Aldrich	B103500
butyl acetate	Sigma-Aldrich	402842
Dental Cement Powder (Coral)	A-M Systems	525000
Dental Cement Solvent	A-M Systems	526000
Double connector assembly	PlasticsOne	C232C
Double dummy cannula	PlasticsOne	C235DCS-5/SPC dummy dbl	Custom order
Double injector	PlasticsOne	C235IS-5/SPC	Custom order
Drill	Kopf Instruments	Model 1474 High Speed Stereotaxic Drill	This drill requires an additional "adaptor" piece in order to fit certain drill bits. We get by this problem by wrapping the drill bit with lab tape to increase the circumference of the drill it to fit. This may not be an option for surgeries requiring sterile technique.
Eye Ointment			Purchase from local pharmacy
Figure 1 illustration software	BioRender
heptanal	Sigma-Aldrich	W254002
hexanal	Sigma-Aldrich	115606
hexanol	Sigma-Aldrich	H13303
Infusion pump model 11	Harvard Apparatus	4169D	Used pumps available via American Instrument Exchange
Isoflurane	Santa Cruz Animal Health	sc-363629Rx	Vet prescription needed for order
K252a	Sigma-Aldrich	K2015	Mixed to 50uM in DMSO (5%)
Ketoprofen	Allivet	25920	Vet prescription needed for order
Lidocaine	Aspercreme		Purchased from Amazon
Mounting Screws	PlasticsOne	00-96 X 3/32
Mouse Anesthesia Mask	Kopf Instruments	Model 907 Mouse Anesthesia Mask	Used with the stereotaxic to allow oxygen and anesthesia while mouse in stereotax
Mouse Nose Adaptor	Kopf Instruments	Model 926 Mouse Adaptor	Used with the stereotaxic to allow for head of mouse to be secured.
Novalsan	Jeffers	41375
Pentanoic acid	Sigma-Aldrich	240370
pentanol	Sigma-Aldrich	138975
Petri dish glass bottoms	VWR	10754-804
Polycarbonate Café bottoms	Ancare	N10PCSEC	Use normal housing cages and custom fit a track in the middle to act as the track for an opaque plexiglass divider
propyl acetate	Sigma-Aldrich	537438
Quikrete Premium Play Sand			Purchase from local hardware store
Saline	Insight Needles	N/A	Sterile saline for drug mixing
Stereotaxic apparatus	Kopf Instruments	Model 902 Small Animal Stereotaxic Instrument
Testing chamber	Ancare	N10PCSEC	Our testing chambers are modified using the regular mouse housing cage. The manuscript details what was done.
Vetbond Tissue Adhesive	3M		Purchased from Amazon