Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Целью этого протокола является изоляция моноядерных клеток, которые находятся в ламинальной проприии толстой кишки путем ферментативного пищеварения тканей с помощью коллагеназы. Этот протокол позволяет эффективно изоляции моноядерных клеток в результате одной подвески клеток, которые, в свою очередь, могут быть использованы для надежного иммунофенотипирования.
Кишечник является домом для наибольшего числа иммунных клеток в организме. Малые и большие кишечные иммунные системы полиции воздействия экзогенных антигенов и модулировать ответы на мощные микробиально производных иммунных стимулов. По этой причине, кишечник является основным целевым местом иммунной дисрегуляции и воспаления во многих заболеваниях, включая, но, не ограничивавшись воспалительными заболеваниями кишечника, такими как болезнь Крона и язвенный колит, трансплантат против хозяина болезни (GVHD) после кости трансплантации костного мозга (BMT), и многие аллергические и инфекционные заболевания. Морин модели желудочно-кишечного воспаления и колита в значительной степени используются для изучения осложнений Г.И. и предварительно оптимизировать стратегии профилактики и лечения. Данные, полученные из этих моделей с помощью изоляции и фенотипического анализа иммунных клеток из кишечника имеет решающее значение для дальнейшего иммунного понимания, которые могут быть применены для улучшения желудочно-кишечных и системных воспалительных расстройств. В этом отчете описывается высокоэффективный протокол для изоляции моноядерных клеток (MNC) от толстой кишки с помощью смешанного интерфейса градиента плотности на основе кремнезема. Этот метод воспроизволит значительное количество жизнеспособных лейкоцитов при минимизации загрязнения мусора, позволяя последующее иммунное фенотипирование путем цитометрии потока или другими методами.
Хотя желудочно-кишечного тракта (ГИ) в первую очередь посвященобработке и реабсорбции питательных веществ из пищи, желудочно-кишечный тракт также поддерживает центральную роль в целостности сосудистой, лимфатической и нервной систем и многих других органов через его слизистой и субмукозной иммунной системы1. Иммунная система GI имеет влиятельную роль как в желудочно-кишечном и системном здоровье из-за его постоянного воздействия иностранных антигенов из пищи, сопутствующих бактерий, или вторжение патогенов1,2. Таким образом, иммунная система Г.И. должна поддерживать хрупкий баланс, в котором она переносит непатогенные антигены, адекватно реагируя на патогенные антигены1,2. Когда нарушается баланс толерантности и защиты, локализованы или системной иммунной дисрегуляции и воспаления может произойти в результате множества заболеваний1,2,3.
Кишечник таит в себе не менее 70% всех лимфоидных клеток в организме4. Большинство первичных иммунологических взаимодействий включают по крайней мере одну из трех иммунных станций в кишечнике: 1) Патчи Пейера, 2) Интраэпителиальные лимфоциты (IEL) и 3) лимины проприа лимфоциты (LPL). Каждый из них состоит из сложной взаимосвязанной сети иммунных клеток, которые быстро реагируют на нормальные иммунные проблемы в кишечнике5. Ограниченный строма выше muscularis слизистые оболочки, слабо структурированные ламины propria является соединительной ткани слизистой оболочки кишечника и включает в себя леса для villus, сосуды, лимфатический дренаж, и слизистой нервной системы, а также многие врожденные нервной системы и адаптивные иммунные подмножества6,7,8,9. LPL состоят из CD4и CD8 Т-клеток в приблизительном соотношении 2:1, плазматические клетки и миелоидные клетки линии, включая, дендритные клетки, тучные клетки, эозинофилы и макрофаги6.
