Isolamento delle cellule mononucleari Di Lamina propria dal colon Murine utilizzando Collagenase E

Riepilogo

L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare le cellule mononucleari che risiedono nella lamina propria del colon dalla digestione enzimatica del tessuto usando il collagenae. Questo protocollo consente l'isolamento efficiente delle cellule mononucleari con conseguente sospensione a singola cellula che a sua volta può essere utilizzata per l'immunofenofizzazione robusta.

Abstract

L'intestino è la casa del maggior numero di cellule immunitarie nel corpo. Il piccolo e grande sistema immunitario intestinale polizia l'esposizione a antigeni esogeni e modula le risposte a potenti stimoli immunitari microbicamente derivati. Per questo motivo, l'intestino è un importante sito bersaglio di disregolazione immunitaria e infiammazione in molte malattie tra cui, ma, non limitato a malattie infiammatorie intestinali come la malattia di Crohn e la colite ulcerosa, innesto contro l'ospite (GVHD) dopo l'osso trapianto di midollo (BMT), e molte condizioni allergiche e infettive. I modelli Murine di infiammazione gastrointestinale e colite sono pesantemente utilizzati per studiare le complicazioni GI e per ottimizzare pre-clinicamente le strategie per la prevenzione e il trattamento. I dati ricavati da questi modelli attraverso l'isolamento e l'analisi fenotipica delle cellule immunitarie dall'intestino sono fondamentali per un'ulteriore comprensione immunitaria che può essere applicata per migliorare i disturbi infiammatori gastrointestinali e sistemici. Questo rapporto descrive un protocollo altamente efficace per l'isolamento delle cellule mononucleari (MNC) dal colon utilizzando un'interfaccia mista di gradiente di densità basata sulla silice. Questo metodo isola riproducibilmente un numero significativo di leucociti vitali riducendo al minimo i detriti contaminati, consentendo la successiva fenotipizzazione immunitaria mediante citometria di flusso o altri metodi.

Introduzione

Sebbene il tratto gastrointestinale (GI) sia principalmente dedicato alla lavorazione e al riassorbimento dei nutrienti dagli alimenti, il tratto GI mantiene anche un ruolo centrale nell'integrità del sistema vascolare, linfatico e nervoso e di numerosi altri organi attraverso il suo sistema immunitario mucosale e submucosale¹. Il sistema immunitario GI ha un ruolo influente nella salute gastrointestinale e sistemica a causa della sua costante esposizione a antigeni estranei da alimenti, batteri commensici o agenti patogeni invasori^1,2. Pertanto, il sistema immunitario GI deve mantenere un delicato equilibrio in cui tollera gli antigeni non patogeni rispondendo in modo appropriato agli antigeni patogeni^1,2. Quando l'equilibrio di tolleranza e difesa viene interrotto, localizzato o sistemico immune diregolazione e infiammazione può verificarsi con conseguente una miriade di malattie^1,2,3.

L'intestino ospita almeno il 70% di tutte le cellule linfoidi nel corpo⁴. La maggior parte delle interazioni immunologiche primarie coinvolgono almeno una delle tre stazioni immunitarie dell'intestino: 1) Peyer's Patches, 2) Linfociti intraeliali (IEL) e 3) linfociti di lamina (LPL). Ognuna di queste è costituita da una complessa rete interconnessa di cellule immunitarie che rispondono rapidamente alle normali sfide immunitarie nell'intestino⁵. Limitata allo stroma sopra la mucosae muscolosa, la lamina vagamente strutturata propria è il tessuto connettivo della mucosa intestinale e comprende impalcature per il villus, la vascolatura, il drenaggio linfatico e il sistema nervoso mucosale, così come molti e sottoinsiemi immunitari adattivi^6,7,8,9. LPL è composto da cellule^{T CD4} e CD8 in un rapporto approssimativo di 2:1, cellule plasmatiche e cellule di lignaggio mieloidi tra cui, cellule dendritiche, mastociti, eosinofili e macrofagi⁶.

