Un modello spheroid 3D per Glioblastoma

Riepilogo

Qui, descriviamo un assaggio di invasione facile da usare per il glioblastoma. Questo test è adatto per cellule staminali del glioblastoma. Viene descritta anche una macro Fiji per una facile quantificazione dell'invasione, della migrazione e della proliferazione.

Abstract

Le colture cellulari bidimensionali (2D) non imitano la crescita del tumore in vivo in modo soddisfacente. Pertanto, sono stati sviluppati modelli di sferoidcoltura tridimensionale (3D). Questi modelli possono essere particolarmente importanti nel campo della neuro-oncologia. Infatti, i tumori cerebrali hanno la tendenza a invadere l'ambiente cerebrale sano. Descriviamo qui in un saggio ideale basato sul glioblastoma sferoide 3D che abbiamo sviluppato per studiare l'invasione tumorale. Forniamo tutti i dettagli tecnici e gli strumenti analitici per eseguire con successo questo saggio.

Introduzione

Nella maggior parte degli studi che utilizzano linee cellulari primarie o disponibili in commercio, i saggi vengono eseguiti su cellule coltivate su superfici plastiche come colture monostratori. La gestione della coltura cellulare in 2D rappresenta uno svantaggio, in quanto non imita un ambiente cellulare 3D in vivo. Nelle colture 2D, l'intera superficie cellulare è direttamente in contatto con il mezzo, alterando la crescita cellulare e modificando la disponibilità di farmaci. Inoltre, la superficie plastica non fisiologica innesca la differenziazione cellulare¹. Sono stati sviluppati modelli di coltura tridimensionali per superare queste difficoltà. Hanno il vantaggio di imitare l'architettura multicellulare e l'eterogeneità dei tumori², e quindi potrebbe essere considerato un modello più rilevante per i tumori solidi³. La complessa morfologia degli sferoidi contribuisce a valutare meglio la penetrazione e la resistenza dei farmaci⁴. L'eterogeneità tumorale nello sferoide influisce sulla diffusione di ossigeno e sostanze nutritive e la risposta agli agenti farmacologici (Figura 1A). La diffusione dell'ossigeno viene alterata quando la dimensione dello sferoide raggiunge i 300 m, inducendo un ambiente ipossico al centro dello sferoide (Figura 1A,C). I metaboliti sono anche meno penetranti attraverso gli strati cellulari e compensando le reazioni metaboliche avvengono⁵. Quando il diametro dello sferoide aumenta, i nuclei necrotici possono essere osservati, imitando ulteriormente le caratteristiche che si trovano in molti tipi di cancro solido, tra cui il cancro al cervello aggressivo glioblastoma (GBM)⁶.

Diversi saggi di invasione 2D o 3D per il glioblastoma sono stati riportati nella letteratura^7,8. I saggi bidimensionali sono principalmente per studiare l'invasione in un piano orizzontale su uno strato sottile di matrice o in un assaggio della camera di Boyden⁹. I saggi tridimensionali sono stati descritti con colture di sferoidi 3D utilizzando classiche linee cellulari glioblastoma¹⁰. Varianti più complesse sono rappresentate dall'invasione degli organoidi cerebrali da parte di sferoidi tumorali nelle colture di confronto¹¹. Tuttavia, è ancora importante sviluppare un saggio facile da usare e riproducibile a disposizione di qualsiasi laboratorio. Abbiamo sviluppato un protocollo per generare cellule staminali del glioblastoma da campioni di pazienti. La quantificazione di questi saggi è facilmente gestibile e richiede solo software online ad accesso aperto. In breve, i pezzi tumorali vengono tagliati in piccoli pezzi e eviticamente digeriti. Le cellule singole derivate dalla digestione sono coltivate nel mezzo neurobasale. Dopo 4-7 giorni, le strutture sferoidi si formano spontaneamente. Al momento dell'impianto intracranico nei modelli di topi, formano tumori che presentano un nucleo necrotico circondato da cellule pseudo-palizzate¹². Questo è molto simile alle caratteristiche che si trovano nei pazienti GBM.

In questo articolo, descriviamo il nostro protocollo per produrre sferoidi da un determinato numero di cellule per garantire la riproducibilità. A questo scopo possono essere utilizzate due matrici complementari: Matrigel e collagene di tipo I. Matrigel è arricchito in fattori di crescita e imita la membrana basale dei mammiferi necessaria per l'attaccamento cellulare e la migrazione. D'altra parte, il collagene I, un elemento strutturale dello stroma, è la matrice extracellulare fibrillare più comune ed è usato nei saggi di invasione cellulare. Qui illustriamo il nostro modello di sferoide GBM eseguendo analisi su migrazione e proliferazione. L'analisi è stata effettuata non solo in momenti fissi, ma anche monitorando l'espansione degli sferoidi e il movimento cellulare mediante imaging dal vivo. Inoltre, la microscopia elettronica è stata fatta per visualizzare i dettagli morfologici.

