JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Целью этого протокола является изоляция моноядерных клеток, которые находятся в ламинальной проприии толстой кишки путем ферментативного пищеварения тканей с помощью коллагеназы. Этот протокол позволяет эффективно изоляции моноядерных клеток в результате одной подвески клеток, которые, в свою очередь, могут быть использованы для надежного иммунофенотипирования.

Аннотация

Кишечник является домом для наибольшего числа иммунных клеток в организме. Малые и большие кишечные иммунные системы полиции воздействия экзогенных антигенов и модулировать ответы на мощные микробиально производных иммунных стимулов. По этой причине, кишечник является основным целевым местом иммунной дисрегуляции и воспаления во многих заболеваниях, включая, но, не ограничивавшись воспалительными заболеваниями кишечника, такими как болезнь Крона и язвенный колит, трансплантат против хозяина болезни (GVHD) после кости трансплантации костного мозга (BMT), и многие аллергические и инфекционные заболевания. Морин модели желудочно-кишечного воспаления и колита в значительной степени используются для изучения осложнений Г.И. и предварительно оптимизировать стратегии профилактики и лечения. Данные, полученные из этих моделей с помощью изоляции и фенотипического анализа иммунных клеток из кишечника имеет решающее значение для дальнейшего иммунного понимания, которые могут быть применены для улучшения желудочно-кишечных и системных воспалительных расстройств. В этом отчете описывается высокоэффективный протокол для изоляции моноядерных клеток (MNC) от толстой кишки с помощью смешанного интерфейса градиента плотности на основе кремнезема. Этот метод воспроизволит значительное количество жизнеспособных лейкоцитов при минимизации загрязнения мусора, позволяя последующее иммунное фенотипирование путем цитометрии потока или другими методами.

Введение

Хотя желудочно-кишечного тракта (ГИ) в первую очередь посвященобработке и реабсорбции питательных веществ из пищи, желудочно-кишечный тракт также поддерживает центральную роль в целостности сосудистой, лимфатической и нервной систем и многих других органов через его слизистой и субмукозной иммунной системы1. Иммунная система GI имеет влиятельную роль как в желудочно-кишечном и системном здоровье из-за его постоянного воздействия иностранных антигенов из пищи, сопутствующих бактерий, или вторжение патогенов1,2. Таким образом, иммунная система Г.И. должна поддерживать хрупкий баланс, в котором она переносит непатогенные антигены, адекватно реагируя на патогенные антигены1,2. Когда нарушается баланс толерантности и защиты, локализованы или системной иммунной дисрегуляции и воспаления может произойти в результате множества заболеваний1,2,3.

Кишечник таит в себе не менее 70% всех лимфоидных клеток в организме4. Большинство первичных иммунологических взаимодействий включают по крайней мере одну из трех иммунных станций в кишечнике: 1) Патчи Пейера, 2) Интраэпителиальные лимфоциты (IEL) и 3) лимины проприа лимфоциты (LPL). Каждый из них состоит из сложной взаимосвязанной сети иммунных клеток, которые быстро реагируют на нормальные иммунные проблемы в кишечнике5. Ограниченный строма выше muscularis слизистые оболочки, слабо структурированные ламины propria является соединительной ткани слизистой оболочки кишечника и включает в себя леса для villus, сосуды, лимфатический дренаж, и слизистой нервной системы, а также многие врожденные нервной системы и адаптивные иммунные подмножества6,7,8,9. LPL состоят из CD4и CD8 Т-клеток в приблизительном соотношении 2:1, плазматические клетки и миелоидные клетки линии, включая, дендритные клетки, тучные клетки, эозинофилы и макрофаги6.

Существует растущий интерес к пониманию иммунной дисрегуляции и воспаления кишечника, как это относится к различным состояниям заболевания. Такие условия, как болезнь Крона и язвенный колит все проявляются различные уровни воспаления толстой кишки10,11,12. Кроме того, у пациентов со злокачественными или незлокачественными расстройствами костного мозга или иммунной системы, которые проходят аллогенную трансплантацию костного мозга (алло-БМТ), могут развиться различные формы колита, включая 1) прямую токсичность от схем кондиционирования до BMT, 2) инфекций, вызванных иммуносупрессией после BMT и 3) трансплантата против хозяина болезни (GVHD) обусловлен донора типа Т-клеток, реагирующих на донора алло-антигенов в тканях после BMT13,14,15. Все эти пост-BmT осложнений приводят к значительным изменениям в иммунной среде кишечника16,17,18. Предлагаемый метод позволяет надежную оценку накопления иммунных клеток в толстой кишке мыши и, при применении к получателям мурина после BMT, облегчает эффективное анализ как донора, так и реципиента иммунных клеток, участвующих в переноске трансплантации19 ,20. Дополнительные причины воспаления кишечника включают злокачественные новообразования, пищевую аллергию или нарушение микрофлоры кишечника. Этот протокол позволяет получить доступ к кишечной моноядерной клетке из толстой кишки и, с модификациями, к лейкоцитам тонкой кишки в любой из этих доклинических моделей мурин.

Поиск PubMed с использованием поисковых терминов "intestine And immune cell And isolation" показывает более 200 публикаций, описывающих методы пищеварения тонкой кишки для извлечения иммунных клеток. Однако, подобный поиск словесности для двоеточия не дает никакие well-delineated протоколы определяя изоляцию иммунных клеток от двоеточия. Это может быть потому, что двоеточие имеет более мышечной и интерстициальной слоев, что делает его более трудным для полного переваривания, чем тонкой кишки. В отличие от существующих протоколов, этот протокол специально использует Коллагеназа E от Clostridium histolyticum без других бактериальных коллагенезов (Collagenase D/ Коллагеназа I). Мы демонстрируем, что, используя этот протокол, пищеварение толстой ткани может быть достигнуто при сохранении качества изолированных кишечных моноядерных иммунных клеток (MNC) без добавления анти-слипающихся реагентов, таких как версенат натрия (EDTA), Dispase II, и дезоксирибонуклеэI (DNAse I)21,22,23. Этот протокол оптимизирован, чтобы позволить воспроизводимой надежной добычи жизнеспособной MNC из толстой кишки для дальнейших направленных исследований и должны поддаваться на изучение иммунологии толстой кишки или (с модификациями) тонкой кишки24, 25.

протокол

Все исследования были проведены в соответствии с протоколами исследования грызунов рассмотрены и одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Медицинской школы Университета Майами Миллера, которая отвечает ветеринарным стандартам, установленным Американской ассоциацией для лабораторных животных (AALAS).

1. Подготовка решений

  1. Как описано в таблице 1, подготовить colon Buffer, Силика основе плотности разделения СМИ 100%, Силика основе плотность разделения СМИ 66%, Силика основе плотность разделения СМИ 44%, Collagenase E Пищеварения буфера, и FACS буфера.
    1. Подготовка colon Buffer за день до процедуры и хранить на ночь при 4 градусах Цельсия.
    2. Подготовка 100% Силика основе плотности разделения СМИ за день до процедуры и хранить на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию, размещение при комнатной температуре утром процедуры оттаивания.
    3. Подготовка 66% и 44% Силика основе разделения СМИ в утром изоляции, используя комнатную температуру 100% Силика основе плотности разделения СМИ и толстой буфера.
    4. Измерьте соответствующее количество Clostridium histolyticum-производной Коллагеназе E и храните при -20 градусов за одну ночь до процедуры. На следующее утро, растворить в соответствующем томе колонии буфера для получения Коллагеназа пищеварения буфера. Для всех инкубаций с коллагенеза пищеварения буфера в день процедуры, предварительно подогреть решения до 37 градусов по Цельсию.
  2. В течение всего протокола держите одну центрифугу при 20 градусах Цельсия и скорости вращения 859 х г,при этом тормоза инактивированы (0 торможения) для центрифугирования градиента. Установите еще до 4 градусов по Цельсию и скорость вращения 859 х г, со стандартным замедлением, для мытья шагов.

