Glioblastoma için 3D Spheroid Model

Özet

Burada glioblastoma için kullanımı kolay bir istila çıktısını tanımlıyoruz. Bu töz glioblastoma kök benzeri hücreler için uygundur. İstilanın, göçün ve çoğalmanın kolay ölçülmesi için bir Fiji makrosu da tanımlanmıştır.

Özet

İki boyutlu (2D) hücre kültürleri in vivo tümör büyümesini tatmin edici bir şekilde taklit etmez. Bu nedenle üç boyutlu (3D) kültür spheroid modelleri geliştirilmiştir. Bu modeller nöro-onkoloji alanında özellikle önemli olabilir. Gerçekten de, beyin tümörleri sağlıklı beyin ortamı işgal eğilimi var. Burada tümör invazyonunu incelemek için geliştirdiğimiz ideal 3Boyutlu glioblastoma spheroid tabanlı bir test tanımlıyoruz. Bu analizi başarıyla gerçekleştirmek için tüm teknik ayrıntıları ve analitik araçları salıyoruz.

Giriş

Birincil veya ticari olarak mevcut hücre hatları kullanılarak yapılan çalışmaların çoğunda, tahliller tek katmanlı kültürler olarak plastik yüzeylerde yetiştirilen hücreler üzerinde gerçekleştirilir. Hücre kültürünü n in vivo 3D hücre ortamını taklit etmediği için, hücre kültürünü 2B olarak yönetmek dezavantajları temsil eder. 2B kültürlerde, tüm hücre yüzeyi ortamla doğrudan temas halindedir, hücre büyümesini değiştirir ve ilaç bulunabilirliğini değiştirir. Ayrıca, fizyolojik olmayan plastik yüzey hücre farklılaşmasını tetikler^1. Bu zorlukların üstesinden gelmek için üç boyutlu kültür modelleri geliştirilmiştir. Onlar tümörlerin çok hücreli mimarisi ve heterojenite taklit avantajı var², ve böylece katı tümörler için daha uygun bir model olarak kabul edilebilir³. Küresel lerin karmaşık morfolojisi ilaç penetrans ve direnç⁴daha iyi değerlendirilmesine katkıda bulunur. Küresel tümör heterojenitesi oksijen ve besin lerin difüzyonunu ve farmakolojik ajanlara yanıtı etkiler (Şekil 1A). Küresel boyut 300 μm'ye ulaştığında oksijen difüzyonu değişir ve küreseloidin merkezinde hipoksik bir ortam ortaya çıkarır(Şekil 1A,C). Metabolitler de hücre tabakaları ile daha az nüfuz ve metabolik reaksiyonlar telafi⁵yer alır. Küresel çapı arttığında, nekrotik çekirdekler görülebilir, daha fazla taklit özellikleri birçok katı kanserlerde bulunan, agresif beyin kanseri glioblastoma dahil (GBM)⁶.

Glioblastom için birkaç 2D veya 3D invazyon tahlilleri literatürde bildirilmiştir^7,8. İki boyutlu tahliller esas olarak ince bir matris tabakası üzerinde yatay bir düzlemde veya Boyden odası tahlil⁹işgali incelemek içindir. Klasik glioblastoma hücre hatları¹⁰kullanılarak 3Boyutlu spheroid kültürleri ile üç boyutlu tahliller tanımlanmıştır. Daha karmaşık varyantlar çatışma kültürleri¹¹tümör spheroids tarafından beyin organoidlerin invazyonu ile temsil edilmektedir. Ancak, herhangi bir laboratuvar için kolay kullanımlı ve tekrarlanabilir bir test geliştirmek hala önemlidir. Hasta örneklerinden glioblastoma kök benzeri hücreler üretmek için bir protokol geliştirdik. Bu tahlillerin sayısallaştırılması kolayca yönetilebilir ve sadece açık erişimli çevrimiçi yazılım gerektirir. Kısaca, tümör parçaları küçük parçalar halinde kesilir ve enzimatik olarak sindirilir. Sindirimden elde edilen tek hücreler nörobazal ortamda yetiştirilir. 4-7 gün sonra küresel yapılar kendiliğinden oluşur. Fare modellerinde intrakranial implantasyon üzerine, psödo-palisading hücreleri ile çevrili bir nekrotik çekirdek sergileyen tümörler oluştururlar¹². Bu, GBM hastalarında bulunan özelliklere çok benzer.