C'è un crescente interesse nella comprensione della disregolazione immunitaria e dell'infiammazione dell'intestino in quanto si prova per vari stati di malattia. Tali condizioni come la malattia di Crohn e la colite ulcerosa manifestano tutti diversi livelli di infiammazione colonica^10,11,12. Inoltre, i pazienti con disturbi maligni o non maligni del midollo o del sistema immunitario sottoposti a trapianto di midollo osseo allogenico (allo-BMT) possono sviluppare varie forme di colite, tra cui 1) tossicità diretta da regimi condizionanti prima del BMT, 2) infezioni causate dall'immunosoppressione dopo BMT e 3) malattia di innesto-contro-ospite (GVHD) causata da cellule T di tipo donatore che reagiscono agli allogenesti donatori nei tessuti dopo BMT^13,14,15. Tutte queste complicazioni post-BMT provocano alterazioni significative nell'ambiente immunitario dell'intestino^16,17,18. Il metodo proposto consente una valutazione affidabile dell'accumulo di cellule immunitarie nel colon del topo e, quando applicato ai destinatari murini dopo BMT, facilita un saggio efficiente delle cellule donatrici e immunitarie riceventi coinvolte nella tolleranza dei^{trapianti 19 ,20}. Ulteriori cause di infiammazione intestinale includono malignità, allergie alimentari, o interruzione del microbioma intestinale. Questo protocollo consente l'accesso alle cellule mononucleari intestinali dal colon e, con modifiche, ai leucociti dell'intestino tenue in uno di questi modelli murini preclinici.

Una ricerca PubMed usando i termini di ricerca "intestine e cellule immunitarie e isolamento" rivela oltre 200 pubblicazioni che descrivono i metodi per la digestione dell'intestino tenue per estrarre le cellule immunitarie. Tuttavia, una ricerca simile alla letteratura per il colon non produce protocolli ben delineati che specificano l'isolamento delle cellule immunitarie dal colon. Questo può essere perché il colon ha strati più muscolari e interstiziali, rendendo più difficile da digerire completamente rispetto all'intestino tenue. A differenza dei protocolli esistenti, questo protocollo utilizza specificamente Collagenase E di Clostridium histolyticum senza altre collagene batteriche (Collagenase D/ Collagenase I). Dimostriamo che, utilizzando questo protocollo, la digestione del tessuto colonico può essere raggiunta preservando la qualità delle cellule immunitarie mononucleari dell'intestino isolate (MNC) senza l'aggiunta di reagenti anti-agglomeranti come il versinato di sodio (EDTA), diSpase II e deoxyribonuclease I (DNasie I)^21,22,23. Questo protocollo è ottimizzato per consentire l'estrazione robusta riproducibile di MNC vitale dal colon murino per ulteriori studi diretti e dovrebbe prestarsi allo studio dell'immunologia del colon o (con modifiche) dell'intestino tenue^{24, 25}.

Protocollo

Tutti gli studi sono stati condotti nell'ambito di protocolli di ricerca sui roditori esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della University of Miami Miller School of Medicine, che soddisfa gli standard veterinari stabiliti dall'American Association per laboratorio di scienza animale (AALAS).

1. Preparazione delle soluzioni

1. Come descritto nella Tabella 1, preparare il buffer del colon, il supporto di separazione della densità basata su Silica 100%, il supporto di separazione della densità basata su Silica 66%, il supporto di separazione della densità basato su Silica 44%, il buffer di digestione Collagenase e digestione 100% e il buffer FACS.
   1. Preparare Il buffer colon il giorno prima della procedura e conservare durante la notte a 4 gradi centigradi.
   2. Preparare 100% Supporti di separazione della densità basata su silice il giorno prima della procedura e conservati durante la notte a 4 gradi centigradi, collocando a temperatura ambiente la mattina della procedura per scongelare.
   3. Preparare il 66% e il 44% dei supporti di separazione basati su silice la mattina dell'isolamento, utilizzando la temperatura ambiente 100% Silica-Based Density Separation Media e Colon Buffer.
   4. Misurare la quantità appropriata di Clostridium histolyticum derivatoCollagenase E e conservare a -20 gradi durante la notte prima della procedura. La mattina seguente, sciogliere nel volume appropriato di Buffer di colon per derivare Collagenase Digestion Buffer. Per tutte le incubazioni con Collagenase Digestion Buffer il giorno della procedura, pre-riscaldare le soluzioni a 37 gradi centigradi.
2. Per l'intera fase del protocollo, mantenere una centrifuga a 20 gradi centigradi e la velocità di rotazione di 859 x g, con freni inattivati (0 decelerazione) per la centrifugazione del gradiente. Impostarne un altro a 4 gradi centigradi e velocità di rotazione di 859 x g, con la decelerazione standard, per i passaggi di lavaggio.

