Ein 3D Spheroid Modell für Glioblastom

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir einen einfach zu bedienenden Invasionstest für Glioblastom. Dieser Test eignet sich für glioblastom-Stammzellen. Ein Fidschi-Makro zur einfachen Quantifizierung von Invasion, Migration und Proliferation wird ebenfalls beschrieben.

Zusammenfassung

Zweidimensionale (2D) Zellkulturen imitieren das In-vivo-Tumorwachstum nicht zufriedenstellend. Daher wurden dreidimensionale (3D) Kultursphäroidmodelle entwickelt. Diese Modelle können im Bereich der Neuroonkologie besonders wichtig sein. Tatsächlich haben Hirntumoren die Tendenz, in die gesunde Gehirnumgebung einzudringen. Wir beschreiben hierin einen idealen 3D-Glioblastom-Sphäroid-basierten Assay, den wir entwickelt haben, um Tumorinvasionen zu untersuchen. Wir stellen ihnen alle technischen Details und Analysewerkzeuge zur Verfügung, um diesen Test erfolgreich durchzuführen.

Einleitung

In den meisten Studien mit primären oder kommerziell erhältlichen Zelllinien werden Assays an Zellen durchgeführt, die auf Kunststoffoberflächen als Monolayer-Kulturen angebaut werden. Das Verwalten der Zellkultur in 2D stellt Nachteile dar, da sie keine in vivo 3D-Zellenumgebung imitiert. In 2D-Kulturen ist die gesamte Zelloberfläche direkt mit dem Medium in Kontakt, verändert das Zellwachstum und verändert die Verfügbarkeit von Medikamenten. Darüber hinaus löst die nichtphysiologische Kunststoffoberfläche die Zelldifferenzierung¹aus. Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, wurden dreidimensionale Kulturmodelle entwickelt. Sie haben den Vorteil, die multizelluläre Architektur und Heterogenität von Tumoren²nachzuahmen, und könnten daher als relevanteres Modell für solide Tumoren betrachtet werden³. Die komplexe Morphologie von Sphäroiden trägt zur besseren Beurteilung von Medikamentendurchschlagskraft und Resistenz^{bei 4}. Die Tumorheterogenität im Sphäroid wirkt sich auf die Diffusion von Sauerstoff und Nährstoffen und die Reaktion auf pharmakologische Wirkstoffe aus (Abbildung 1A). Die Diffusion von Sauerstoff wird verändert, wenn die Sphäroidgröße 300 m erreicht, was eine hypoxische Umgebung in der Mitte des Sphäroids induzieren diniert (Abbildung 1A,C). Metaboliten sind auch weniger durch die Zellschichten eindringen und kompensierenmetabolische Reaktionen stattfinden⁵. Wenn der Durchmesser des Sphäroids zunimmt, können nekrotische Kerne beobachtet werden, die weitere Imitieren von Eigenschaften bei vielen festen Krebsarten, einschließlich des aggressiven Hirntumorglioblastoms (GBM)⁶.

Mehrere 2D- oder 3D-Invasions-Assays für Glioblastom wurden in der Literatur^7,8berichtet. Zweidimensionale Assays sind hauptsächlich für die Untersuchung der Invasion in einer horizontalen Ebene auf einer dünnen Matrixschicht oder in einem Boyden-Kammer-Assay⁹. Dreidimensionale Assays wurden mit 3D-Sphäroidkulturen mit klassischen Glioblastom-Zelllinien¹⁰beschrieben. Komplexere Varianten werden durch die Invasion von Hirnorganoiden durch Tumorsphäride in Konfrontationskulturen^{dargestellt 11}. Dennoch ist es wichtig, einen benutzerfreundlichen und reproduzierbaren Assay zu entwickeln, der jedem Labor zur Verfügung steht. Wir haben ein Protokoll entwickelt, um glioblastom-Stammzellen aus Patientenproben zu erzeugen. Die Quantifizierung dieser Assays ist leicht zu handhaben und erfordert nur Open-Access-Online-Software. Kurz gesagt, Tumorstücke werden in kleine Stücke geschnitten und enzymatisch verdaut. Einzelne Zellen, die aus der Verdauung gewonnen werden, werden in neurobasalen Medien kultiviert. Nach 4-7 Tagen bilden sich spontan Sphäroidstrukturen. Bei der intrakraniellen Implantation in Mäusemodellen bilden sie Tumore, die einen nekrotischen Kern aufweisen, der von Pseudo-Palisading-Zellen umgeben ist¹². Dies ähnelt den Merkmalen von GBM-Patienten.