Bu makalede, tekrarlanabilirliği sağlamak için belirlenen sayıda hücreden küresel üreme protokolümüzü açıklıyoruz. Bu amaçla iki tamamlayıcı matris kullanılabilir: Matrigel ve kollajen tip I. Matrigel büyüme faktörleri ile zenginleştirilmiştir ve hücre bağlanması ve göçü için gerekli olan memeli bazal zarını taklit eder. Öte yandan, kollajen tip I, stroma yapısal bir unsur, en sık görülen fibrillary ekstrasellüler matriks ve hücre invazyon tahlillerinde kullanılır. Burada, göç ve proliferasyon tahlilleri yaparak GBM küresel modelimizi gösteriyoruz. Analiz sadece sabit zaman noktalarında değil, aynı zamanda canlı görüntüleme ile küresel genişleme ve hücre hareketi izleyerek yapıldı. Ayrıca morfolojik detayları görselleştirmek için elektron mikroskobu yapıldı.

Protokol

Tüm hastalardan (Yerel etik komitesi yönetmeliklerine göre Haukeland Hastanesi, Bergen, Norveç'ten) yazılı onay alındı. Protokolümüz kurumumuzun insan araştırmaları etik komitesinin yönergelerini takip eder.

1. Tek tip boyutta tümör küresellerinin üretimi

NOT: Kök benzeri hücreler b27 takviyesi ile tamamlanan nörobazal ortamda kültürlü, heparin, FGF-2, penisilin, ve streptomisin, önceki makalelerde açıklandığı gibi¹². Bu hücreler kültürde kendiliğinden küresel oluştururlar.

1. Tümör hücrelerini 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve hücreleri 0,5-1 mL ayrışma enzimi ile kuluçkaya yatırın (Bkz. Malzeme Tablosu)37 °C'de 5 dakika süreyle.
2. 4-4,5 mL PBS ile yıkayın ve tam büyüme ortamının 10 mL'sini ekleyin (komple nörobazal ortam, cNBM).
3. Trypan mavisi ve hücre sayma odası slaytı ile otomatik sayma tekniği kullanarak hücreleri say.
4. Sferoid başına 10⁴ hücreli 100 küresel sferoid üretmek için (tercih edilen boyuta göre) 10⁶ hücreyi 8 mL NBM'de 2 mL ile %2 ml'lik metilselüloz ile karıştırın.
5. Süspansiyonu steril bir sistem kabına aktarın ve çok kanallı pipetle 100 μL/iyi yi 96 iyi yuvarlak alt plakaya dağıtın.
6. Plakayı 37 °C, %5 CO₂ ve %95 nem de kuluçkaya yatırın. Eşit büyüklükte küresel ler oluşacak ve 3-4 gün sonra kullanılabilir.

2. Üç boyutlu deneyler

1. Çoğalması
   1. Hazırlık
      1. Inhibitörleri (örneğin, Şekil 4A'dakigibi rotenon) ve 100°L ortadaki kimyasalları askıya alın ve her kuyuda 100°L orta (yani kuyu başına bir küresel oid) ekleyin.
      2. Plakayı 37 °C, %5 CO₂ve %95 nem de kuluçkaya yatırın.
   2. Görüntü edinimi ve analizi
      1. T_0'da bir dizi koşul oluşturmak için brightfield'da bir video mikroskobuyla fotoğraf çekin ve aşağıdaki saatlerde beklenen.
      2. Resimleri el ile veya yarı otomatik bir şekilde analiz etmek için Fiji'yi kullanın. Bunu el ile yapmak için, serbest seçim aracı ile küresel çekirdek etrafında bir daire çizin ve her küresel alanın ölçün. Görüntüleri yarı otomatik bir şekilde analiz etmek için, Ek Belge 1'de yalnızca //Core Area ile gösterilen makroyu kullanın.
2. Işgali
   1. Hazırlık
      1. 1 mg/mL son konsantrasyonda tip I kollajen, 1x PBS, 0.023xV_kollajen,1 M sodyum hidroksit ve steril H₂O. 30 dakika buz üzerinde çözelti inkübün tip I kollajen ile buz üzerinde bir tüp kollajen matris hazırlayın.
      2. 500 μL tüplerde yuvarlak alt kuyu plakasından küresel leri toplayın ve 200 μL 1x PBS ile 2x yıkayın.
      3. Pipet küresel leri kollajen matrisin 100 μL'lik kısmına dikkatlice yerleştirin ve normal 96 kuyu plakalı bir kuyunun ortasına yerleştirin.
      4. 37 °C'de 30 dakika kollajen jel inkübün ve sonra jel üstüne cNBM ekleyin. Inhibitörler veya aktivatörler (örneğin, Şekil 4B, 4C'degösterildiği gibi hidrojen klorür) bu adımda ortama eklenebilir.
   2. Görüntü edinimi ve analizi
      1. Kollajen eklenmesinden sonra brightfield modunda 24 saat video mikroskobu ile sırayla fotoğraf çekin.
      2. Resimleri el ile veya yarı otomatik bir şekilde analiz etmek için Fiji'yi kullanın. Bunu el ile yapmak için, serbest seçim aracı ile çekirdek ve küresel toplam alanı etrafında çizmek ve çekirdek alanı ile toplam alanı çıkararak her küresel invaziv alanı ölçmek. Görüntüleri yarı otomatik bir şekilde analiz etmek için, invaziv alanı belirlemek için Ek Belge 1'de belirtildiği gibi makroyu kullanın.
3. Geçiş
   1. Hazırlık
      1. 37 °C'de 30 dakika boyunca NBM'de Matrigel (0.2 mg/mL) ile 6 kuyulu bir plaka katın, sonra Matrigel'i çıkarın ve 2 mL cNBM ekleyin.
      2. Spheroidleri yuvarlak alt kuyu plakasından 6 kuyu plakasına 50 μL cNBM'ye aktarın.
      3. Plakayı 37 °C'de kuluçkaya yatırın ve küresel lerin yapışmasını bekleyin.
      4. 24 saat kuluçkadan sonra, 10 ng/mL Hoechst ile leke ve 37 °C'de 30 dk kuluçkaya yatırın.
   2. Görüntü edinimi ve analizi
      1. Brightfield'da bir video mikroskobu kullanarak görüntü elde edin. 405 nm lazer Hoechst boyama görselleştirme için kullanılır.
      2. Resimleri analiz etmek ve Makroyu Ek Belge 1'debelirtildiği gibi çalıştırmak için Fiji yazılımını kullanın.
         NOT: Kuyunun dibine dokunmak veya süpernatantı tamamen çıkarmak küresel lere zarar verir. Kollajen tip I jel işleme için, kollajen polimerizasyon önlemek için buz üzerinde jel tutmak, pH değişikliği jel kompaktlık etkileyecek, çünkü asidik bir bileşen eklemeyin, ve pipet hücreleri hızla hücre ölümü ve jel bozulmasını önlemek için kollajen içine.

3. Fiji Makro

NOT: Fiji, kamu malı olarak geliştirilen ve makroların geliştirilmesinin görüntü analizini hızlandırmasına olanak tanıyan bir görüntü analizi programıdır. Manuel analiz de mümkündür, ancak bu yavaş bir süreçtir ve önyargılar getirebilir. Görüntüler, yazılımdaki sürükle ve bırak ile içe aktarılabilir ve YG Manager Tools eklentisi ile ölçülebilir. Bu çalışmada kullanılan prosedür aşağıda açıklanmıştır:

1. Makro penceresini açın: Eklentiler | Makrolar | İnteraktif Tercüman.
2. Aşağıdaki uyarlanmış mor döngüyü kopyalayın ve yapıştırın. Mor cümlelertutun ve ilgi yeşil cümleler ekleyin(Ek Belge 1).
3. Tüm serileri analiz etmek için, belirli bir nicelik için parametreleri kırmızı ya da Makrolar'ı kullanarak çalıştırın | Makro'yu çalıştırın veya Ctrl+Rtuşuna basın.
4. İlgi alanı (YG) tarafından kontrol edin ve gerekirse el ile uyarla.

4. Küresellerin elektron mikroskobu

NOT: Aşağıdaki adımların çoğu kimyasal bir başlık içinde yapılmalıdır.

1. Fiksasyon adımı
   1. Kesilmiş pipet ucu ile küresel toplamak, bir 1.5 mL tüp koymak ve 0.1 M fosfat tampon (PB) ile 1x yıkayın.
   2. Küresel oidi bir gecede 4 °C'de %2 glutaraldehit/%2 paraformaldehit (PFA) 0,1 M PB olarak düzeltin.
   3. Fiksasyon çözeltisini 0,1 M PB'de %1 PFA çözeltisi ve ardından numune hazırlama ile değiştirin.
2. Numune hazırlama
   1. Bir süzgeç içine spheroids aktarın ve küresel hasarı önlemek için bir cam kabına koyun.
   2. 3x'i 0,1 M PB ile dikkatlice yıkayın.
   3. Karanlıkta 2 saat osmiyum ile kuluçka. Osmiyum%4'ü %1 0,1 M PB tamponunda seyreltin.
   4. 3x'i 0,1 M PB ile dikkatlice yıkayın.
      1. Aşağıdaki gibi dehydrate: 10 dakika için% 50 etanol, 10 dakika için% 70 etanol, 15 dakika için 2x 90% etanol, 2x 100% etanol 20 dakika ve 30 dakika için 2x aseton.
   5. Örnekleri 50/50 aseton/rekarn karışımında 2 saat kuluçkaya yatırın. Bu adımda EPON reşinini hazırlayın (Embed-812: 11.25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4.5 g).
   6. Aseton/rekarn karışımını atın, taze hazırlanmış rezorile değiştirin ve bir gecede kuluçkaya yatırın.
   7. Resenini yenisi ile değiştirin ve 2-6 saat arasında kuluçkaya yatırın.
   8. Reşattaki küresel leri 60 °C'de 48-72 saat kalıba ekleyin.

Sonuçlar

Protokoller bölümünde açıklandığı gibi spheroidler hazırlandı ve göç, invazyon, proliferasyon ve mikroskopi ile ilgili gözlemler yapıldı. Küresel yapının farklı alanlarında ki hipoksiyi ölçmek için hipoksik aktiviteyi belirlemek için karboksik anhidraz IX boyama kullanılmıştır(Şekil 1A-C). Küresel merkezde daha fazla CAIX-pozitif hücre gözlendi (Şekil 1A-C). Küre...

Tartışmalar

Tümör spheroid tahlilleri, proliferasyon, invazyon ve göçün yanı sıra hücre ölümü ve ilaç yanıtı gibi tümör özelliklerini incelemek için iyi adapte edilmiştir. Kanser hücreleri, Şekil 4B,C'degörüldüğü gibi invaziv bir mikrotümör oluşturan 3D matrisi istila eder. İnvaziv süreç sırasında, matriks metalloproteinazlar (MMP) tümör hücrelerini çevreleyen matrisleri sindirir¹³, ve MMP inhibitörleri (örneğin, GM6001 ve...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well round-bottom plate	Falcon	08-772-212
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
DPBS 10X	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm2	Falcon	10497302
Matrigel	Corning	354230	Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Neurobasal medium	Gibco	21103049	Stored at 4 °C
Penicillin - Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used to cell counting
Type I Collagen	Corning	354236	Stored at 4 °C