2. Raccolta del colon

1. Eutanasia il topo tramite asfissia CO₂ seguita da un metodo confermativo approvato da AALAC.
2. Posizionare il mouse in posizione supina e spruzzare la pelliccia con il 70% di etanolo. Utilizzando grandi forbici tissutali, fare un'incisione verticale linea mediana ed esporre il peritoneo intatto.
3. Utilizzando le forbici a dissezione fine, aprire il peritoneo. Utilizzare pinze per spostare il piccolo intestino da un lato ed esporre il colon discendente. Tirare leggermente verso l'alto sul colon discendente per esporre al massimo la parte rettale del colon. Tagliare il retto distale in profondità nel bacino e sezionare e rimuovere l'intero colon come un'unità, dal retto distale al tappo del ceca.
4. Trasferire il colon in 20 mL raffreddato Buffer del colon in un tubo di polipropilene da 50 mL.

3. Pulizia del colon

1. Posizionare il colon su un tovagliolo di carta inumidito ed estrarre lo sgabello solido applicando una leggera pressione alla parete intestinale con l'estremità smussata di forbici o pinze.
2. Mettere il colon in un piatto Petri e lavare l'intestino con 10 mL di raffreddato Colon Buffer utilizzando una siringa da 10 mL con ago di riempimento smussato da 18 G.
3. Trasferire il colon in un tovagliolo di carta inumidito Colon buffer e rimuovere la mesenteria e grasso con l'estremità tagliente delle forbici.
4. Mettere il colon in un piatto Petri riempito con 5-10 mL raffreddato Colon Buffer agitante manualmente per lavare il contenuto colonico rimanente. Ripetere 2-3 volte.
5. Tagliare il colon longitudinalmente dalla sua estremità rettale più muscolosa al colon prossimale (generando un unico pezzo rettangolare aperto del colon) in un piatto Petri pieno di fresco raffreddato Colon Buffer. Eliminare i file multimediali esistenti e ricaricarlo con un buffer del colon refrigerato pulito.
6. Lavare l'intestino 3 volte vorticoso vigorosamente nel piatto Petri e sostituendo il 5-10 mL di raffreddato Colon Buffer dopo con ogni lavaggio.
7. Posizionare il tessuto rettangolare del colon su un tovagliolo di carta inumidito con Il Buffer del Colon e tagliarlo tagliandolo orizzontalmente e poi in piccoli frammenti (3 mm x 3 mm sezioni).
8. Raccogliere accuratamente i frammenti del colon utilizzando pinze fini in 20 mL raffreddati Buffer Colon in un tubo conico in polipropilene da 50mL.
9. Lavare i frammenti del colon 3 volte, ogni lavaggio in 20 mL Colon Buffer, ruotando vigorosamente il tubo per 30 s. Tra ogni agitazione, lasciare che i frammenti di tessuto si depositino sul fondo del tubo. Decant o vuoto aspirano il supernatante, impedendo la perdita di frammenti di tessuto nel processo di aspirazione tra ogni lavaggio.
   NOT: Non c'è bisogno di cambiare il tubo dopo ogni lavaggio.

4. Digestione di collagene 1

1. Aggiungere 20 mL del buffer di digestione di Collagenase ai frammenti del colon lavato nel tubo conico di polipropilene da 50 mL.
2. Posizionare il tubo chiuso da 50 mL a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale incubato con la velocità di rotazione impostata a 2 x g per 60 min. Assicurarsi che i frammenti di tessuto siano in costante movimento durante l'agitazione; se necessario, aumentare il tasso di rotazione in modo incrementale per garantire che nessun frammento di tessuto si stabilizzi sul fondo del tubo.

5. Preparare i gradienti dei supporti di separazione basati su Silica

1. Preparare il 66% e il 44% dei supporti di separazione della densità basati sulla silice, utilizzando un supporto di separazione della densità basato su silice al 100% a 20 gradi centigradi (temperatura ambiente) e al buffer del colon.
2. Versare 5 mL del 66% di supporti di separazione della densità basati su silice in ciascuno dei 3 tubi separati in polipropilene da 15 mL. Preparare 3 tubi per colon. Questo forma la base di densità più alta della procedura di isolamento del gradiente, su cui sarà sovrapposto un supporto di separazione a densità inferiore per creare il gradiente di separazione.
3. Conservare a 20 gradi centigradi fino all'uso.

6. Collezione di Supernatant da Digestion 1

1. Raccogliere solo il supernatante utilizzando una pipetta sierologica da 25 mL e filtrare il supernatante attraverso un colide a cellule da 40 m collocato in un tubo conico polipropilene pulito da 50 mL, dopo il completamento della digestione di Collagenase 1. Fare attenzione a non aspirare eventuali frammenti di tessuto esistenti.
   NOT: Conservare eventuali frammenti di tessuto visibile rimanenti nel tubo. Questi subiranno una seconda digestione del collagene (passaggio 8).

7. Buffer di digestione di collagene

1. Riempire completamente il tubo di polipropilene da 50 mL con un Buffer del Colon refrigerato.
   NOT: Il collageneè è attivo a 37 gradi centigradi; quindi un buffer refrigerato inattiva questo enzima.
2. Centrifugare il tubo a 4 gradi centigradi a 800 x g per 5 min.
   1. Scartare il supernatante per aspirazione sottovuoto. Lavare le cellule con 25 mL di buffer del colon fresco e centrifugare a 800 x g per 5 min.
   2. Risospendere il pellet in meno di 1 mL di fresco refrigerato Buffer.
   3. Posizionare il tubo conico in polipropilene da 50 mL sul ghiaccio.

8. Digestione di collagene 2

1. Ripetere il passaggio 4 (Digestione 1) con i frammenti di tessuto rimanenti trattenuti dal punto 6.1.

9. Disaggregazione dei tessuti dopo la digestione 2

1. Sciacquare vigorosamente i frammenti di tessuto avanti e indietro tra il tubo e una siringa da 10 mL attraverso un ago da 18 G contundente.
2. Ripetere questo colore per un minimo di 7-8 passaggi completi, continuando fino a quando non sono visibili frammenti di tessuto lordo o detriti.

10. Filtra celle

1. Passare la sospensione disaggregazione del tessuto attraverso un colino di filtrazione di 40 m in un tubo pulito in polipropilene da 50 mL.
2. Lavare il colino cellulare del tessuto di filtrazione con 10 mL raffreddato Colon Buffer per recuperare tutte le cellule intrappolate nel filtro.

11. Digestione di collagene

1. Riempire il tubo conico in polipropilene da 50 mL sul bordo con il buffer del colon refrigerato.
   NOT: La temperatura del buffer del colon è fondamentale per garantire lo spegnimento dell'attività del collagenano.
2. Girare a 4 gradi centigradi e 800 x g per 5 min.
3. Scartare il supernatante per aspirazione sottovuoto.
4. Lavare ricontraendo in 25 mL di tamburo fresco refrigerato, seguito da centrifugazione a 4 gradi centigradi, 800 x g per 5 min.
5. Scartare il supernatante per aspirazione sottovuoto.
6. Mettere in comune il pellet risospeso da Collagenase Digestion 1 (passaggio 7) al tubo corrispondente dal punto 11.4.
7. Ripetere il passaggio 11.4 (lavaggio e centrifugazione).

12. Separazione del gradiente del gradiente di separazione della densità basata su Silice

NOT: Eseguire i passaggi 12-18 il più rapidamente possibile, per garantire un rapido spegnimento dell'attività di collagenasi.

1. Dopo la fase 11.7, risospendere ogni pellet in un totale di 24 mL del 44% di Silica-based Density Separation Media per colon.
2. Lentamente strato 8 mL del supporto dal passo 12.1 su ciascuno dei tre tubi preparati al passo 5.2 (contenente 66% Silica-based Density Separation Media), utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL. Mantenere un flusso costante e lento del 44% Supporto di separazione densità, stratificando il gradiente per evitare interruzioni dell'interfaccia.
3. Bilanciare con attenzione tutti i tubi all'interno dei secchi di centrifuga utilizzando una bilancia di pesatura o un equilibrio.
4. Girare i tubi di 20 min a 859 x g in una centrifuga senza freno a 20 gradi centigradi. Lasciare che i rotori completino il riposo prima di rimuovere i tubi, facendo attenzione a non interrompere le cellule nell'interfaccia del gradiente.

13. Raccogliere le celle mononucleari dall'interfaccia del gradiente

1. Visualizza l'interfaccia del gradiente (vicino al contrassegno di 5 mL), dove in genere è presente una banda bianca spessa 1-2 mm (contenente MNC).
   NOT: Si può o non può vedere una banda bianca. Tuttavia, MNC sarà a questa interfaccia e dovrebbe offuscare la chiarezza dell'interfaccia gradiente.
2. Aspirare aspirato e scartare i primi 7 mL del gradiente superiore per consentire un più facile accesso pipette all'interfaccia.
3. Utilizzando l'aspirazione manuale continua e il movimento rotante del polso, raccogliere lo strato di interfaccia delle cellule in un tubo conico in polipropilene pulito da 50 mL. Raccogliere fino a quando l'interfaccia tra i 2 gradienti è chiara e refractile (chiaro di celle).
4. Riempire il tubo di raccolta con 50 mL di buffer FACS refrigerati. Girare a 4 gradi centigradi, 800 x g per 5 min.
5. Aspirare il supernatante attraverso l'aspirazione del vuoto e risospendere il pellet in 1 mL di BUFFER FACS.
6. Contare le cellule su un emocitometro con una diluizione 1:2 utilizzando appropriati metodi di esclusione delle cellule morte.
7. Procedere con la colorazione FACS o altri saggi con MNC colonico appena isolato.

Risultati

Quando si lavora con modelli di malattia del colon murino, è utile essere in grado di quantificare e valutare qualitativamente, tra il MNC del colon, più sottoinsiemi di cellule immunitarie coinvolti nel processo infiammatorio. La sospensione a singola cellula di MNC ottenuta attraverso l'applicazione di questo protocollo facilita tale caratterizzazione fenotipica in modo robusto e riproducibile. Come prova di principio per l'applicazione di questo metodo di isolamento in diverse impost...

Discussione

Questo protocollo visivo descrive metodi ben tollerati per l'isolamento delle cellule mononucleari coloniche, tra cui i linfociti propria di lamina (LPL). Dato che questo protocollo è stato ottimizzato nella valutazione di modelli di colite murina pre-trapianto in cui le citochine infiammatorie e le lesioni tissutali si prestano alla scarsa redditività della MNC recuperata, prevediamo che questi metodi possono essere tradotti in altri applicazioni che richiedono l'analisi fenotipica del MNC colonico. Questi includono, ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Petri DIsh	Thermo Scientific	150288
1x PBS	Corning	21-040-CV
10x PBS	Lonza BioWhittaker	BW17-517Q
10 mL Disposable Serological Pipette	Corning	4100
10 mL Syringe	Becton Dickinson	302995
15 mL Non-Sterile Conical Tubes	TruLine	TR2002
18 G Blunt Needle	Becton Dickinson	305180
25 mL Disposable Serological Pipette	Corning	4250
40 μm pore size Cell Strainer	Corning	352340
50 mL Falcon Tube	Corning	21008-951
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A4503-1KG
Fixation Buffer	Biolegend	420801
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum	Sigma	C2139
EDTA, 0.5 M Sterile Solution	Amresco	E177-500ML
Fetal Bovine Serum	Thermo /Fisher Scientific -HyCLone	SV30014.03
HEPES	GE Healthcare-HyClone	SH30237.01
Percoll	GE Healthcare-Life Sciences	1708901
RPMI Medium	Corning	17-105-CV
Sodium Azide	VWR Life Science Amresco	97064-646
Trypan Blue	Lonza BioWhittaker	17-942E