Protocollo

Il consenso scritto informato è stato ottenuto da tutti i pazienti (dall'Ospedale Haukeland, Bergen, Norvegia secondo i regolamenti del comitato etico locale). Il nostro protocollo segue le linee guida del comitato etico della ricerca umana della nostra istituzione.

1. Generazione di sferoidi tumorali di dimensioni uniformi

NOTA: Le cellule staminali sono coltivate in mezzi neurobasali completati con supplemento B27, eparina, FGF-2, penicillina e streptomicina, come descritto negli articoli precedenti¹². Queste cellule formano spontaneamente sferoidi in coltura.

1. Lavare le cellule tumorali con 5 mL di salina tampone fosfato (PBS) e incubare le cellule con enzima di dissociazione di 0,5-1 mL (vedi Tabella dei materiali)per 5 minuti a 37 .
2. Lavare con 4-4,5 mL di PBS e aggiungere 10 mL del mezzo di crescita completo (mezzo neurobasale completo, cNBM).
3. Contare le celle utilizzando una tecnica di conteggio automatico con trypan blu e una diapositiva camera di conteggio cellulare.
4. Per generare 100 sferoidi con 10⁴ cellule per sferoide (secondo le dimensioni preferite), mescolare 10⁶ cellule in 8 mL di NBM con 2 mL di 2% metilcellulosa.
5. Trasferire le sospensioni in un contenitore di sistema sterile e erogare 100 .l/well con una pipetta multicanale in una piastra inferiore ben rotonda 96.
6. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi, il 5% di CO₂ e il 95% di umidità. Sferoidi di dimensioni uguali si formeranno e possono essere utilizzati dopo 3-4 giorni.

2. Esperimenti tridimensionali

1. Proliferazione
   1. Preparazione
      1. Sospendere gli inibitori (ad es. rotenone come nella Figura 4A)e le sostanze chimiche in 100 , l'una di mezzo e aggiungere a 100 , l'una di mezzo in ogni pozzo (ad es. uno sferoide per bene).
      2. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi, il 5% di CO₂e il 95% di umidità.
   2. Acquisizione e analisi delle immagini
      1. Scatta foto con un microscopio video in brightfield per creare una serie di condizioni a T₀ e nei seguenti momenti previsti.
      2. Utilizzare Fiji per analizzare le immagini manualmente o in modo semiautomatico. Per farlo manualmente, disegna un cerchio intorno al nucleo dello sferoide con lo strumento di selezione a mano libera e misura l'area di ogni sferoide. Per analizzare le immagini in modo semiautomatico, utilizzare la macro mostrata nel documento supplementare 1 solo con //Core Area.
2. Invasione
   1. Preparazione
      1. Preparare la matrice di collagene in un tubo sul ghiaccio con collagene di tipo I a 1 concentrazione finale mg/mL, 1x PBS,_collagene0.023xV , 1 M di idrossido di sodio e sterile H₂O. Incubare la soluzione sul ghiaccio per 30 min.
      2. Raccogliere gli sferoidi dal pozzo del fondo rotondo in tubi da 500 l e lavarle 2 volte con 200 l1 PBS.
      3. Pipetta gli sferoidi con attenzione in 100 l della matrice di collagene e inserire al centro di un pozzo in normali 96 pozze di pozzo.
      4. Incubare il gel di collagene per 30 min a 37 gradi centigradi e quindi aggiungere cNBM sopra il gel. Inibitori o attivatori (ad esempio, cloruro di idrogeno come mostrato nella Figura 4B, 4C) possono essere aggiunti al mezzo in questa fase.
   2. Acquisizione e analisi delle immagini
      1. Scattare foto in sequenza con un microscopio video in modalità brightfield 24 h dopo l'inclusione del collagene.
      2. Utilizzare Fiji per analizzare le immagini manualmente o in modo semiautomatico. Per farlo manualmente, disegnare intorno al nucleo e all'area totale dello sferoide con lo strumento di selezione a mano libera e misurare l'area invasiva di ogni sferoide sottraendo l'area totale con l'area del nucleo. Per analizzare le immagini in modo semiautomatico, utilizzare la macro come indicato nel documento supplementare 1 per determinare l'area invasiva.
3. Migrazione
   1. Preparazione
      1. Rivestire una piastra 6 po' con Matrigel (0,2 mg/mL) in NBM per 30 min a 37 gradi centigradi, quindi rimuovere il Matrigel e aggiungere 2 mL di cNBM.
      2. Trasferire gli sferoidi in 50 o L di cNBM dalla piastra del fondo rotondo alla piastra 6 del pozzo.
      3. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi e attendere 30 min per gli sferoidi di aderire.
      4. Dopo 24 h di incubazione, macchia con 10 ng/mL di Hoechst e incuba 30 min a 37 gradi centigradi.
   2. Acquisizione e analisi delle immagini
      1. Ottenere immagini utilizzando un microscopio video in brightfield. Un laser da 405 nm viene utilizzato per la visualizzazione della colorazione Hoechst.
      2. Utilizzare il software Fiji per analizzare le immagini ed eseguire la macro come indicato nel documento supplementare 1.
         NOTA: Toccare il fondo del pozzo o rimuovere completamente il supernatante danneggia gli sferoidi. Per la movimentazione del gel di tipo collagene, tenere il gel sul ghiaccio per evitare la polimerizzazione del collagene, non aggiungere un componente acido perché il cambiamento di pH influenzerà rapidamente la compattezza del gel e le cellule pipette nel collagene per prevenire la morte cellulare e la degradazione del gel.