2. Сбор толстой кишки

  1. Эвтаназия мышь с помощью CO2 удушья следуют AALAC утвержденных подтверждающий метод.
  2. Поместите мышь в положение на спине и распылите мех с 70% этанола. Используя большие ножницы ткани, сделать вертикальный разрез средней линии и подвергать нетронутыми перитонеума.
  3. Используя тонкие ножницы для вскрытия, откройте перитонеум. Используйте щипчи для перемещения тонкой кишки в одну сторону и подвергать нисходящей толстой кишки. Слегка потяните вверх по нисходящей толстой кишки, чтобы максимально разоблачить ректальную часть толстой кишки. Вырезать дистальную прямую кишку глубоко в таз и вскрыть и удалить всю толстую кишку, как один блок, от дистальной прямой кишки до цекалякрышки.
  4. Передача толстой кишки в 20 мл охлажденной толстой кишки буфера в 50 мл полипропиленовой трубки.

3. Очистка толстой кишки

  1. Поместите толстую кишку на увлажненные бумажные полотенца и извлечь твердый стул, применяя мягкое давление на стенку кишечника с тупым концом ножниц или щипцы.
  2. Поместите толстую кишку в чашку Петри и промойте кишечник с 10 мл охлажденных двоеточие буфера с помощью шприца 10 мл с 18 G тупой иглы заполнения.
  3. Передача толстой кишки в толстой кишки буфера увлажненное бумажное полотенце и удалить мезентерии и жира с острым концом ножниц.
  4. Поместите толстой кишки в чашку Петри заполнены 5-10 мл охлажденной толстой кишки буфера агитации вручную, чтобы мыть оставшееся содержимое толстой кишки. Повторите 2-3 раза.
  5. Вырезать толстой кишки продольно от его более мышечной ректальной конце проксимальной толстой кишки (генерации одного прямоугольного открытого кучи толстой кишки кусок) в чашке Петри заполнены свежим охлажденным двоеточие буфера. Откажитесь от существующих носителей и пополнить с чистой охлажденной колонии буфера.
  6. Вымойте кишечник 3 раза, энергично закрученного его в чашку Петри и заменив 5-10 мл охлажденной толстой кишки буфера после каждой стирки.
  7. Поместите прямоугольную ткань толстой кишки на бумажное полотенце, смоченное колонией и разрежьте его, нарезая его горизонтально, а затем на мелкие фрагменты (3 мм х 3 мм секций).
  8. Соберите фрагменты толстой кишки тщательно с помощью мелких щипцы в 20 мл охлажденной толстой кишки буфера в 50 мл полипропилена коническойтрубки.
  9. Вымойте фрагменты толстой кишки 3 раза, каждый мыть в 20 мл колонии буфера, энергично закрученного трубки в течение 30 с. Между каждым возбуждением, позволяют фрагменты ткани, чтобы осесть на дно трубки. Декант или вакуума аспирирует супернатант, предотвращая потерю фрагмента ткани в процессе аспирации между каждой стиркой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости менять трубку после каждой стирки.

4. Коллагенеза пищеварение 1

  1. Добавьте 20 мл коллагенезового варежесца буфера к промытым фрагментам толстой кишки в 50 мл полипропиленовой конической трубки.
  2. Поместите закрытую трубку 50 мл при 37 градусах Цельсия в инкубаторный орбитальный шейкер с скоростью вращения, установленной на уровне 2 х г в течение 60 мин. Убедитесь, что фрагменты ткани находятся в постоянном движении во время агитации; при необходимости постепенно увеличивайте скорость вращения, чтобы не оседать фрагменты тканей на дно трубки.

5. Подготовка Силика основе разделения СМИ Градиенты

  1. Подготовка 66% и 44% Силика основе плотность разделения сми, используя 100% Силика основе плотность разделения средств при температуре 20 градусов по Цельсию (комнатная температура) и колон-буфер.
  2. Налейте 5 мл 66% Силика основе плотность разделения средств в каждом из 3 отдельных 15 мл полипропиленовых труб. Подготовка 3 трубки на толстой кишке. Это формирует более высокую плотность основания процедуры изоляции градиента, на которой более низкие носители разделения плотности будут наслоены для того чтобы создать градиент разделения.
  3. Хранить при 20 градусах По до использования.

6. Коллекция Супернатанта из пищеварения 1

  1. Соберите только супернатант с помощью 25 мл серологического пипетки и фильтруйте супернатант через 40 мкм поры фильтрации ткани клеточной ткани ситечко помещается в чистой 50 мл полипропилена коническая трубка, после Collagenae Digestion 1 завершена. Будьте осторожны, чтобы не аспирировать любые существующие фрагменты ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните все оставшиеся видимые фрагменты ткани в трубке. Они будут проходить второй коллагенеза пищеварения (шаг 8).

7. Утолить коллагенеза пищеварения буфер

  1. Заполните 50 мл полипропиленовой трубки полностью охлажденной колонии буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коллагенеза активна при 37 градусах Цельсия; следовательно, охлажденный буфер инактивирует этот фермент.
  2. Центрифуга трубки при 4 градусах по Цельсию при 800 х г в течение 5 мин.
    1. Откажитесь от супернатанта с помощью вакуумного аспирации. Вымойте клетки с 25 мл свежего буфера толстой кишки и центрифуги на 800 х г в течение 5 мин.
    2. Отдохните гранулы менее чем в 1 мл свежего охлажденных colon Buffer.
    3. Поместите 50 мл полипропиленовой конической трубки на льду.

8. Коллагеназа пищеварение 2

  1. Повторите шаг 4 (Digestion 1) с оставшимися фрагментами ткани, сохраненными со ступени 6.1.

9. Ткань Disaggregation После пищеварения 2

  1. Промыть фрагменты ткани энергично вперед и назад между трубкой и 10 мл шприц через 18 G тупой конец иглы.
  2. Повторите этот флеш как минимум 7-8 полных проходов, продолжая до тех пор, пока не будут видны фрагменты ткани или мусора.

10. Фильтровые клетки

  1. Передайте подвеску дезагрегации тканей через 40 мкм-пор фильтрации ткани клеточной ткани ситечко в чистую 50 мл полипропиленовой трубки.
  2. Вымойте фильтрации ткани ячейки ситечко с 10 мл охлажденной толстой буфера для восстановления любых клеток, попавших в фильтр.

11. Утолить варесьение коллагенеза

  1. Заполните 50 мл полипропилена коническая трубка на ободе с охлажденной колонии буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Температура colon Buffer имеет решающее значение для обеспечения закалки коллагеназа деятельности.
  2. Спин при 4 кв. м и 800 х г в течение 5 мин.
  3. Откажитесь от супернатанта с помощью вакуумного аспирации.
  4. Вымойте путем повторного приостановки в 25 мл свежего охлажденных колониибуфера , а затем центрифугации при 4 КС, 800 х г в течение 5 мин.
  5. Откажитесь от супернатанта с помощью вакуумного аспирации.
  6. Объедините повторное гранулы из Collagenase Digestion 1 (шаг 7) в соответствующую трубку со ступени 11.4.
  7. Повторите шаг 11.4 (мытье и центрифугация).

12. Силика основе плотность разделения СМИ Градиент разделения

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте шаги 12-18 как можно быстрее, чтобы обеспечить быстрое закалку коллагеназной активности.

  1. После шага 11.7, resuspend каждый гранулы в 24 мл в общей сложности 44% Силика основе плотность разделения СМИ на толстой кишке.
  2. Медленно слой 8 мл средств массовой информации от шага 12,1 на каждой из трех труб, подготовленных на шаг 5.2 (содержащий 66% Силика основе плотность разделения средств массовой информации), используя 10 мл серологические пипетки. Поддерживайте устойчивый и медленный поток 44% Плотность Разделения Сми при наслоении градиента, чтобы избежать нарушения интерфейса.
  3. Тщательно сбалансировать все трубы в центрифуге ведра с помощью весовой шкалы или баланса.
  4. Спин трубки 20 мин на 859 х г в центрифуге без тормоза при 20 градусах Цельсия. Разрешить роторы прийти к полной отдохнуть перед удалением труб, заботясь, чтобы не нарушить ячейки на градиент интерфейса.