In diesem Artikel beschreiben wir unser Protokoll zur Herstellung von Sphäroiden aus einer bestimmten Anzahl von Zellen, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Dazu können zwei komplementäre Matrizen verwendet werden: Matrigel und Kollagen Typ I. Matrigel ist mit Wachstumsfaktoren angereichert und imitiert die für die Zellanhaftung und Migration erforderliche Säugetierbasalmembran. Auf der anderen Seite ist Kollagen Typ I, ein strukturelles Element von Stroma, die häufigste fibrilläre extrazelluläre Matrix und wird in Zellinvasions-Assays verwendet. Hierin veranschaulichen wir unser GBM Sphäroid-Modell, indem wir Migrations- und Proliferationstests durchführen. Die Analyse erfolgte nicht nur zu festen Zeitpunkten, sondern auch durch die Überwachung der Sphäroidexpansion und Zellbewegung durch Live-Bildgebung. Darüber hinaus wurde die Elektronenmikroskopie durchgeführt, um morphologische Details zu visualisieren.

Protokoll

Von allen Patienten (vom Haukeland Hospital, Bergen, Norwegen gemäß den Vorschriften der örtlichen Ethikkommission) wurde eine schriftliche Schriftliche Zustimmung eingeholt. Unser Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung unserer Institution.

1. Erzeugung von tumorsphäroiden in einheitlicher Größe

HINWEIS: Stem-ähnliche Zellen werden in neurobasalen Medium speziert, ergänzt durch B27-Ergänzung, Heparin, FGF-2, Penicillin und Streptomycin, wie in früheren Artikeln¹²beschrieben. Diese Zellen bilden spontan Sphäroide in der Kultur.

1. Waschen Sie die Tumorzellen mit 5 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) und inkubieren Sie die Zellen mit 0,5-1 ml Dissoziationsenzym (siehe Materialtabelle) 5 Minuten bei 37 °C.
2. Mit 4-4,5 ml PBS waschen und 10 ml des gesamten Wachstumsmediums (komplettes neurobasales Medium, cNBM) hinzufügen.
3. Zählen Sie die Zellen mit einer automatischen Zähltechnik mit Trypanblau und einer Zellzählkammerrutsche.
4. Um 100 Sphäroide mit 10⁴ Zellen pro Sphäroid (je nach bevorzugter Größe) zu erzeugen, mischen Sie 10⁶ Zellen in 8 ml NBM mit 2 ml 2% Methylcellulose.
5. Übertragen Sie die Suspension in einen sterilen Systembehälter und geben Sie 100 l/well mit einer Mehrkanalpipette in eine gut runde Bodenplatte 96.
6. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C, 5%_CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit. Gleich große Sphäroide bilden sich und können nach 3-4 Tagen verwendet werden.

2. Dreidimensionale Experimente

1. Verbreitung
   1. Vorbereitung
      1. Suspend-Inhibitoren (z. B. Roton wie in Abbildung 4A) und Chemikalien in 100 l Medium und addieren zu den 100 l Medium in jedem Brunnen (d. h. ein Sphäroid pro Brunnen).
      2. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C, 5%_CO2und 95% Luftfeuchtigkeit.
   2. Bildaufnahme und -analyse
      1. Nehmen Sie Bilder mit einem Videomikroskop im hellen Feld auf, um eine Reihe von Bedingungen bei T₀ und die folgenden erwarteten Zeiten zu erstellen.
      2. Verwenden Sie Fidschi, um Bilder entweder manuell oder halbautomatisch zu analysieren. Zeichnen Sie dazu manuell einen Kreis um den Sphäroidkern mit dem Freihandauswahlwerkzeug und messen Sie die Fläche jedes Sphäroids. Um die Bilder halbautomatisch zu analysieren, verwenden Sie das Makro, das in Ergänzendem Dokument 1 nur mit dem /Kernbereich dargestellt ist.
2. Invasion
   1. Vorbereitung
      1. Bereiten Sie die Kollagenmatrix in einer Röhre auf Eis mit Typ I Kollagen bei 1 mg/ml Endkonzentration, 1x PBS, 0,023xV_Kollagen,1 M Natriumhydroxid und steriler_H2O vor. Inkubieren Sie die Lösung 30 min auf Eis.
      2. Sphäroide von der runden Bodengutplatte in 500 L-Röhren sammeln und 2x mit 200 l 1x PBS waschen.
      3. Pipette die Sphäroide sorgfältig in 100 l der Kollagenmatrix und in der Mitte eines Brunnens in normalen 96 Brunnenplatten einfügen.
      4. Das Kollagengel 30 min bei 37 °C inkubieren und dann cNBM auf das Gel geben. Inhibitoren oder Aktivatoren (z. B. Chlorwasserstoff wie in Abbildung 4B, 4Cdargestellt) können in diesem Schritt dem Medium zugesetzt werden.
   2. Bildaufnahme und -analyse
      1. Nehmen Sie Bilder sequenziell mit einem Videomikroskop im Hellfeldmodus 24 h nach Kollagenaufnahme auf.
      2. Verwenden Sie Fidschi, um Bilder entweder manuell oder halbautomatisch zu analysieren. Zeichnen Sie dazu manuell den Kern und die Gesamtfläche des Sphäroids mit dem Freihandauswahlwerkzeug um und messen Sie die invasive Fläche jedes Sphäroids, indem Sie die Gesamtfläche mit der Kernfläche subtrahieren. Um die Bilder halbautomatisch zu analysieren, verwenden Sie das Makro, wie in Ergänzendem Dokument 1 angegeben, um den invasiven Bereich zu bestimmen.
3. Migration
   1. Vorbereitung
      1. 6 Well-Platte mit Matrigel (0,2 mg/ml) in NBM für 30 min bei 37 °C beschichten, dann das Matrigel entfernen und 2 ml cNBM hinzufügen.
      2. Sphäroide in 50 l cNBM von der runden Bodengutplatte auf die 6 Wellplatte übertragen.
      3. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C und warten Sie 30 min, bis die Sphäroide haften.
      4. Nach 24 h Inkubation mit 10 ng/ml von Hoechst färben und 30 min bei 37 °C inkubieren.
   2. Bildaufnahme und -analyse
      1. Erhalten Sie Bilder mit einem Videomikroskop im hellen Feld. Zur Visualisierung der Hoechst-Färbung wird ein 405 nm Laser verwendet.
      2. Verwenden Sie die Fidschi-Software, um Bilder zu analysieren und das Makro auszuführen, wie in Ergänzendem Dokument 1angegeben.
         HINWEIS: Das Berühren der Unterseite des Brunnens oder das vollständige Entfernen des Überstandes beschädigt die Sphäroide. Für Kollagen Typ I Gel Handhabung, halten Sie das Gel auf Eis, um Kollagen-Polymerisation zu vermeiden, fügen Sie keine saure Komponente, weil die Änderung des pH-Werts die Kompaktheit des Gels beeinflussen, und Pipettenzellen schnell in das Kollagen, um Zelltod und den Abbau des Gels zu verhindern.

