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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le but de ce protocole est d'isoler les cellules mononucléaires qui résident dans la lamina propria du côlon par digestion enzymatique du tissu à l'aide de collagène. Ce protocole permet l'isolement efficace des cellules mononucléaires résultant en une suspension de cellules simples qui à son tour peut être utilisé pour l'immunophénotypage robuste.

Résumé

L'intestin est la maison au plus grand nombre de cellules immunitaires dans le corps. Les petits et grands systèmes immunitaires intestinaux police l'exposition aux antigènes exogènes et modulent les réponses à de puissants stimuli immunitaires microbiens dérivés. Pour cette raison, l'intestin est un site cible principal de la dysrégulation immunitaire et de l'inflammation dans beaucoup de maladies comprenant mais, non limité aux maladies inflammatoires d'entrailles telles que la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse, la maladie de greffe-contre-hôte (GVHD) après os greffe de moelle (BMT), et de nombreuses conditions allergiques et infectieuses. Les modèles murines de l'inflammation gastro-intestinale et de la colite sont fortement employés pour étudier des complications de GI et pour optimiser précliniquement des stratégies pour la prévention et le traitement. Les données glanées à partir de ces modèles par l'intermédiaire de l'isolement et de l'analyse phénotypique des cellules immunitaires de l'intestin sont essentielles à une compréhension immunitaire plus poussée qui peut être appliquée pour améliorer les troubles gastro-intestinaux et inflammatoires systémiques. Ce rapport décrit un protocole très efficace pour l'isolement des cellules mononucléaires (MNC) du côlon utilisant une interface mélangée de gradient de densité de silice-basée. Cette méthode isole reproductiblement un nombre significatif de leucocytes viables tout en minimisant les débris contaminants, permettant le phénotypage immunitaire ultérieur par cytométrie d'écoulement ou d'autres méthodes.

Introduction

Bien que le tractus gastro-intestinal (GI) soit principalement dédié au traitement et à la réabsorption des nutriments des aliments, le tractus gastro-intestinal maintient également des rôles centraux dans l'intégrité des systèmes vasculaires, lymphatiques et nerveux et de nombreux autres organes par son système immunitaire muqueux et submucosal1. Le système immunitaire gastro-intestinal et systémique a un rôle influent en raison de son exposition constante à des antigènes étrangers provenant d'aliments, de bactéries commensales ou d'agents pathogènes envahissants1,2. Ainsi, le système immunitaire GASTRO doit maintenir un équilibre délicat dans lequel il tolère les antigènes non pathogènes tout en répondant de manière appropriée aux antigènes pathogènes1,2. Lorsque l'équilibre de la tolérance et de la défense est perturbé, la dysrégulation immunitaire localisée ou systémique et l'inflammation peuvent se produire résultant en une myriade de maladies1,2,3.

L'intestin abrite au moins 70% de toutes les cellules lymphoïdes dans le corps4. La plupart des interactions immunologiques primaires impliquent au moins une des trois stations immunitaires dans l'intestin : 1) Patchs de Peyer, 2) lymphocytes intraépithélial (IEL) et 3) lymphocytes lamina propria (LPL). Chacun d'eux est composé d'un réseau complexe interconnecté de cellules immunitaires qui répondent rapidement aux défis immunitaires normaux dans l'intestin5. Limité au stroma au-dessus de la muqueuse musculaire, la propria lamina vaguement structurée est le tissu conjonctif de la muqueuse intestinale et comprend l'échafaudage pour le villus, la vascularisation, le drainage lymphatique, et le système nerveux muqueux, ainsi que de nombreux innés et les sous-ensembles immunitaires adaptatifs6,7,8,9. LPL sont composés de CD4et CD8- lymphocytes T dans un rapport approximatif de 2:1, les cellules plasmatiques et les cellules de lignée myéloïde, y compris, les cellules dendritiques, les mastocytes, les éosinophiles et les macrophages6.

Il y a un intérêt croissant dans la compréhension de la dysrégulation immunisée et de l'inflammation de l'intestin en ce qui concerne divers états de la maladie. Des conditions telles que la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse se manifestent toutes de différents niveaux d'inflammation du côlon10,11,12. En outre, les patients présentant des troubles malins ou non malins de la moelle ou du système immunitaire qui subissent une transplantation allogénique de moelle (allo-BMT) peuvent développer diverses formes de colite comprenant 1) toxicité directe des régimes de conditionnement avant BMT, 2) infections provoquées par immunosuppression après BMT et 3 la maladie de greffe-contre-hôte (GVHD) conduite par les cellules T de distributeur-type réagissant aux allo-antigènes de distributeur dans les tissus après BMT13,14,15. Toutes ces complications post-BMT entraînent des altérations significatives dans le milieu immunitaire des intestins16,17,18. La méthode proposée permet une évaluation fiable de l'accumulation des cellules immunitaires dans le côlon de la souris et, lorsqu'elle est appliquée aux receveurs de murine après bMT, facilite un test efficace des cellules immunitaires des donneurs et des receveurs impliqués dans la tolérance à la greffe19 ,20. D'autres causes de l'inflammation intestinale incluent des malignités, des allergies alimentaires, ou une perturbation du microbiome intestinal. Ce protocole permet l'accès des cellules mononucléaires intestinales du côlon et, avec des modifications, aux leucocytes de l'intestin grêle dans l'un de ces modèles précliniques de murine.

Une recherche PubMed utilisant les termes de recherche "intestin ET cellule immunitaire ET isolement" révèle plus de 200 publications décrivant les méthodes de digestion de l'intestin grêle pour extraire les cellules immunitaires. Cependant, une recherche semblable de littérature pour le côlon ne donne aucun protocole bien délimité spécifiant l'isolement des cellules immunitaires du côlon. C'est peut-être parce que le côlon a plus de couches musculaires et interstitielles, ce qui le rend plus difficile à digérer complètement que l'intestin grêle. Contrairement aux protocoles existants, ce protocole utilise spécifiquement la collagène E de Clostridium histolyticum sans autres collagènes bactériens (Collagenase D/ Collagenase I). Nous démontrons que, utilisant ce protocole, la digestion du tissu colonique peut être réalisée tout en préservant la qualité des cellules immunitaires mononucléaires d'intestin d'isolement (MNC) sans l'addition des réactifs anti-clumping tels que le versenate de sodium (EDTA), Dispase II, et deoxyribonuclease I (DNAse I)21,22,23. Ce protocole est optimisé pour permettre l'extraction robuste reproductible de MNC viable du côlon murine pour d'autres études dirigées et devrait se prêter à l'étude de l'immunologie du côlon ou (avec des modifications) l'intestin grêle24, 25.

Protocole

Toutes les études ont été menées dans le cadre de protocoles de recherche sur les rongeurs examinés et approuvés par l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l'Université de Miami Miller School of Medicine, qui répond aux normes vétérinaires établies par l'American Association pour les sciences animales de laboratoire (AALAS).

1. Préparation de solutions

  1. Comme décrit dans le tableau 1, préparez le tampon de colon, les médias de séparation de densité basés sur la silice 100%, les médias de séparation de densité basés sur la silice 66%, les médias de séparation de densité basés sur la silice 44%, le tampon de digestion de collagène E, et le tampon FACS.
    1. Préparer Le tampon Colon la veille de l'intervention et conserver la nuit à 4 oC.
    2. Préparer 100% Silica-Based Density Separation Media la veille de l'intervention et stocké pendant la nuit à 4 oC, en plaçant à température ambiante le matin de la procédure pour décongeler.
    3. Préparer 66% et 44% Silica-Based Separation Media le matin de l'isolement, en utilisant la température ambiante 100% Silica-Based Density Separation Media et Colon Buffer.
    4. Mesurer la quantité appropriée de Clostridium histolyticum-dérivé de collagène E et stocker à -20 oC pendant la nuit avant la procédure. Le lendemain matin, dissoudre dans le volume approprié de Colon Buffer pour dériver Collagenase Digestion Buffer. Pour toutes les incubations avec Collagenase Digestion Buffer le jour de la procédure, préchauffez les solutions à 37 oC.
  2. Pour l'ensemble des étapes du protocole, garder une centrifugeuse à 20 oC et la vitesse de rotation de 859 x g,avec des freins inactivés (0 décélération) pour la centrifugation de gradient. Définir un autre à 4 oC et une vitesse de rotation de 859 x g, avec la décélération standard, pour les étapes de lavage.

2. Récolte du Colon

  1. Euthanasiez la souris par asphyxie co2 suivie d'une méthode de confirmation approuvée par l'AALAC.
  2. Placez la souris en position de supine et vaporisez la fourrure avec 70 % d'éthanol. À l'aide de gros ciseaux de tissu, faire une incision verticale de la ligne médiane et exposer le péritoine intact.
  3. À l'aide de ciseaux fins de dissection, ouvrir le péritoine. Utilisez des forceps pour déplacer les petites entrailles d'un côté et exposer le côlon descendant. Tirez légèrement vers le haut sur le côlon descendant pour exposer au maximum la partie rectale du côlon. Couper le rectum distal profondément dans le bassin et disséquer et enlever le côlon entier comme une unité, du rectum distal au capuchon de cecal.
  4. Transférer le côlon dans un tampon de colon réfrigéré de 20 ml dans un tube de polypropylène de 50 ml.

3. Nettoyage du colon

  1. Placez le côlon sur une serviette en papier humidifiée et extrayez les selles solides en appliquant une légère pression sur la paroi intestinale avec l'extrémité émoussée des ciseaux ou des forceps.
  2. Placer le côlon dans un plat Petri et rincer l'intestin avec 10 ml de tampon de colon réfrigéré à l'aide d'une seringue de 10 ml avec une aiguille de remplissage émoussée de 18 G.
  3. Transférer le côlon dans un tampon De papier absorbant Colon et enlever la mésenterie et la graisse avec l'extrémité pointue des ciseaux.
  4. Placer le côlon dans un plat Petri rempli de 5-10 ml refroidi Colon Buffer agitant manuellement pour laver le reste du contenu du côlon. Répéter 2-3 fois.
  5. Couper le côlon longitudinalement de son extrémité rectale plus musclée au côlon proximal (générant une seule pièce rectangulaire ouverte du côlon) dans un plat Petri rempli de tampon de colon frais réfrigéré. Jetez les supports existants et remplissez-le avec un tampon Colon propre et réfrigéré.
  6. Laver l'intestin 3 fois en le tourbillonnant vigoureusement dans le plat Petri et en remplaçant les 5-10 ml de tampon de colon réfrigéré après à chaque lavage.
  7. Placez le tissu rectangulaire du côlon sur une serviette en papier humidifiée avec le tampon de colon et coupez-le en le coupant horizontalement puis en petits fragments (3 mm x 3 millimètres sections).
  8. Recueillir soigneusement les fragments de deux points à l'aide de forceps fins dans 20 ml de tampon de colon réfrigéré dans un tube conique en polypropylène de 50ml.
  9. Laver les fragments de deux points 3 fois, chaque lavage dans 20 ml De tampon de colon, en faisant tourbillonner vigoureusement le tube pendant 30 s. Entre chaque agitation, laissez les fragments de tissu se déposer au fond du tube. Décant ou aspirateur aspirer le supernatant tout en empêchant la perte de fragment de tissu dans le processus d'aspiration entre chaque lavage.
    REMARQUE: Il n'est pas nécessaire de changer le tube après chaque lavage.

4. Digestion de collagène 1

  1. Ajouter 20 ml du tampon de digestion de Collagène aux fragments lavés de deux points dans le tube conique de polypropylène de 50 ml.
  2. Placer le tube fermé de 50 ml à 37 oC dans un shaker orbital incubé avec un taux de rotation fixé à 2 x g pendant 60 min. Assurez-vous que les fragments de tissu sont en mouvement constant pendant l'agitation; si nécessaire, augmentez le taux de rotation progressivement pour s'assurer qu'aucun fragment de tissu ne s'installe au fond du tube.

5. Préparer des gradients de médias de séparation basés sur la silice

  1. Préparer 66 % et 44 % de cellules à base de silice, en utilisant un support de séparation de densité à base de silice à 100 % à 20 oC (température ambiante) et un tampon De colon.
  2. Verser 5 ml de 66 % de silice à base de densité de séparation Dans chacun des 3 tubes de polypropylène séparés de 15 ml. Préparer 3 tubes par côlon. Cela forme la base de densité plus élevée de la procédure d'isolement de gradient, sur laquelle les supports de séparation de densité inférieure seront superposés pour créer le gradient de séparation.
  3. Conserver à 20 oC jusqu'à utilisation.

6. Collection de Supernatant de Digestion 1

  1. Recueillir seulement le supernatant à l'aide d'une pipette sérologique de 25 ml et filtrer le supernatant à travers une passoire à cellules de filtration de 40 porres placée dans un tube conique en polypropylène propre de 50 ml, après que la Digestion Decollagène 1 soit terminée. Veillez à ne pas aspirer les fragments de tissu existants.
    REMARQUE: Conservez les fragments de tissu visibles restants dans le tube. Ceux-ci subiront la digestion de deuxième collagène (étape 8).

7. Tampon de digestion de collagène de Collagène quenching

  1. Remplir complètement le tube de polypropylène de 50 ml de tampon de colon réfrigéré.
    REMARQUE: La collagène est active à 37 oC; tampon refroidi inactive donc cette enzyme.
  2. Centrifuger le tube à 4 oC à 800 x g pendant 5 min.
    1. Jeter le supernatant par aspiration sous vide. Laver les cellules avec 25 ml de tampon de colon frais et centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min.
    2. Resuspendre la pastille en moins de 1 ml de tampon de colon frais réfrigéré.
    3. Placer le tube conique en polypropylène de 50 ml sur la glace.

8. Digestion de collagène 2

  1. Répétez l'étape 4 (Digestion 1) avec les fragments de tissu restants retenus de l'étape 6.1.

9. Désaggrément des tissus après digestion 2

  1. Rincer vigoureusement les fragments de tissu entre le tube et une seringue de 10 ml à travers une aiguille émoussée de 18 G.
  2. Répétez cette chasse d'eau pour un minimum de 7-8 passages complets, en continuant jusqu'à ce qu'aucun fragment de tissu brut ou des débris ne soient visibles.

10. Cellules filtrantes

  1. Passez la suspension de désaggrément des tissus à travers une passoire à cellules de filtration de 40 porres dans un tube de polypropylène propre de 50 ml.
  2. Laver la passoire à cellules de tissu de filtration avec 10 ml de tampon de colon réfrigéré pour récupérer toutes les cellules emprisonnées dans le filtre.

11. Digestion de collagène étanchéité

  1. Remplir le tube conique en polypropylène de 50 ml jusqu'à la jante avec un tampon de colon réfrigéré.
    REMARQUE: La température de Colon Buffer est essentielle pour assurer l'étanchéité de l'activité de collagène.
  2. Faire tourner à 4 oC et 800 x g pendant 5 min.
  3. Jeter le supernatant par aspiration sous vide.
  4. Laver en reconfinant en 25 ml de tampon de colon frais etréfrigéré, suivi d'une centrifugation à 4 oC, 800 x g pendant 5 min.
  5. Jeter le supernatant par aspiration sous vide.
  6. Regroupez le granule resuspendu de La Digestion De Collagène 1 (étape 7) à son tube correspondant à partir de l'étape 11.4.
  7. Répéter l'étape 11.4 (lavage et centrifugation).

12. Séparation de la densité basée sur la silice Gradient Demlaï

REMARQUE: Effectuer les étapes 12-18 aussi rapidement que possible, afin d'assurer un étanchéité rapide de l'activité de collagène.

  1. Après l'étape 11.7, resuspendre chaque granule dans 24 mL total de 44% Silica-based Density Separation Media par colon.
  2. Couche lentement 8 ml du support à partir de l'étape 12.1 sur chacun des trois tubes préparés à l'étape 5.2 (contenant 66% de silice à base de densité de séparation Des médias), à l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml. Maintenir un flux régulier et lent du support de séparation de densité de 44 % tout en superposant le gradient afin d'éviter la perturbation de l'interface.
  3. Équilibrez soigneusement tous les tubes dans les seaux de centrifugeuse à l'aide d'une balance ou d'un équilibre.
  4. Faire tourner les tubes 20 min à 859 x g dans une centrifugeuse sans frein à 20 oC. Permettre aux rotors de s'immobiliser avant d'enlever les tubes, en prenant soin de ne pas perturber les cellules à l'interface de gradient.

13. Recueillir des cellules mononucléaires à partir de l'interface Gradient

  1. Visualisez l'interface de gradient (près de la marque de 5 ml), où une bande blanche de 1 à 2 mm d'épaisseur (contenant mNC) est présente.
    REMARQUE: On peut ou ne peut pas voir une bande blanche. Cependant, MNC sera à cette interface et devrait obscurcir la clarté de l'interface de gradient.
  2. Aspirez et videz les 7 ml supérieurs du gradient supérieur pour faciliter l'accès à l'interface.
  3. À l'aide d'une aspiration manuelle continue et d'un mouvement régulier du poignet, recueillir la couche d'interface des cellules dans un tube conique en polypropylène propre de 50 ml. Recueillir jusqu'à ce que l'interface entre les 2 gradients est clair et réfractaire (clair des cellules).
  4. Remplissez le tube de collecte de 50 ml de tampon FACS réfrigéré. Faire tourner à 4 oC, 800 x g pendant 5 min.
  5. Aspirez le supernatant par aspiration sous vide et suspendez la pastille dans 1 mL de FACS Buffer.
  6. Compter les cellules sur un hémocytomètre à une dilution 1:2 en utilisant des méthodes appropriées d'exclusion des cellules mortes.
  7. Procédez à la coloration FACS ou à d'autres essais avec le MNC colonique fraîchement isolé.

Résultats

En travaillant avec des modèles de maladie du côlon maurine, il est utile d'être en mesure de quantifier et d'évaluer qualitativement, parmi le MNC du côlon, plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires impliqués dans le processus inflammatoire. La suspension unicellulaire de MNC obtenue par l'application de ce protocole facilite une telle caractérisation phénotypique d'une manière robuste et reproductible. Comme preuve de principe pour l'application de cette méthode d'isol...

Discussion

Ce protocole visuel décrit des méthodes bien tolérées pour l'isolement des cellules mononucléaires du côlon, y compris les lymphocytes lamina propria (LPL). Étant donné que ce protocole a été optimisé dans l'évaluation des modèles graves de colite de souris post-transplantation où les cytokines inflammatoires et les lésions tissulaires se prêtent à une faible viabilité de la MNC récupérée, nous prévoyons que ces méthodes peuvent être traduites à d'autres applications nécessitant une analyse phé...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Ce travail a été appuyé par des subventions #1K08HL088260 et #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), et la Batchelor Foundation for Pediatric Research (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). Les souris C57BL/6 et BALB/c utilisées dans cette étude ont été élevées dans notre établissement ou fournies par Jackson Labs ou Taconic.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
60 mm Petri DIshThermo Scientific150288
1x PBSCorning21-040-CV
10x PBSLonza BioWhittakerBW17-517Q
10 mL Disposable Serological PipetteCorning4100
10 mL SyringeBecton Dickinson302995
15 mL Non-Sterile Conical TubesTruLineTR2002
18 G Blunt NeedleBecton Dickinson305180
25 mL Disposable Serological PipetteCorning4250
40 μm pore size Cell StrainerCorning352340
50 mL Falcon TubeCorning21008-951
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaA4503-1KG
Fixation BufferBiolegend420801
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticumSigmaC2139
EDTA, 0.5 M Sterile SolutionAmrescoE177-500ML
Fetal Bovine SerumThermo /Fisher Scientific -HyCLoneSV30014.03
HEPESGE Healthcare-HyCloneSH30237.01
PercollGE Healthcare-Life Sciences1708901
RPMI MediumCorning17-105-CV
Sodium AzideVWR Life Science Amresco97064-646
Trypan BlueLonza BioWhittaker17-942E

Références

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