3. Macro Fiji

NOTA: Fiji è un programma di analisi delle immagini sviluppato nel pubblico dominio che permette lo sviluppo di macro per accelerare l'analisi delle immagini. Anche l'analisi manuale è possibile, ma questo è un processo lento e può introdurre distorsioni. Le immagini possono essere importate mediante trascinamento della selezione nel software e quantificate con il plugin ROI Manager Tools. La procedura utilizzata in questo studio è descritta di seguito:

1. Aprire la finestra della macro: Plugins Macros Interprete interattivo.
2. Copiare e incollare il seguente loop viola adattato. Mantenere le frasi viola e aggiungere le frasi verdi di interesse (Documento supplementare 1).
3. Per analizzare l'intera serie, regolare i parametri in rosso per una quantificazione specifica ed eseguire la macro utilizzando Macro. Eseguire la macro o premendo Ctrl .
4. Controllare e, se necessario, adattare manualmente la regione di interesse (ROI).

4. Microscopia elettronica degli sferoidi

NOTA: la maggior parte dei seguenti passaggi deve essere eseguita in una cappa chimica.

1. Fase di fissaggio
   1. Raccogliere lo sferoide con una punta di tubodicatura tagliata, metterlo in un tubo da 1,5 mL e lavare 1x con buffer di fosfato da 0,1 M (PB).
   2. Fissare lo sferoide durante la notte a 4 gradi centigradi nel 2% di glutaraldeide/2% di paraformaldeide (PFA) in 0,1 M PB.
   3. Sostituire la soluzione di fissaggio con una soluzione di 1% PFA in 0,1 M PB seguita dalla preparazione del campione.
2. Preparazione del campione
   1. Trasferire gli sferoidi in un colino e metterli in un bicchiere di vetro per evitare danni sferoidi.
   2. Lavare con cura 3x con 0,1 M PB.
   3. Incubare con osmio per 2 h al buio. Diluire l'osmio al 4% nel buffer PB 1%0,1 M.
   4. Lavare con cura 3x con 0,1 M PB.
      1. Diidratati come segue: immergere in 50% etanolo per 10 min, 70% etanolo per 10 min, 2x 90% etanolo per 15 min, 2x 100% etanolo per 20 min, e 2x acetone per 30 min.
   5. Incubare i campioni in una miscela 50/50 di acetone/resina per 2 h. Durante questo passaggio, preparare la resina EPON (Embed-812: 11.25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).
   6. Scartare la miscela di acetone/resina, sostituire con resina appena preparata e incubare durante la notte.
   7. Sostituire la resina con una nuova e incubare tra 2-6 h.
   8. Aggiungere gli sferoidi in resina in uno stampo a 60 gradi centigradi per 48-72 h.

Risultati

Gli sferoidi sono stati preparati come descritto nella sezione protocolli e sono state fatte osservazioni riguardanti la migrazione, l'invasione, la proliferazione e la microscopia. Per misurare l'ipossia in aree distinte della struttura sferica, l'colorazione iX di anidera carboxica è stata utilizzata per determinare l'attività ipossica (Figura 1A-C). Sono state osservate più cellule CAIX-positive nel centro sferoide (

Discussione

I saggi dello sferoide tumorale sono ben adattati per studiare le caratteristiche tumorali tra cui la proliferazione, l'invasione e la migrazione, così come la morte cellulare e la risposta ai farmaci. Le cellule tumorali invadono la matrice 3D formando un microtumore invasivo, come si vede nella Figura 4B,C. Durante il processo invasivo, matrici digeriste digeriscono matrici digerite a matrice (MMP) che circondano le cellule tumorali¹³e gli inibitor...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well round-bottom plate	Falcon	08-772-212
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
DPBS 10X	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm2	Falcon	10497302
Matrigel	Corning	354230	Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Neurobasal medium	Gibco	21103049	Stored at 4 °C
Penicillin - Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used to cell counting
Type I Collagen	Corning	354236	Stored at 4 °C