3. Fidschi-Makro

HINWEIS: Fidschi ist ein Bildanalyseprogramm, das in der öffentlichkeitspolitischen Domäne entwickelt wurde und die Entwicklung von Makros ermöglicht, um die Bildanalyse zu beschleunigen. Manuelle Analysen sind ebenfalls möglich, aber dies ist ein langsamer Prozess und kann Zuverzerrungen mit sich bringen. Bilder können per Drag-and-Drop in der Software importiert und mit dem ROI Manager Tools Plugin quantifiziert werden. Das in dieser Studie verwendete Verfahren wird im Folgenden beschrieben:

1. Öffnen Sie das Makrofenster: Plugins | Makros | Interaktiver Dolmetscher.
2. Kopieren und fügen Sie die folgende angepasste violette Schleife ein. Bewahren Sie die violetten Sätze auf und fügen Sie die grünen Sätze von Interesse hinzu (ergänzendes Dokument 1).
3. Um die gesamte Serie zu analysieren, passen Sie die Parameter rot für eine bestimmte Quantifizierung an, und führen Sie das Makro mit Makros | Führen Sie Makro aus oder drücken Sie Strg+R.
4. Überprüfen und passen Sie ggf. den Interessenbereich (ROI) manuell an.

4. Elektronenmikroskopie von Sphäroiden

HINWEIS: Die meisten der folgenden Schritte müssen in einer chemischen Haube durchgeführt werden.

1. Fixierungsschritt
   1. Das Sphäroid mit einer geschnittenen Pipettenspitze sammeln, in ein 1,5 ml-Rohr geben und 1x mit 0,1 M Phosphatpuffer (PB) waschen.
   2. Fixieren Sie das Sphäroid über Nacht bei 4 °C in 2% Glutaraldehyd/2% Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M PB.
   3. Ersetzen Sie die Fixierungslösung durch eine Lösung von 1% PFA in 0,1 M PB gefolgt von der Probenvorbereitung.
2. Probenvorbereitung
   1. Übertragen Sie die Sphäroide in ein Sieb und legen Sie sie in ein Glasbecher, um Sphäroidschäden zu vermeiden.
   2. 3x mit 0,1 M PB vorsichtig waschen.
   3. Mit Osmium für 2 h im Dunkeln brüten. Osmium auf 4% in 1% 0,1 M PB Puffer verdünnen.
   4. 3x mit 0,1 M PB vorsichtig waschen.
      1. Dehydrieren Sie wie folgt: Einweichen in 50% Ethanol für 10 min, 70% Ethanol für 10 min, 2x 90% Ethanol für 15 min, 2x 100% Ethanol für 20 min und 2x Aceton für 30 min.
   5. Inkubieren Sie die Proben in einer 50/50 Mischung aus Aceton/Harz für 2 h. Bereiten Sie in diesem Schritt das EPON-Harz vor (Embed-812: 11,25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).
   6. Die Aceton/Harzmischung entsorgen, durch frisch zubereitetes Harz ersetzen und über Nacht brüten.
   7. Ersetzen Sie das Harz durch ein neues und brüten Zwischen 2-6 h.
   8. Die Sphäroide in Harz bei 60 °C für 48-72 h in eine Form geben.

Ergebnisse

Sphäroide wurden wie im Protokollabschnitt beschrieben vorbereitet und Beobachtungen in Bezug auf Migration, Invasion, Proliferation und Mikroskopie gemacht. Zur Messung der Hypoxie in verschiedenen Bereichen der sphärischen Struktur wurde zur Bestimmung der hypoxischen Aktivität die karboxische Anhydrase IX-Färbung verwendet (Abbildung 1A-C). Weitere CAIX-positive Zellen wurden im Sphäroidzentrum beobachtet (Abbildu...

Diskussion

Tumor-Sphäroid-Assays sind gut geeignet, um Tumoreigenschaften wie Proliferation, Invasion und Migration sowie Zelltod und Medikamentenreaktion zu untersuchen. Krebszellen dringen in die 3D-Matrix ein und bilden einen invasiven Mikrotumor, wie in Abbildung 4B,Czu sehen ist. Während des invasiven Prozesses können Matrix-Metalloproteinasen (MMP) Matrizen, die Tumorzellen¹³umgeben, und MMP-Inhibitoren (z. B. GM6001 oder Rebimastat) die Zellinvasion be...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well round-bottom plate	Falcon	08-772-212
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
DPBS 10X	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm2	Falcon	10497302
Matrigel	Corning	354230	Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Neurobasal medium	Gibco	21103049	Stored at 4 °C
Penicillin - Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used to cell counting
Type I Collagen	Corning	354236	Stored at 4 °C