Существует растущий интерес к пониманию иммунной дисрегуляции и воспаления кишечника, как это относится к различным состояниям заболевания. Такие условия, как болезнь Крона и язвенный колит все проявляются различные уровни воспаления толстой кишки10,11,12. Кроме того, у пациентов со злокачественными или незлокачественными расстройствами костного мозга или иммунной системы, которые проходят аллогенную трансплантацию костного мозга (алло-БМТ), могут развиться различные формы колита, включая 1) прямую токсичность от схем кондиционирования до BMT, 2) инфекций, вызванных иммуносупрессией после BMT и 3) трансплантата против хозяина болезни (GVHD) обусловлен донора типа Т-клеток, реагирующих на донора алло-антигенов в тканях после BMT13,14,15. Все эти пост-BmT осложнений приводят к значительным изменениям в иммунной среде кишечника16,17,18. Предлагаемый метод позволяет надежную оценку накопления иммунных клеток в толстой кишке мыши и, при применении к получателям мурина после BMT, облегчает эффективное анализ как донора, так и реципиента иммунных клеток, участвующих в переноске трансплантации19 ,20. Дополнительные причины воспаления кишечника включают злокачественные новообразования, пищевую аллергию или нарушение микрофлоры кишечника. Этот протокол позволяет получить доступ к кишечной моноядерной клетке из толстой кишки и, с модификациями, к лейкоцитам тонкой кишки в любой из этих доклинических моделей мурин.
Поиск PubMed с использованием поисковых терминов "intestine And immune cell And isolation" показывает более 200 публикаций, описывающих методы пищеварения тонкой кишки для извлечения иммунных клеток. Однако, подобный поиск словесности для двоеточия не дает никакие well-delineated протоколы определяя изоляцию иммунных клеток от двоеточия. Это может быть потому, что двоеточие имеет более мышечной и интерстициальной слоев, что делает его более трудным для полного переваривания, чем тонкой кишки. В отличие от существующих протоколов, этот протокол специально использует Коллагеназа E от Clostridium histolyticum без других бактериальных коллагенезов (Collagenase D/ Коллагеназа I). Мы демонстрируем, что, используя этот протокол, пищеварение толстой ткани может быть достигнуто при сохранении качества изолированных кишечных моноядерных иммунных клеток (MNC) без добавления анти-слипающихся реагентов, таких как версенат натрия (EDTA), Dispase II, и дезоксирибонуклеэI (DNAse I)21,22,23. Этот протокол оптимизирован, чтобы позволить воспроизводимой надежной добычи жизнеспособной MNC из толстой кишки для дальнейших направленных исследований и должны поддаваться на изучение иммунологии толстой кишки или (с модификациями) тонкой кишки24, 25.
Все исследования были проведены в соответствии с протоколами исследования грызунов рассмотрены и одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Медицинской школы Университета Майами Миллера, которая отвечает ветеринарным стандартам, установленным Американской ассоциацией для лабораторных животных (AALAS).
1. Подготовка решений
2. Сбор толстой кишки
3. Очистка толстой кишки
4. Коллагенеза пищеварение 1
5. Подготовка Силика основе разделения СМИ Градиенты
6. Коллекция Супернатанта из пищеварения 1
7. Утолить коллагенеза пищеварения буфер
8. Коллагеназа пищеварение 2
9. Ткань Disaggregation После пищеварения 2
10. Фильтровые клетки
11. Утолить варесьение коллагенеза
12. Силика основе плотность разделения СМИ Градиент разделения
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте шаги 12-18 как можно быстрее, чтобы обеспечить быстрое закалку коллагеназной активности.
13. Сбор моноядерных ячеек из интерфейса Gradient
При работе с моделями заболеваний толстой кишки, полезно, чтобы иметь возможность как количественно и качественно оценить, среди MNC толстой кишки, несколько подмножеств иммунных клеток, участвующих в воспалительном процессе. Одноклеточная приостановка МНК, полученна...
Этот визуальный протокол описывает хорошо переносимые методы изоляции моноядерных клеток толстой кишки, включая лиминпрорийские лимфоциты (LPL). Учитывая, что этот протокол был оптимизирован в оценке тяжелых посттрансплантационных моделей мышь колит, где воспалительные цитокины и тра...
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.
Эта работа была поддержана грантами #1K08HL088260 и #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) и Фондом детских исследований Батчелора (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). Мыши C57BL/6 и BALB/c, используемые в этом исследовании, были либо выведены в нашем учреждении, либо предоставлены Jackson Labs или Taconic.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
15 mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
18 G Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
40 μm pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
EDTA, 0.5 M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены