JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokolün amacı kollajenaz kullanarak dokunun enzimatik sindirimi ile kolon lamina propria bulunan mononükleer hücreleri izole etmektir. Bu protokol, mononükleer hücrelerin verimli bir şekilde izolasyonuna olanak sağlar ve bu da sağlam immünhenototipleme için kullanılabilir tek bir hücre süspansiyonu ile sonuçlanır.

Özet

Bağırsak vücutta bağışıklık hücrelerinin en çok sayıda ev sahipliği yapmaktadır. Küçük ve kalın bağırsak bağışıklık sistemleri polis eksojen antijenlere maruz kalma ve güçlü mikrobiyal türetilmiş bağışıklık uyaranları yanıtları modüle. Bu nedenle bağırsak, crohn hastalığı ve ülseratif kolit, kemik sonrası greft-versus-host hastalığı (GVHD) gibi inflamatuar barsak hastalıkları ile sınırlı olmamak üzere birçok hastalıkta immün disregülasyon ve iltihabın önemli bir hedef alanıdır. ilik nakli (BmT) ve birçok alerjik ve enfeksiyöz durum. Gastrointestinal inflamasyon ve kolit Murine modelleri yoğun GI komplikasyonları çalışma ve ön klinik önleme ve tedavi için stratejiler optimize etmek için kullanılır. Bağırsaktan bağışıklık hücrelerinin izolasyon ve henotipik analizi ile bu modellerden toplanan veriler, gastrointestinal ve sistemik inflamatuar hastalıkların iyileştirilmesiiçin uygulanabilecek daha fazla bağışıklık anlayışı için önemlidir. Bu rapor, karışık silika bazlı yoğunluk gradyan arabirimi kullanarak kolondan mononükleer hücrelerin (MNC) izolasyonu için son derece etkili bir protokol açıklanmaktadır. Bu yöntem, önemli sayıda canlı lökositi izole ederken, enkazı kirleten enkazı en aza indirir, akış sitometrisi veya diğer yöntemlerle sonraki immün fenotitiplemesağlar.

Giriş

Gastrointestinal (GI) yolu öncelikle gıda besin işleme ve reabsorbsiyon adanmış olmasına rağmen, GI sistemi de vasküler bütünlüğü merkezi rolleri korur, lenfatik, ve sinir sistemleri ve çok sayıda diğer organların aracılığıyla mukozal ve submukozal bağışıklık sistemi1. GI bağışıklık sistemi gıda yabancı antijenlere sürekli maruz kalma nedeniyle hem gastrointestinal ve sistemik sağlık etkili bir role sahiptir, kommensal bakteriler, ya da işgal patojenler1,2. Böylece, GI bağışıklık sistemi patojenik antijenler uygun yanıt verirken patojenik olmayan antijenler tolere hangi hassas bir denge korumak gerekir1,2. Tolerans ve savunma dengesi bozulduğunda, lokalize veya sistemik immün disregülasyon ve inflamasyon hastalıkların sayısız neden oluşabilir1,2,3.

Bağırsak, vücuttaki tüm lenfoid hücrelerin en az %70'ini barındırır4. En primer immünolojik etkileşimler bağırsakta üç bağışıklık istasyonlarıen en az birini içerir: 1) Peyer's Patches, 2) İntraepitelyal lenfositler (IEL) ve 3) lamina propria lenfositler (LPL). Bunların her biri hızlabağırsak5 normal bağışıklık sorunlarına yanıt bağışıklık hücrelerinin karmaşık bir birbirine bağlı ağ oluşur . Muscularis mukoza üzerinde stroma sınırlı, gevşek yapılandırılmış lamina propria bağırsak mukozasının bağ dokusu ve villus için iskele içerir, vaskülatür, lenfatik drenaj, ve mukozal sinir sistemi, yanı sıra birçok doğuştan ve adaptif bağışıklık alt kümeleri6,7,8,9. LPL 2:1 yaklaşık oranda CD4+ ve CD8+ T hücrelerinden, plazma hücreleri ve miyeloid soy hücreleri, dendritik hücreler, mast hücreleri, eozinofiller ve makrofajlar6dahil olmak üzere oluşur.

Çeşitli hastalık durumları ile ilgili olarak bağışıklık disregülasyonu ve bağırsak iltihabı anlamada artan bir ilgi vardır. Crohn hastalığı ve ülseratif kolit gibi koşullar tüm kolonik inflamasyon10,11,12değişen düzeylerde tezahür . Ayrıca, allojenik kemik iliği nakli (allo-BMT) geçiren ilik veya bağışıklık sisteminin malign veya malign olmayan bozuklukları olan hastalar, klima rejimlerinden doğrudan toksisite dahil olmak üzere çeşitli kolit formları gelişebilir. BMT önce, 2) BMT ve 3 sonra immünsupresyon neden enfeksiyonları) greft-versus-host hastalığı (GVHD) BMT sonra dokularda donör allo-antijenlere tepki donör tipi T hücreleri tarafından tahrik13,14,15. Tüm bu post-BmT komplikasyonları bağırsakların bağışıklık ortamında önemli değişikliklere neden16,17,18. Önerilen yöntem fare kolon bağışıklık hücre birikiminin güvenilir bir değerlendirme sağlar ve, BMT sonra murin alıcılara uygulandığında, organ toleransı dahil hem donör ve alıcı bağışıklık hücreleri etkili bir tahsin kolaylaştırır19 ,20. Bağırsak iltihabı ek nedenleri maligniteler dahil, gıda alerjileri, ya da bağırsak mikrobiyom bozulması. Bu protokol kolon dan bağırsak mononükleer hücrelerin inerişimini sağlar ve değişiklikler ile, bu preklinik murine modellerinin herhangi bir ince bağırsak lökositler için.

"Bağırsak ve bağışıklık hücresi VE izolasyon" arama terimlerini kullanarak bir PubMed arama bağışıklık hücreleri ayıklamak için ince bağırsak sindirim yöntemleri açıklayan 200'den fazla yayınlar ortaya koymaktadır. Ancak, kolon için benzer bir literatür arama kolon bağışıklık hücrelerinin izolasyon belirten iyi kalibre protokolleri verir. Kolon daha kas ve interstisyel tabakaları vardır, çünkü bu daha zor tamamen ince bağırsak daha sindirimi için render olabilir. Mevcut protokollerin aksine, bu protokol özellikle diğer bakteriyel kollajenazlar olmadan Clostridium histolyticum kollajenaz E kullanır (Kollajenaz D / Kollajenaz I). Bu protokol kullanılarak, izole bağırsak mononükleer bağışıklık hücrelerinin (MNC) kalitesini koruyarak, sodyum versenaton (EDTA), Dispase II ve deoksiribonuklease I (DNAse I)21,22,23. Bu protokol daha fazla yönlendirilmiş çalışmalar için murine kolon canlı MNC tekrarlanabilir sağlam çıkarma sağlamak için optimize edilmiş ve kolon immünoloji sinması çalışmasına kendini ödünç vermelidir veya (modifikasyonlar ile) ince bağırsak24, 25. yıl.

Protokol

Tüm çalışmalar, Amerikan Derneği tarafından belirlenen veterinerlik standartlarını karşılayan Miami Miller Tıp Fakültesi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelenen ve onaylanan kemirgen araştırma protokolleri kapsamında yürütülmüştür. Laboratuvar Hayvan Bilimi (AALAS) için.

1. Çözümlerin Hazırlanması

  1. Tablo 1'de açıklandığı gibi, Kolon Tamponu, Silika Tabanlı Yoğunluk Ayırma Ortamı %100, Silika Tabanlı Yoğunluk Ayırma Ortamı %66, Silika Bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı %44, Kollajenaz E Sindirim Tamponu ve FACS Tamponu hazırlayın.
    1. Kolon Tampon'u işlemden bir gün önce hazırlayın ve gece boyunca 4 °C'de saklayın.
    2. İşlemden bir gün önce %100 Silika Bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı hazırlayın ve bir gece boyunca 4 °C'de saklayın ve prosedürün sabahı çözülmek için oda sıcaklığına yerleştirin.
    3. Oda sıcaklığında %100 Silika Bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı ve Kolon Tamponu kullanarak izolasyon sabahı %66 ve %44 Silika Bazlı Ayırma Ortamı hazırlayın.
    4. Uygun miktarda Clostridium histolyticum türetilmişKollajenaz E'yi ölçün ve işlemden önce bir gecede -20 °C'de saklayın. Ertesi sabah, Kollajenaz Sindirim Tampon türetmek için Kolon Tampon uygun hacimde çözünür. İşlem günü Kollajenaz Sindirim Tamponu ile tüm kuluçkalarda çözeltileri 37 °C'ye ısıtın.
  2. Protokol adımlarının tamamı için, bir santrifüjü 20 °C'de ve 859 x gdönüş hızını, frenler gradyan santrifüj için (0 yavaşlama) inaktive edilmiş olarak tutun. Yıkama adımları için standart yavaşlama ile 4 °C ve 859 x gdönüş hızı ayarlayın.

2. Kolon Hasat

  1. Fareyi CO2 boğulma yoluyla ötanazi yaparak AALAC onaylı onaylayıcı yöntemi uygulayın.
  2. Fareyi bir supine pozisyonda yerleştirin ve% 70 etanol ile kürk sprey. Büyük doku makası kullanarak, dikey bir orta hat kesi yapmak ve bozulmamış periton ortaya çıkarmak.
  3. İnce diseksiyon makası kullanarak peritonu açın. Bir tarafa ince bağırsak taşımak ve azalan kolon ortaya çıkarmak için forceps kullanın. Kolonrek en üst üste rektal kısmını maksimum olarak ortaya çıkarmak için azalan kolon üzerinde hafifçe yukarı çekin. Pelvis derin distal rektum kesin ve diseksiyon ve tek bir birim olarak tüm kolon kaldırmak, sekal kapak distal rektum dan.
  4. 50 mL polipropilen tüp içinde 20 mL soğutulmuş Kolon Tampon kolon aktarın.

3. Kolon Temizliği

  1. Bir nemlendirilmiş kağıt havlu üzerinde kolon yerleştirin ve makas veya forceps künt ucu ile bağırsak duvarına hafif basınç uygulayarak katı dışkı ayıklayın.
  2. Bir Petri kabına kolon yerleştirin ve 18 G künt dolgu iğnesi ile 10 mL şırınga kullanarak soğutulmuş Kolon Tampon 10 mL ile bağırsak floş.
  3. Bir Kolon Tampon nemlendirilmiş kağıt havlu kolon aktarın ve makas keskin ucu ile mezenter ve yağ kaldırın.
  4. Kalan kolon içeriğini yıkamak için elle ajitasyon 5-10 mL soğutulmuş Kolon Tampon ajitasyon dolu bir Petri kabında kolon yerleştirin. 2-3 kez tekrarlayın.
  5. Taze soğutulmuş Kolon Tampon dolu bir Petri kabında proksimal kolon (tek bir dikdörtgen açık kolon parçası üreten) daha kaslı rektal ucundan kolon longitudinally kesin. Varolan ortamı atın ve temiz soğutulmuş Kolon Arabelleği ile doldurun.
  6. Petri kabında şiddetle girdap ve her yıkama dan sonra soğutulmuş Kolon Tampon 5-10 mL değiştirerek 3 kez bağırsak yıkayın.
  7. Dikdörtgen kolon dokusunu Kolon Tamponu ile nemlendirilmiş bir kağıt havluüzerine yerleştirin ve yatay olarak dilimleyerek ve daha sonra küçük parçalara (3 mm x 3 mm kesitler) kesin.
  8. 50 mL polipropilen konik tüp içinde 20 mL soğutulmuş Kolon Tampon içine ince forceps kullanarak dikkatle kolon parçalarıtoplamak.
  9. Kolon parçaları 3 kez yıkayın, her yıkama 20 mL Kolon Tampon, şiddetle her ajitasyon arasında 30 s. her ajitasyon arasında tüp girdap tarafından, doku parçaları tüpün altına yerleşmek için izin. Dekant veya vakum her yıkama arasında aspirasyon sürecinde doku parçası kaybını önlerken supernatant aspire.
    NOT: Her yıkamadan sonra tüpü değiştirmeye gerek yoktur.

4. Kollajenaz Sindirim 1

  1. 50 mL polipropilen konik tüp içinde yıkanmış kolon parçaları kolajenaz Sindirim Tampon 20 mL ekleyin.
  2. Kapalı 50 mL tüpü 37 °C'de, 60 dk için 2 x g olarak belirlenen dönme hızı ile kuluçkaya yatan bir orbital shaker'a yerleştirin. gerekirse, hiçbir doku parçasının tüp dibine yerleşmemesini sağlamak için dönüş hızını kademeli olarak artırın.

5. Silika bazlı Ayırma Ortamı Gradyanları Hazırlayın

  1. 20 °C 'de (oda sıcaklığında) ve Kolon Tampon'da %100 Silika bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı kullanarak %66 ve %44 Silika bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı hazırlayın.
  2. 3 ayrı 15 mL polipropilen tüpün her birine %66 Silika bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamının 5 mL'sini dökün. Kolon başına 3 tüp hazırlayın. Bu, ayırma degradesini oluşturmak için daha düşük yoğunluklu ayırma ortamının katmanlandığı degrade yalıtım yordamının daha yüksek yoğunluklu tabanını oluşturur.
  3. Kullanıma kadar 20 °C'de saklayın.

6. Sindirimden Supernatant Koleksiyonu 1

  1. Kollajenaz Sindirim 1 tamamlandıktan sonra, 25 mL serolojik pipet kullanarak sadece supernatant toplayın ve temiz bir 50 mL polipropilen konik tüp içine yerleştirilen 40 μm gözenek filtrasyon kumaş hücresüzlük ile supernatant filtre. Mevcut doku parçalarını aspire etmemeye dikkat edin.
    NOT: Tüpte kalan görünür doku parçalarını saklayın. Bu ikinci kollajenaz sindirim (adım 8) geçirecek.

7. Quenching Kollajenaz Sindirim Tampon

  1. 50 mL polipropilen tüpü tamamen soğutulmuş Kolon Tampon ile doldurun.
    NOT: Kollajenaz 37 °C'de aktiftir; bu nedenle soğutulmuş tampon bu enzimin inaktive.
  2. Tüpü 4 °C'de 800 x g'da 5 dk santrifüj edin.
    1. Vakum aspirasyonu ile supernatant atın. Hücreleri 25 mL taze Kolon Tamponu ve santrifüj ile 800 x g'da 5 dk yıkayın.
    2. Taze soğutulmuş Kolon Tampon az 1 mL pelet resuspend.
    3. 50 mL polipropilen konik tüpü buz üzerine yerleştirin.

8. Kollajenaz Sindirim 2

  1. Adım 4 (Sindirim 1) adım 6.1'den kalan doku parçaları ile tekrarlayın.

9. Sindirim Sonrası Doku Ayrışması 2

  1. Doku parçalarını tüp ile 10 mL'lik şırınga arasında 18 G künt uçlu bir iğneyle şiddetle ileri geri temizleyin.
  2. Brüt doku parçaları veya enkaz görünür olana kadar devam, en az 7-8 tam pasajlar için bu floş tekrarlayın.

10. Filtre Hücreleri

  1. Doku ayrıştırma süspansiyonunu 40 m-pore filtrasyon lu kumaş hücresüzden temiz bir 50 mL polipropilen tüpe geçirin.
  2. Filtreye salınan hücreleri kurtarmak için filtrasyon kumaş hücreli süzgeçi 10 mL soğutulmuş Kolon Tamponu ile yıkayın.

11. Quenching Kollajenaz Sindirim

  1. Soğutulmuş Kolon Tampon ile jant 50 mL polipropilen konik tüp doldurun.
    NOT: Kolsonejenaz aktivitesinin söndürülmesini sağlamak için Kolon Tampon sıcaklığı önemlidir.
  2. 4 °C'de ve 800 x g'da 5 dk çevirin.
  3. Vakum aspirasyonu ile supernatant atın.
  4. 25 mL taze soğutulmuş Kolon Tamponu ileyıkayın, ardından 4 °C'de santrifüj, 5 dk için 800 x g.
  5. Vakum aspirasyonu ile supernatant atın.
  6. Havuz Kollajenaz Sindirim gelen resuspended pelet 1 (adım 7) adım 11.4 ilgili tüp.
  7. Tekrar Adım 11.4 (yıkama ve santrifüj).

12. Silika bazlı Yoğunluk Ayırma Ortam Gradyan Ayırma

NOT: Kollajenaz aktivitesinin hızlı bir şekilde söndürülmesini sağlamak için mümkün olan en kısa sürede 12-18 adımlarını gerçekleştirin.

  1. 11.7. adımdan sonra, her peletin 24 mL toplam %44'lük silika bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı'nda kolon başına yeniden askıya alınması.
  2. 10 mL serolojik pipet kullanarak, adım 5.2'de (%66 Silika bazlı Yoğunluk Ayırma Aracı içeren) hazırlanan üç tüpün her birine 12.1 adımdan itibaren ortamın 8 mL'sini yavaşça katlayın. Arabirimin bozulmasını önlemek için degradeyi katmanlarken %44 Yoğunluk Ayırma Ortamının sabit ve yavaş akışını koruyun.
  3. Bir tartma terazisi veya bir denge kullanarak santrifüj kovaları içindeki tüm tüpleri dikkatlice dengeleyin.
  4. Tüpleri 20 dk 859 x g'de 20 °C'de frensiz bir santrifüjde döndürün. Degrade arabirimindeki hücreleri bozmamaya dikkat edin, tüpleri çıkarmadan önce rotorların dinlenmeye gelmesine izin verin.

13. Degrade Arabiriminden Mononükleer Hücreleri Topla

  1. Genellikle 1-2 mm kalınlığında beyaz bant (MNC içeren) bulunan degrade arabirimini (5 mL işaretine yakın) görselleştirin.
    NOT: Beyaz bir grup görebilir ya da göremeyebilir. Ancak, MNC bu arabirimde olacak ve degrade arabiriminin netliğini bulutlamalıdır.
  2. Vakum aspire ve arayüze daha kolay pipet erişimi sağlamak için üst degrade üst 7 mL atın.
  3. Sürekli manuel emme ve sürekli dönen bilek hareketi kullanarak, temiz bir 50 mL polipropilen konik tüp içine hücrelerin arayüz tabakası toplamak. 2 degradeler arasındaki arayüz açık ve refractile (hücrelerden temiz) kadar toplayın.
  4. Toplama tüpünü 50 mL soğutulmuş FACS Tampon ile doldurun. 4 °C'de, 800 x g'da 5 dk.
  5. Vakum aspirasyonu ile supernatant aspire ve FACS Tampon 1 mL pelet resuspend.
  6. Uygun ölü hücre dışlama yöntemlerini kullanarak 1:2 seyreltme de bir hemositometre üzerinde hücreleri saymak.
  7. Yeni izole kolonik MNC ile FACS boyama veya diğer tahlillere devam edin.

Sonuçlar

Minür kolon hastalığı modelleri ile çalışırken, hem nicel ve nitel değerlendirmek edebilmek için yararlıdır, kolon MNC arasında, inflamatuar süreçte yer alan birden fazla bağışıklık hücresi alt kümeleri. Bu protokolün uygulanması ile elde edilen MNC'nin tek hücreli süspansiyonu, bu tür henotypik karakterizasyonu sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde kolaylaştırır. Bu izolasyon yönteminin farklı deneysel ayarlar altında uygulanması için bir ilke kanıt?...

Tartışmalar

Bu görsel protokol lamina propria lenfositler de dahil olmak üzere kolon mononükleer hücrelerin izolasyon için iyi tolere yöntemleri açıklar (LPL). Bu protokol, inflamatuar sitokinlerin ve doku yaralanmalarının kurtarılan MNC'nin yetersiz canlılığına katkıda bulunduğu ciddi nakil sonrası fare kolit modellerinin değerlendirilmesinde optimize edildiği göz önüne alındığında, bu yöntemlerin diğer kolon MNC'nin henotik analizini gerektiren uygulamalar. Bunlar arasında inflamatuar barsak hastalı?...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.

Teşekkürler

Bu çalışma #1K08HL088260 ve #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) ve Batchelor Pediatrik Araştırmalar Vakfı (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışmada kullanılan C57BL/6 ve BALB/c fareleri ya tesisimizde yetiştirildi ya da Jackson Labs veya Taconic tarafından sağlandı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
60 mm Petri DIshThermo Scientific150288
1x PBSCorning21-040-CV
10x PBSLonza BioWhittakerBW17-517Q
10 mL Disposable Serological PipetteCorning4100
10 mL SyringeBecton Dickinson302995
15 mL Non-Sterile Conical TubesTruLineTR2002
18 G Blunt NeedleBecton Dickinson305180
25 mL Disposable Serological PipetteCorning4250
40 μm pore size Cell StrainerCorning352340
50 mL Falcon TubeCorning21008-951
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaA4503-1KG
Fixation BufferBiolegend420801
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticumSigmaC2139
EDTA, 0.5 M Sterile SolutionAmrescoE177-500ML
Fetal Bovine SerumThermo /Fisher Scientific -HyCLoneSV30014.03
HEPESGE Healthcare-HyCloneSH30237.01
PercollGE Healthcare-Life Sciences1708901
RPMI MediumCorning17-105-CV
Sodium AzideVWR Life Science Amresco97064-646
Trypan BlueLonza BioWhittaker17-942E

Referanslar

  1. Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
  2. Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
  3. Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
  4. Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
  5. Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).
  6. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  7. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
  8. Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
  9. Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
  10. Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
  11. Harb, W. J. Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
  12. Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
  13. Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
  14. Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
  15. Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
  16. Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
  17. Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
  18. Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
  19. Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
  20. van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
  21. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
  22. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
  23. Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
  24. Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
  25. Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
  26. Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
  27. Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
  28. Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
  29. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
  30. Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  31. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  32. van der Heijden, P. j., Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 151Lenfositlerkolonmurinelamina propriakolittransplantasyonak sitometrisienzimatik sindiriminflamasyonmonon kleer h creler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır