Isolierung von Lamina Propria Mononukleären Zellen aus murine Colon mit Kollagenase E

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, mononukleäre Zellen, die in der Lamina-Propria des Dickdarms durch enzymatische Verdauung des Gewebes mit Kollagennase leben zu isolieren. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Isolierung mononukleativer Zellen, was zu einer Einzelzellsuspension führt, die wiederum für eine robuste Immunphenotypisierung verwendet werden kann.

Zusammenfassung

Der Darm ist die Heimat der größten Anzahl von Immunzellen im Körper. Die kleinen und großen Darm-Immunsysteme Polizei Exposition gegenüber exogenen Antigenen und modulieren Reaktionen auf potente mikrobiell abgeleitete Immunreize. Aus diesem Grund ist der Darm ein wichtiger Zielort für Immundysregulation und Entzündungen bei vielen Krankheiten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf entzündliche Darmerkrankungen wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, Transplantat-versus-Host-Krankheit (GVHD) nach Knochen Knochenmarktransplantation (BMT) und viele allergische und infektiöse Erkrankungen. Murine Modelle von Magen-Darm-Entzündung und Kolitis werden stark verwendet, um GI-Komplikationen zu studieren und vorklinisch zu optimieren Strategien für Prävention und Behandlung. Daten, die aus diesen Modellen über Isolation und phänotypische Analyse von Immunzellen aus dem Darm gewonnen werden, sind entscheidend für ein weiteres Immunverständnis, das zur Linderung gastrointestinaler und systemischer entzündlicher Erkrankungen angewendet werden kann. Dieser Bericht beschreibt ein hochwirksames Protokoll zur Isolierung mononuklearer Zellen (MNC) aus dem Doppelpunkt unter Verwendung einer gemischten, auf Kieselsäure basierenden Dichtegradientenschnittstelle. Diese Methode isoliert reproduzierbar eine signifikante Anzahl lebensfähiger Leukozyten und minimiert dabei die Kontamination von Schmutz und ermöglicht eine nachträgliche Immun-Phänotypisierung durch Durchflusszytometrie oder andere Methoden.

Einleitung

Obwohl der Magen-Darm-Trakt (GI) in erster Linie der Verarbeitung und Resorption von Nährstoffen aus Der Nahrung gewidmet ist, behält der GI-Trakt auch zentrale Rollen in der Integrität des Gefäß-, Lymph- und Nervensystems und zahlreicher anderer Organe durch schleimhaut- und submukosalen^{Immunsystems 1}. Das GI-Immunsystem hat eine einflussreiche Rolle sowohl in der gastrointestinalen als auch in der systemischen Gesundheit aufgrund seiner konstanten Exposition gegenüber fremden Antigenen aus Lebensmitteln, kommensalen Bakterien oder eindringenden Krankheitserregern^1,2. So muss das GI-Immunsystem ein empfindliches Gleichgewicht aufrechterhalten, in dem es nicht pathogene Antigene toleriert und gleichzeitig angemessen auf pathogene Antigene^1,2reagiert. Wenn das Gleichgewicht von Toleranz und Verteidigung gestört ist, können lokalisierte oder systemische Immundysregulation und Entzündungen auftreten, was zu einer Vielzahl von Krankheiten^1,2,3führt.

Der Darm beherbergt mindestens 70% aller Lymphzellen im Körper⁴. Die meisten primären immunologischen Wechselwirkungen umfassen mindestens eine von drei Immunstationen im Darm: 1) Peyer es Patches, 2) Intraepitheliale Lymphozyten (IEL) und 3) Lamina propria Lymphozyten (LPL). Jeder von ihnen besteht aus einem komplexen vernetzten Netzwerk von Immunzellen, die schnell auf normale Immunherausforderungen im Darm reagieren⁵. Beschränkt auf die Stroma über der Muskulatur, ist die lose strukturierte Lamina propria das Bindegewebe der Darmschleimhaut und umfasst Gerüste für den Villus, die Vaskulatur, Lymphdrainage und das Mukosalnervensystem sowie viele angeborene und adaptive Immun-Teilmengen^6,7,8,9. LPL bestehen aus CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen in einem ungefähren Verhältnis von 2:1, Plasmazellen und myeloischen Abstammungszellen einschließlich, dendritischen Zellen, Mastzellen, Eosinophilen und Makrophagen⁶.

Es gibt ein wachsendes Interesse am Verständnis der Immundysregulation und Entzündung des Darms, wie es zu verschiedenen Krankheitszuständen betrifft. Solche Bedingungen wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa manifestieren alle unterschiedliche Konzentrationsniveaus der Darmentzündung^10,11,12. Darüber hinaus können Patienten mit bösartigen oder nicht-bösartigen Erkrankungen des Markoder Immunsystems, die sich einer allogenen Knochenmarktransplantation (allo-BMT) unterziehen, verschiedene Formen der Kolitis entwickeln, einschließlich 1) direkte Toxizität durch Konditionierungsschemas vor BMT, 2) Infektionen, die durch Immunsuppression nach BMT und 3) Transplantat-versus-Host-Krankheit (GVHD) verursacht werden, die von Spender-Typ-T-Zellen angetrieben werden, die auf Spender-Allo-Antigene im Gewebe nach BMT^13,14,15reagieren. Alle diese Post-BMT-Komplikationen führen zu signifikanten Veränderungen im Immunmilieu des Darms^16,17,18. Die vorgeschlagene Methode ermöglicht eine zuverlässige Beurteilung der Immunzellakkumulation im Mausdoppel und ermöglicht, wenn sie auf murine Empfänger nach BMT angewendet wird, einen effizienten Test sowohl der Spender- als auch der Empfängerimmunzellen, die an der Transplantationstoleranz beteiligt sind^{19 ,20}. Weitere Ursachen für Darmentzündungen sind Bösartige Erkrankungen, Lebensmittelallergien oder Störungen des Darmmikrobioms. Dieses Protokoll ermöglicht den Zugang von Darm mononukleären Zellen aus dem Dickdarm und, mit Modifikationen, zu Leukozyten des Dünndarms in einem dieser präklinischen murine Modelle.

Eine PubMed-Suche mit dem Suchbegriff "Darm UND Immunzelle UND Isolation" zeigt über 200 Publikationen, die Methoden zur Dünndarmverdauung zur Extraktion von Immunzellen beschreiben. Eine ähnliche Literatursuche nach Dickdarm ergibt jedoch keine gut abgegrenzten Protokolle, die die Isolierung von Immunzellen vom Dickdarm angeben. Dies kann daran liegen, dass der Dickdarm mehr muskel- und interstitielle Schichten hat, was es schwieriger macht, vollständig zu verdauen als der Dünndarm. Im Gegensatz zu bestehenden Protokollen verwendet dieses Protokoll speziell Collagenase E von Clostridium histolyticum ohne andere bakterielle Kollagene (Collagenase D/ Collagenase I). Wir zeigen, dass mit diesem Protokoll die Verdauung des Kolongewebes unter Beibehaltung der Qualität isolierter mononukleärer Darmimmunzellen (MNC) ohne Zugabe von antiklumpenden Reagenzien wie Natriumversenat (EDTA), Dispase II und Desoxyribonuklease I (DNAse I)^21,22,23. Dieses Protokoll ist optimiert, um eine reproduzierbare robuste Extraktion von lebensfähigem MNC aus dem murinen Dickdarm für weitere gerichtete Studien zu ermöglichen und sollte sich für die Untersuchung der Immunologie des Dickdarms oder (mit Modifikationen) des Dünndarms²⁴ , ²⁵.

Protokoll

Alle Studien wurden im Rahmen von Nagetierforschungsprotokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Miami Miller School of Medicine überprüft und genehmigt wurden, das die veterinärmedizinischen Standards der American Association erfüllt. für Labortierwissenschaft (AALAS).

1. Vorbereitung von Lösungen

1. Wie in Tabelle 1 beschrieben, bereiten Sie den Colon Buffer, Silica-Based Density Separation Media 100%, Silica-Based Density Separation Media 66%, Silica-based Density Separation Media 44%, Collagenase E Digestion Buffer und FACS Buffer vor.
   1. Colon Buffer am Tag vor dem Eingriff vorbereiten und über Nacht bei 4 °C lagern.
   2. Bereiten Sie 100% Silica-basierte Dichte Trennmittel am Tag vor dem Eingriff vor und lagern Sie sie über Nacht bei 4 °C, wobei sie am Morgen des Auftauvorgangs auf Raumtemperatur platziert werden.
   3. Bereiten Sie 66% und 44% Silica-basierte Separationsmedien am Morgen der Isolierung vor, mit Raumtemperatur 100% Silica-basierte DichteTrennung simermittel und Colon Buffer.
   4. Messen Sie die entsprechende Menge an Clostridium histolyticum-abgeleitete Collagenase E und lagern Sie bei -20 °C über Nacht vor dem Eingriff. Lösen Sie sich am nächsten Morgen im entsprechenden Volumen des Colon Buffer auf, um den Kollagen-Verdauungspuffer abzuleiten. Für alle Inkubationen mit Collagenase Verdauungspuffer am Tag des Eingriffs, die Lösungen auf 37 °C vorwärmen.
2. Halten Sie für die gesamte Protokolltreppe eine Zentrifuge bei 20 °C und die Drehzahl von 859 x gbei inaktivierten Bremsen (0 Verzögerung) für die Gradientenzentrifugation. Stellen Sie eine weitere auf 4 °C und Drehzahl von 859 x g, mit der Standardverzögerung, für Waschschritte.

2. Ernte des Colon

1. Euthanisieren Sie die Maus über CO2-Erstickung gefolgt von AALAC-zugelassener Bestätigungsmethode.
2. Legen Sie die Maus in eine Supine-Position und sprühen Sie das Fell mit 70% Ethanol. Mit großen Gewebescheren, machen Sie einen vertikalen Mittellinienschnitt und setzen Sie das intakte Peritoneum aus.
3. Öffnen Sie das Peritoneum mit einer feinen Sezierschere. Verwenden Sie Zangen, um den kleinen Darm zur Seite zu bewegen und den absteigenden Dickdarm auszusetzen. Ziehen Sie am absteigenden Doppelpunkt leicht nach oben, um den rektalen Teil des Dickdarms maximal freizulegen. Schneiden Sie das distale Rektum tief im Becken und sezieren und entfernen Sie den gesamten Dickdarm als eine Einheit, vom distalen Rektum zur Cecal-Kappe.
4. Übertragen Sie den Dickdarm in 20 ml gekühlten Colon Buffer in einem 50 ml Polypropylenrohr.

3. Reinigung des Colon

1. Legen Sie den Dickdarm auf ein befeuchtetes Papiertuch und extrahieren Sie den festen Stuhl, indem Sie leichten Druck auf die Darmwand mit dem stumpfen Ende der Schere oder Zange ausüben.
2. Legen Sie den Dickdarm in eine Petrischale und spülen Sie den Darm mit 10 ml gekühltem Colon Buffer mit einer 10 ml Spritze mit 18 G stumpfer Füllnadel.
3. Übertragen Sie den Doppelpunkt auf ein Colon Buffer befeuchtetes Papiertuch und entfernen Sie die Mesenterie und Fett mit dem scharfen Ende der Schere.
4. Legen Sie den Doppelpunkt in eine Petrischale gefüllt mit 5-10 ml gekühlten Colon Buffer Agitieren manuell, um den verbleibenden Koloninhalt zu waschen. Wiederholen Sie dies 2-3 Mal.
5. Schneiden Sie den Dickdarm längs von seinem muskulöseren rektalen Ende auf den proximalen Dickdarm (erzeugt ein einzelnes rechteckiges offenes Dickdarmstück) in einer Petrischale, die mit frisch gekühltem Colon Buffer gefüllt ist. Entsorgen Sie vorhandene Medien und füllen Sie sie mit einem sauberen gekühlten Colon Buffer auf.
6. Waschen Sie den Darm 3 Mal, indem Sie ihn in der Petrischale kräftig wirbeln und nach jeder Wäsche die 5-10 ml gekühlten Colon Buffer ersetzen.
7. Legen Sie das rechteckige Kolongewebe auf ein mit Colon Buffer befeuchtetes Papiertuch und schneiden Sie es, indem Sie es horizontal und dann in kleine Fragmente (3 mm x 3 mm Abschnitte) schneiden.
8. Sammeln Sie die Doppelpunktfragmente sorgfältig mit feinen Zangen in 20 ml gekühlten Colon Buffer in einem 50 ml Polypropylen konischenRohr.
9. Waschen Sie die Doppelpunkt-Fragmente 3 mal, jede waschen in 20 ml Colon Buffer, durch kräftiges Wirbeln der Röhre für 30 s. Zwischen jeder Agitation, lassen Sie die Gewebefragmente auf den Boden des Rohres zu setzen. Dekant oder Vakuum aspirieren den Überstand und verhindern dabei den Verlust von Gewebefragmenten im Aspirationsprozess zwischen jeder Wäsche.
   HINWEIS: Es besteht keine Notwendigkeit, das Rohr nach jeder Wäsche zu wechseln.

4. Kollagenase Verdauung 1

1. Fügen Sie 20 ml des Kollagen-Verdauungspuffers zu den gewaschenen Doppelpunktfragmenten in der 50 ml Polypropylen-Konusröhre hinzu.
2. Legen Sie das geschlossene 50 ml-Rohr bei 37 °C in einen inkubierten Orbital-Shaker mit der Rotationsrate von 2 x g für 60 min. Stellen Sie sicher, dass die Gewebefragmente während der Rührung in ständiger Bewegung sind; Erhöhen Sie ggf. die Rotationsrate schrittweise, um sicherzustellen, dass sich keine Gewebefragmente am Rohrboden absetzen.

5. Vorbereiten von Silica-basierten SeparationsmedienGradienten

1. Bereiten Sie 66% und 44% Silica-basierte Dichtetrennmedien vor, indem Sie 100% Silica-basierte Dichtetrennmedien bei 20 °C (Raumtemperatur) und Colon Buffer verwenden.
2. Gießen Sie 5 ml 66% Silica-basierte Dichtetrennmedien in jeweils 3 separate 15 ml Polypropylenrohre. Bereiten Sie 3 Röhren pro Dickdarm vor. Dadurch bildet sich die höhere Dichtebasis des Gradientenisolationsverfahrens, auf das Trennmedien mit niedrigerer Dichte geschichtet werden, um den Trennverlauf zu erzeugen.
3. Bei 20 °C bis zum Gebrauch lagern.

6. Sammlung von Supernatant aus Digestion 1

1. Sammeln Sie nur den Überstand mit einer 25 ml serologischen Pipette und filtern Sie den Überstand durch ein 40 m langepore Filtrationsgewebe-Zellsieb, das nach Abschluss der Collagenase Digestion 1 in ein sauberes 50 ml Polypropylen-Konusrohr gelegt wird. Achten Sie darauf, keine vorhandenen Gewebefragmente zu aspirieren.
   HINWEIS: Bewahren Sie alle verbleibenden sichtbaren Gewebefragmente in der Röhre auf. Diese werden einer zweiten Kollagenase-Verdauung unterzogen (Schritt 8).

7. Quenching Collagenase Verdauungspuffer

1. Füllen Sie das 50 ml Polypropylenrohr vollständig mit gekühltem Colon Buffer.
   HINWEIS: Kollagenase ist bei 37 °C aktiv; daher wird dieses Enzym durch einen gekühlten Puffer inaktiviert.
2. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 4 °C bei 800 x g für 5 min.
   1. Entsorgen Sie den Überstand über Vakuumaspiration. Waschzellen mit 25 ml frischem Colon Buffer und Zentrifuge bei 800 x g für 5 min.
   2. Das Pellet in weniger als 1 ml frisch gekühltem Colon Buffer wieder aufhängen.
   3. Legen Sie das 50 ml Polypropylen konische Rohr auf Eis.

8. Kollagenase Verdauung 2

1. Wiederholen Sie Schritt 4 (Verdauung 1) mit den verbleibenden Gewebefragmenten, die ab Schritt 6.1 zurückgehalten werden.

9. Gewebedisaggregation nach Verdauung 2

1. Spülen Sie die Gewebefragmente zwischen dem Rohr und einer 10 ml Spritze kräftig zwischen dem Rohr und einer 10 ml Spritze durch eine 18 G stumpfe Nadel.
2. Wiederholen Sie diese Spülung für mindestens 7-8 komplette Passagen, bis keine groben Gewebefragmente oder Trümmer sichtbar sind.

10. Filterzellen

1. Übergeben Sie die Gewebedisaggregationssuspension durch ein 40 m-pore Filtrationsgewebe-Zellsieb in ein sauberes 50 ml Polypropylenrohr.
2. Waschen Sie das Filtrationsgewebe Zellsieb mit 10 ml gekühlten Colon Buffer, um alle Zellen im Filter verstrickt zu erholen.

11. Quenching Collagenase Verdauung

1. Füllen Sie das 50 ml Polypropylen Konusrohr bis zur Felge mit gekühltem Colon Buffer.
   HINWEIS: Die Temperatur des Colon Buffer ist entscheidend, um die Abschreckung der Kollagenaseaktivität zu gewährleisten.
2. Drehen Bei 4 °C und 800 x g für 5 min.
3. Entsorgen Sie den Überstand über Vakuumaspiration.
4. Waschen durch Wiederaufheben in 25 ml frisch gekühlten Colon Buffer, gefolgt von Zentrifugation bei 4 °C, 800 x g für 5 min.
5. Entsorgen Sie den Überstand über Vakuumaspiration.
6. Das resuspendierte Pellet von Collagenase Digestion 1 (Schritt 7) ab Schritt 11.4 auf das entsprechende Rohr bündeln.
7. Wiederholen Sie Schritt 11.4 (Waschen und Zentrifugieren).

12. Silica-basierte Dichtetrennung Medien Gradient Enkteilung

HINWEIS: Führen Sie die Schritte 12-18 so schnell wie möglich aus, um eine schnelle Abschreckung der Kollagenaseaktivität zu gewährleisten.

1. Nach Schritt 11.7, setzen Sie jedes Pellet in 24 ml insgesamt 44% Silica-basierte Dichte Separation Medien pro Dickdarm.
2. Langsam Schicht 8 ml des Mediums von Schritt 12,1 auf jedes der drei Rohre, die in Schritt 5.2 (mit 66% Silica-basierteDichte Separationsmedien) hergestellt werden, mit einer 10 ml serologischen Pipette. Halten Sie einen stetigen und langsamen Fluss der 44% Dichtetrennmedien bei gleichzeitiger Schichtung des Farbverlaufs aufrecht, um Unterbrechungen der Schnittstelle zu vermeiden.
3. Balancieren Sie sorgfältig alle Rohre innerhalb der Zentrifugeneimer mit einer Waage oder einem Gleichgewicht.
4. Drehen Sie die Rohre 20 min bei 859 x g in einer Zentrifuge ohne Bremse bei 20 °C. Lassen Sie die Rotoren vor dem Entfernen der Rohre ruhen, wobei Darauf zu achten ist, dass die Zellen an der Gradientenschnittstelle nicht gestört werden.

13. Sammeln Sie mononukleäre Zellen von der Gradientenschnittstelle

1. Visualisieren Sie die Gradientenschnittstelle (in der Nähe der 5-ml-Markierung), wobei in der Regel ein 1-2 mm dickes weißes Band (mit MNC) vorhanden ist.
   HINWEIS: Man kann oder kann kein weißes Band sehen. MNC wird jedoch an dieser Schnittstelle sein und sollte die Klarheit der Gradientenschnittstelle trüben.
2. Vakuum-Aspirat und entsorgen Sie die oberen 7 ml des oberen Farbverlaufs, um einen einfacheren Pipettenzugriff auf die Schnittstelle zu ermöglichen.
3. Mit kontinuierlicher manueller Absaugung und stetig rotierender Handgelenkbewegung, sammeln Sie die Schnittstellenschicht der Zellen in einem sauberen 50 ml Polypropylen konischen Rohr. Sammeln, bis die Schnittstelle zwischen den beiden Farbverläufen klar und refraktil (frei von Zellen) ist.
4. Füllen Sie das Sammelrohr mit 50 ml gekühltem FACS Buffer. Drehen bei 4 °C, 800 x g für 5 min.
5. Aspirieren Sie den Überstand über Vakuumaspiration und setzen Sie das Pellet in 1 ml FACS Buffer wieder aus.
6. Zählen Sie die Zellen auf einem Hämozytometer bei einer Verdünnung von 1:2 mit geeigneten Methoden zum Ausschluss von toten Zellen.
7. Fahren Sie mit FACS-Färbung oder anderen Assays mit frisch isoliertem kolonischen MNC fort.

Ergebnisse

Bei der Arbeit mit murinen Darmerkrankungen Modellen ist es hilfreich, sowohl quantifizieren als auch qualitativ bewerten zu können, unter den MNC des Dickdarms, mehrere Immunzellen-Subsets, die am Entzündungsprozess beteiligt sind. Die durch die Anwendung dieses Protokolls erhaltene einzellige Suspension von MNC ermöglicht eine solche phänotypische Charakterisierung in robuster und reproduzierbarer Weise. Als Grundsatzbeweis für die Anwendung dieser Isolationsmethode unter verschied...

Diskussion

Dieses visuelle Protokoll beschreibt gut verträgliche Methoden zur Isolierung von mononukleären kolonischen Zellen einschließlich Lamina propria lymphozyten (LPL). Angesichts der Tatsache, dass dieses Protokoll bei der Bewertung schwerer Mauskolitismodelle nach der Transplantation optimiert wurde, bei denen entzündliche Zytokine und Gewebeverletzungen sich für eine schlechte Lebensfähigkeit von wiedergewonnenem MNC eignen, gehen wir davon aus, dass diese Methoden in andere Anwendungen, die eine phätotypische Analy...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm Petri DIsh	Thermo Scientific	150288
1x PBS	Corning	21-040-CV
10x PBS	Lonza BioWhittaker	BW17-517Q
10 mL Disposable Serological Pipette	Corning	4100
10 mL Syringe	Becton Dickinson	302995
15 mL Non-Sterile Conical Tubes	TruLine	TR2002
18 G Blunt Needle	Becton Dickinson	305180
25 mL Disposable Serological Pipette	Corning	4250
40 μm pore size Cell Strainer	Corning	352340
50 mL Falcon Tube	Corning	21008-951
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A4503-1KG
Fixation Buffer	Biolegend	420801
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum	Sigma	C2139
EDTA, 0.5 M Sterile Solution	Amresco	E177-500ML
Fetal Bovine Serum	Thermo /Fisher Scientific -HyCLone	SV30014.03
HEPES	GE Healthcare-HyClone	SH30237.01
Percoll	GE Healthcare-Life Sciences	1708901
RPMI Medium	Corning	17-105-CV
Sodium Azide	VWR Life Science Amresco	97064-646
Trypan Blue	Lonza BioWhittaker	17-942E