13. Сбор моноядерных ячеек из интерфейса Gradient

  1. Визуализируйте интерфейс градиента (около отметки 5 мл), где обычно присутствует белая полоса толщиной 1-2 мм (содержащая MNC).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно или не может видеть белую полосу. Тем не менее, MNC будет на этом интерфейсе и должны затуманить ясность интерфейса градиента.
  2. Вакуумный аспиратии и отбросить верхний 7 мл верхнего градиента, чтобы облегчить доступ пипетки к интерфейсу.
  3. Используя непрерывную ручную всасывание и устойчивое вращающееся движение запястья, соберите интерфейсный слой клеток в чистую полипропиленовый коническую трубку мощностью 50 мл. Собирайте до тех пор, пока интерфейс между 2 градиентами не будет ясным и рефрактивым (ясно от ячеек).
  4. Заполните трубку для сбора 50 мл охлажденных FACS Buffer. Спин при 4 градусах по Цельсию, 800 х г в течение 5 мин.
  5. Примачивайте супернатант с помощью вакуумного аспирации и приостанавливаете пеллету в 1 мл буфера FACS.
  6. Подсчитайте клетки на гемоцитометре при разбавлении 1:2 с помощью соответствующих методов исключения мертвых клеток.
  7. Приступить к FACS окрашивания или другие анализы с свежеиспятой толстой MNC.

Результаты

При работе с моделями заболеваний толстой кишки, полезно, чтобы иметь возможность как количественно и качественно оценить, среди MNC толстой кишки, несколько подмножеств иммунных клеток, участвующих в воспалительном процессе. Одноклеточная приостановка МНК, полученна...

Обсуждение

Этот визуальный протокол описывает хорошо переносимые методы изоляции моноядерных клеток толстой кишки, включая лиминпрорийские лимфоциты (LPL). Учитывая, что этот протокол был оптимизирован в оценке тяжелых посттрансплантационных моделей мышь колит, где воспалительные цитокины и тра...

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами #1K08HL088260 и #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) и Фондом детских исследований Батчелора (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). Мыши C57BL/6 и BALB/c, используемые в этом исследовании, были либо выведены в нашем учреждении, либо предоставлены Jackson Labs или Taconic.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
60 mm Petri DIshThermo Scientific150288
1x PBSCorning21-040-CV
10x PBSLonza BioWhittakerBW17-517Q
10 mL Disposable Serological PipetteCorning4100
10 mL SyringeBecton Dickinson302995
15 mL Non-Sterile Conical TubesTruLineTR2002
18 G Blunt NeedleBecton Dickinson305180
25 mL Disposable Serological PipetteCorning4250
40 μm pore size Cell StrainerCorning352340
50 mL Falcon TubeCorning21008-951
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaA4503-1KG
Fixation BufferBiolegend420801
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticumSigmaC2139
EDTA, 0.5 M Sterile SolutionAmrescoE177-500ML
Fetal Bovine SerumThermo /Fisher Scientific -HyCLoneSV30014.03
HEPESGE Healthcare-HyCloneSH30237.01
PercollGE Healthcare-Life Sciences1708901
RPMI MediumCorning17-105-CV
Sodium AzideVWR Life Science Amresco97064-646
Trypan BlueLonza BioWhittaker17-942E

Ссылки

  1. Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
  2. Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
  3. Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
  4. Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
  5. Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).
  6. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  7. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
  8. Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
  9. Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
  10. Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
  11. Harb, W. J. Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
  12. Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
  13. Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
  14. Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
  15. Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
  16. Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
  17. Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
  18. Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
  19. Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
  20. van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
  21. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
  22. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
  23. Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
  24. Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
  25. Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
  26. Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
  27. Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
  28. Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
  29. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
  30. Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  31. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  32. van der Heijden, P. j., Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

151

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены