3D сфероидная модель для глиобластомы

Резюме

Здесь мы описываем простой в использовании нашествие, чтобы провести гиобластому. Этот ассси подходит для глиобластомы стволовых клеток. Также описывается макрос Фиджи для легкой количественной оценки вторжения, миграции и распространения.

Аннотация

Двухмерные (2D) клеточные культуры не имитируют рост опухоли vivo удовлетворительно. Поэтому были разработаны трехмерные (3D) культуры сфероидных моделей. Эти модели могут быть особенно важны в области нейроонкологии. Действительно, опухоли головного мозга имеют тенденцию вторгаться в здоровую среду мозга. Мы описываем здесь идеальный 3D сфероид на основе глиобластомы, который мы разработали для изучения вторжения опухоли. Мы предоставляем все технические детали и аналитические инструменты для успешного выполнения этого ажиотажа.

Введение

В большинстве исследований с использованием первичных или коммерчески доступных клеточных линий, анализы выполняются на клетках, выращенных на пластиковых поверхностях в качестве монослойных культур. Управление культурой клеток в 2D представляет недостатки, так как она не имитирует среду in vivo 3D-клеток. В 2D-культурах вся поверхность клеток находится непосредственно в контакте со средой, изменяя рост клеток и изменяя доступность лекарств. Кроме того, нефизиологическая пластиковая поверхность вызывает дифференциацию клеток^1. Для преодоления этих трудностей были разработаны трехмерные модели культуры. Они имеют то преимущество, имитируя многоклеточной архитектуры и неоднородности опухолей², и, таким образом, можно считать более актуальной моделью для твердых опухолей³. Сложная морфология сфероидов способствует лучшей оценке лекарственного пенетранса и резистентности^4. Неоднородность опухоли в сфероиде влияет на диффузию кислорода и питательных веществ, а также на реакцию на фармакологические агенты(рисунок 1A). Диффузия кислорода изменяется, когда размер сфероида достигает 300 мкм, вызывая гипоксическую среду в центре сфероида(рисунок 1A,C). Метаболиты также менее проникают через клеточные слои и компенсирующие метаболические реакции происходят^5. Когда диаметр сфероида увеличивается, некротические ядра могут наблюдаться, дальнейшее имитации характеристики, найденные во многих твердых раковых заболеваний, в том числе агрессивной глиобластомы рака мозга (GBM)⁶.

Несколько 2D или 3D-анализов на глиобластому были зарегистрированы в литературе^7,,8. Двухмерные анализы в основном для изучения вторжения в горизонтальной плоскости на тонком матричном слое или в камере Бойдена анализ⁹. Трехмерные анализы были описаны с 3D сфероидных культур с использованием классических линий клеток глиобластомы¹⁰. Более сложные варианты представлены вторжением органов мозга опухолевыми сфероидами в конфронтационных культурах¹¹. Тем не менее, по-прежнему важно разработать простой в использовании и воспроизводимый результат, доступный для любой лаборатории. Мы разработали протокол для генерации стволовых клеток, похожих на глиобластому, из образцов пациентов. Количественная оценка этих анализов легко управляемыи и требует только открытого доступа в Интернете программного обеспечения. Короче говоря, опухолевые кусочки разрезаются на мелкие кусочки и ферментативно усваиваются. Одиночные клетки выведенные от пищеварения культивируются в нейробазальной среде. Через 4-7 дней сфероидные структуры образуются спонтанно. При внутричерепной имплантации у моделей мышей, они образуют опухоли, демонстрирующие некротический ядро, окруженное псевдо-палисадингклетками^12. Это очень напоминает характеристики, найденные у пациентов с ГБМ.

В этой статье мы описываем наш протокол для производства сфероидов из определенного количества клеток для обеспечения воспроизводимости. Для этой цели можно использовать две дополнительные матрицы: Matrigel и коллаген i тип. Matrigel обогащается факторами роста и имитирует базальную мембрану млекопитающих, необходимую для клеточной привязанности и миграции. С другой стороны, коллаген типа I, структурный элемент стромы, является наиболее распространенной фибриллярной внеклеточной матрицы и используется в анализы клеточного вторжения. В этом мы иллюстрируем нашу модель сфероидов GBM, выполняя анализы миграции и распространения. Анализ проводился не только в фиксированные временные моменты, но и путем мониторинга расширения сфероидов и движения клеток с помощью живой визуализации. Кроме того, была сделана электронная микроскопия для визуализации морфологических деталей.

протокол

Информированное письменное согласие было получено от всех пациентов (из больницы Haukeland, Берген, Норвегия в соответствии с местными правилами комитета по этике). Наш протокол соответствует руководящим принципам комитета по этике человеческих исследований нашего учреждения.

1. Поколение однородных размеров опухолевых сфероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Стволовые клетки культивируются в нейробазальной среде дополняется B27 дополнения, гепарин, FGF-2, пенициллин, и стрептомицин, как описано в предыдущих статьях¹². Эти клетки спонтанно образуют сфероиды в культуре.

1. Вымойте опухолевые клетки с 5 мл фосфат-буферного соления (PBS) и инкубировать клетки с 0,5-1 мл диссоциации фермента (см. Таблица материалов) в течение 5 минут при 37 градусов по Цельсию.
2. Вымойте 4-4,5 мл PBS и добавьте 10 мл полной среды роста (полная нейробазальная среда, cNBM).
3. Подсчитайте ячейки, используя автоматическую технику подсчета с помощью трипан-синего и слайда камеры подсчета клеток.
4. Для генерации 100 сфероидов с 10⁴ ячейками на сфероид (в соответствии с предпочтительным размером) смешайте 10⁶ ячеек в 8 мл НБМ с 2 мл 2% метилцеллюлозы.
5. Перенесите подвеску в стерильный системный контейнер и разлейте 100 л/хорошо с многоканальной пипеткой в круглую нижнюю пластину 96.
6. Инкубировать тарелку при 37 градусах Цельсия, 5% CO₂ и 95% влажности. Равные размеры сфероидов сформируются и могут быть использованы через 3-4 дня.

2. Трехмерные эксперименты

1. Распространения
   1. Подготовка
      1. Приостановить ингибиторы (например, ротенон, как на рисунке 4А) и химических веществ в 100 л средней и добавить в 100 л среды в каждой скважине (т.е., один сфероид на скважину).
      2. Инкубировать тарелку при 37 градусах Цельсия, 5% CO₂и 95% влажности.
   2. Приобретение и анализ изображений
      1. Сфотографируйте с видео микроскопом в Brightfield для создания ряда условий на T₀ и в последующие времена ожидается.
      2. Используйте Фиджи для анализа фотографий вручную или в полуавтоматической манере. Чтобы сделать это вручную, нарисуйте круг вокруг сфероидного ядра с помощью инструмента выбора от руки и измерьте область каждого сфероида. Для анализа изображений полуавтоматизированным способом используйте макрос, показанный в дополнительном документе 1 с //Core Area только.
2. Вторжения
   1. Подготовка
      1. Подготовка коллагеновой матрицы в трубке на льду с типом I коллагена на 1 мг /мл конечной концентрации, 1x PBS, 0.023xV_{коллагена}, 1 M гидроксид натрия, и стерильные H₂O. Инкубировать раствор на льду в течение 30 мин.
      2. Соберите сфероиды из круглой нижней скважины в 500 трубках и промойте 2x с 200 Л л 1x PBS.
      3. Пипетка сфероидов тщательно в 100 л коллагеновой матрицы и вставить в центр ею в нормальных 96 скважинных пластин.
      4. Инкубировать коллагеновый гель в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия, а затем добавить cNBM поверх геля. На этом этапе к среде могут быть добавлены ингибиторы или активаторы (например, хлорид водорода, как показано на рисунке 4B, 4C).
   2. Приобретение и анализ изображений
      1. Сфотографируйте последовательно с видеомикроскопом в режиме brightfield 24 h после включения коллагена.
      2. Используйте Фиджи для анализа фотографий вручную или в полуавтоматической манере. Чтобы сделать это вручную, нарисуйте вокруг ядра и общей площади сфероида с помощью инструмента выбора от руки и измерьте инвазивную область каждого сфероида, вычитая общую площадь с основной областью. Для анализа изображений полуавтоматизированным способом используйте макрос, указанный в дополнительном документе 1, для определения инвазивной области.
3. Миграции
   1. Подготовка
      1. Пальто 6 хорошо пластины с Matrigel (0,2 мг/мл) в NBM в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию, затем удалить Matrigel и добавить 2 мл cNBM.
      2. Перенесите сфероиды в 50 qL cNBM от круглой нижней плиты скважины к 6 хорошо пластины.
      3. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия и ждать 30 минут для сфероидов придерживаться.
      4. После 24 ч инкубации, пятно с 10 нг /мл Hoechst и инкубировать 30 мин при 37 градусов по Цельсию.
   2. Приобретение и анализ изображений
      1. Получение изображений с помощью видео микроскопа в brightfield. Лазер 405 нм используется для визуализации окрашивания Hoechst.
      2. Используйте программное обеспечение Фиджи для анализа фотографий и запуска макроса, как указано в дополнительном документе 1.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Прикосновение к нижней части колодца или полное удаление супернатанта повреждает сфероиды. Для обработки геля типа коллагена I, держите гель на льду для того чтобы во избежание полимеризация коллагена, не добавляете кислотный компонент потому что изменение в pH повлияет на компактность геля, и клетки пипетки быстро в коллаген для того чтобы предотвратить смерть клетки и ухудшение геля.

3. Фиджи Макро

ПРИМЕЧАНИЕ: Фиджи представляет собой программу анализа изображений, разработанную в общественном достоянии, которая позволяет разрабатывать макросы для ускорения анализа изображений. Ручной анализ также возможен, но это медленный процесс и может привести к смещениям. Изображения могут быть импортированы путем перетаскивания программного обеспечения и количественно с помощью плагина ROI Manager Tools. Процедура, используемая в данном исследовании, описана ниже:

1. Откройте окно макроса: Плагины Макрос Интерактивный переводчик.
2. Копировать и вставить следующие адаптированные фиолетовый цикл. Держите фиолетовые предложения и добавить зеленые предложения интересов(Дополнительный документ 1).
3. Чтобы проанализировать всю серию, отрегулируйте параметры красным цветом для определенной количественной оценки и запустите макрос с помощью Macros Выполнить Макро или нажав Ctrl'R.
4. Проверьте и, при необходимости, вручную адаптируйте интересующие регион (ROI).

4. Электронная микроскопия сфероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство из следующих шагов должно быть сделано в химическом капюшоне.

1. Шаг фиксации
   1. Соберите сфероид с разрезанной наконечником пипетки, положите его в трубку 1,5 мл и промойте 1x с 0,1 М фосфатным буфером (PB).
   2. Исправить сфероид ночь при 4 градусах Цельсия в 2% глютаральдегида / 2% параформальдегида (PFA) в 0,1 МПБ.
   3. Замените решение фиксации раствором 1% PFA в 0,1 M PB с последующей подготовкой образца.
2. Подготовка образцов
   1. Перенесите сфероиды в ситечко и поместите их в стеклянный стакан, чтобы избежать повреждения сфероидами.
   2. Тщательно промыть 3x с 0,1 М ПБ.
   3. Инкубировать с осмием на 2 ч в темноте. Разбавить осмий до 4% в 1% 0,1 M PB буфера.
   4. Тщательно промыть 3x с 0,1 М ПБ.
      1. Обезвоживание следующим образом: замочите в 50% этанола в течение 10 мин, 70% этанола в течение 10 мин, 2x 90% этанола в течение 15 мин, 2x 100% этанола в течение 20 мин, и 2x ацетона в течение 30 мин.
   5. Инкубировать образцы в смеси 50/50 ацетона/минина на 2 ч. Во время этого шага подготовьте ресину EPON (Embed-812: 11.25 г; DDSA: 9 г; НМА: 4,5 г).
   6. Откажитесь от смеси ацетона/мини, замените свежеприготовленной мизиной и инкубируйте на ночь.
   7. Замените на мизину новой и насигните между 2-6 ч.
   8. Добавить сфероиды в мисена в форму при 60 градусах по Цельсию в течение 48-72 ч.

Результаты

Сфероиды были подготовлены, как описано в разделе протоколов, и были сделаны наблюдения в отношении миграции, вторжения, распространения и микроскопии. Для измерения гипоксии в различных областях сферической структуры, карбоксковая ангидразовая IX окрашивание был ис?...

Обсуждение

Опухолевые сфероидные анализы хорошо приспособлены для изучения характеристик опухоли, включая пролиферацию, вторжение и миграцию, а также гибель клеток и ответные меры на наркотики. Раковые клетки вторгаются в 3D-матрицу, образуя инвазивную микроопухоль, как видно на рисун...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well round-bottom plate	Falcon	08-772-212
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
DPBS 10X	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm2	Falcon	10497302
Matrigel	Corning	354230	Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Neurobasal medium	Gibco	21103049	Stored at 4 °C
Penicillin - Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used to cell counting
Type I Collagen	Corning	354236	Stored at 4 °C