神経膠芽腫の3次元スフェロイドモデル

要約

ここでは、神経膠芽腫に対する使いやすい侵入アッセイについて述べています。このアッセイは、神経膠芽腫幹細胞に適しています。侵略、移動、および拡散を容易に定量化するためのフィジーのマクロも説明されています。

要約

二次元(2D)細胞培養は生体内腫瘍増殖を良好に模倣しない。そこで、3次元(3D)培養スフェロイドモデルが開発された。これらのモデルは、神経腫瘍学の分野で特に重要である可能性があります。確かに、脳腫瘍は健康な脳環境に侵入する傾向があります。我々は、腫瘍の浸潤を研究するために開発した理想的な3D神経膠芽腫スフェロイドベースのアッセイをここに記載する。このアッセイを成功させるために、技術的な詳細と分析ツールをすべて提供しています。

概要

一次または市販の細胞株を用いたほとんどの研究では、単層培養物としてプラスチック表面上で増殖した細胞に対してアッセイが行われる。2Dで細胞培養を管理することは、生体内3D細胞環境を模倣しないため、欠点を表します。2D培養では、細胞表面全体が培地に直接接触し、細胞の成長を変化させ、薬物の入手可能性を改変する。さらに、非生理学的プラスチック表面は細胞分化^{をトリガする1。}これらの困難を克服するために三次元の文化モデルが開発されました。彼らは腫瘍²の多細胞アーキテクチャと異質性を模倣するという利点を有し、したがって、固形腫瘍³のより関連性の高いモデルであると考えることができる。スフェロイドの複雑な形態は、薬物浸透および耐性をより良く評価するのに寄与^する。スフェロイドにおける腫瘍不均一性は、酸素および栄養素の拡散に影響を及ぼし、薬理学的薬剤に対する応答を示す(図1A)。スフェロイドサイズが300μmに達すると酸素の拡散が変化し、スフェロイドの中心に低酸素環境を誘導する(図1A、C)。代謝産物はまた、細胞層を通して浸透が少なく、代謝反応を補償する⁵が起こる。スフェロイドの直径が大きくなると、壊死コアが観察され、積極的な脳癌神経膠芽腫(GBM)6を含む多くの固形癌に見られる更なる模倣⁶特性が観察される。

神経膠芽腫に関するいくつかの2Dまたは3Dの浸潤アッセイが文献^77,88で報告されている。二次元アッセイは、主に薄いマトリックス層の水平面またはボイデンチャンバーアッセイ⁹での侵略を研究するためのものである。三次元アッセイは、古典的な神経膠芽腫細胞株¹⁰を用いた3Dスフェロイド培養液で記載されている。より複雑な変異体は、対立培養¹¹における腫瘍スフェロイドによる脳オルガノイドの侵入によって表される。しかし、どんな研究室でも使いやすく再現可能なアッセイを開発することは、依然として重要です。我々は、患者のサンプルから神経膠芽腫幹細胞を生成するプロトコルを開発した。これらのアッセイの定量化は容易に管理可能であり、オープンアクセスオンラインソフトウェアだけを必要とする。簡単に言えば、腫瘍片を小さく切り、酵素的に消化する。消化から誘導される単一細胞は、神経基底培地で培養される。4〜7日後、スフェロイド構造は自発的に形成される。マウスモデルで頭蓋内移植を行う際に、擬似接触形成細胞¹²に囲まれた壊死コアを示す腫瘍を形成する。これは、GBM患者に見られる特性によく似ています。

この記事では、再現性を確保するために、特定の数のセルからスフェロイドを生成するプロトコルについて説明します。この目的には、マトリゲルとコラーゲンタイプI.Matrigelが増殖因子に富み、細胞の取り付けと移動に必要な哺乳類の基底膜を模倣する2つの相補行列を使用できます。一方、間質の構造要素であるコラーゲンタイプIは、最も一般的な線維体細胞外マトリックスであり、細胞浸潤アッセイに使用されています。本明細書において、我々は、移行および増殖アッセイを行うことにより、我々のGBMスフェロイドモデルを説明する。解析は、固定された時点だけでなく、ライブイメージングによるスフェロイド膨張と細胞の動きを監視することによっても行った。さらに、電子顕微鏡検査を行い、形態学的詳細を可視化した。

プロトコル

インフォームド・コンセントは、すべての患者(地元の倫理委員会の規則に従ってノルウェーのベルゲンのハウケランド病院から)から得られました。当社の議定書は、当社の機関の人間研究倫理委員会のガイドラインに従っています。

1. 均一なサイズの腫瘍スフェロイドの生成

注:ステム様細胞は、前の記事¹²に記載されているように、B27サプリメント、ヘパリン、FGF-2、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補完する神経基底培地で培養される。これらの細胞は、培養中に自発的にスフェロイドを形成する。

1. 5 mL リン酸緩衝塩基食 (PBS) で腫瘍細胞を洗浄し、37 °C で 5 分間 0.5-1 mL 解離酵素 (材料表を参照) で細胞をインキュベートします。
2. 4-4.5 mL PBSで洗浄し、完全な成長培地(完全な神経基底培地、cNBM)の10 mLを追加します。
3. トリパンブルーとセルカウントチャンバースライドを使用して自動カウント技術を使用してセルをカウントします。
4. ¹⁰⁴個のセルを含む100個のスフェロイドを生成するには(好ましいサイズに従って)、2%メチルセルロースの2mLでNBMの8 mLに¹⁰⁶細胞を混合する。
5. サスペンションを無菌システムコンテナに移し、マルチチャンネルピペットで100 μL/wellを96ウェルラウンドボトムプレートに分配します。
6. プレートを37°C、5%CO2、湿度95%でインキュベートします。₂等しいサイズの回転楕円体が形成され、3〜4日後に使用することができます。

2. 三次元実験

1. 増殖
   1. 準備
      1. 懸濁剤(例えば、図4AAのようにロテノン)および化学物質を100μLの培地に加え、各ウェル内の培地の100μL(すなわち、ウェルあたり1つのスフェロイド)に加える。
      2. プレートを37°C、5%CO2、湿度95%でインキュベートします。₂
   2. 画像の取得と解析
      1. 明視野でビデオ顕微鏡で写真を撮って、T₀で一連の条件を作成し、次の時間を予想します。
      2. 手動または半自動で画像を分析するには、フィジーを使用します。手動で行うには、フリーハンド選択ツールで回転楕円コアの周りに円を描き、各回転楕円体の面積を測定します。半自動化された方法で画像を分析するには、補足文書 1に示されているマクロを //Core 領域のみで使用します。
2. 侵略
   1. 準備
      1. 1 mg/mL最終濃度のI型コラーゲン、1x PBS、0.023xV_{コラーゲン}、1M水酸化ナトリウム、滅菌_H2O.30分間氷上で溶液をインキュベートして、氷の上のチューブにコラーゲンマトリックスを準備します。
      2. 500 μL チューブの丸底ウェルプレートからスフェロイドを回収し、200 μL 1x PBS で 2x を洗浄します。
      3. スピペットは、通常の96ウェルプレートのウェルの中央に慎重に100 μLのコラーゲンマトリックスの100 μLにスプヘロイドを挿入します。
      4. コラーゲンゲルを37°Cで30分間インキュベートし、ゲルの上にcNBMを加えます。阻害剤または活性化剤(例えば、図4B、4Cに示すような塩化水素)は、この工程で培地に添加することができる。
   2. 画像の取得と解析
      1. コラーゲンを含み込んだ後、明視野モード24時間でビデオ顕微鏡で連続して写真を撮る。
      2. 手動または半自動で画像を分析するには、フィジーを使用します。手動で行うには、フリーハンド選択ツールで回転楕円体のコアと総面積を中心に描画し、コア領域を持つ総面積を減算して各スフェロイドの侵襲領域を測定します。半自動化された方法で画像を分析するには、補足文書 1に示されているマクロを使用して、侵襲的領域を判別します。
3. 移行
   1. 準備
      1. 6ウェルプレートにマトリゲル(0.2 mg/mL)を37°Cで30分間NBMに塗り、マトリゲルを取り除き、2 mLのcNBMを加えます。
      2. スフェロイドを丸底ウェルプレートから6ウェルプレートに50 μLのcNBMに移します。
      3. プレートを37°Cでインキュベートし、スフェロイドが付着するまで30分待ちます。
      4. 24時間のインキュベーションの後、10 ng/mLのHoechstで染色し、37°Cで30分インキュベートする。
   2. 画像の取得と解析
      1. 明視野のビデオ顕微鏡を使用して画像を取得します。405 nmレーザーは、Hoechst染色の可視化に使用されます。
      2. フィジーのソフトウェアを使用して画像を分析し、補足文書 1に示すようにマクロを実行します。
         注:ウェルの底部に触れたり、上澄み物を完全に取り除いたりすると、回転楕円体に損傷を与えます。コラーゲンタイプIゲル処理の場合、コラーゲン重合を避けるためにゲルを氷上に保ち、pHの変化がゲルのコンパクトさに影響を与えるので酸性成分を添加せず、ピペット細胞をコラーゲンに急速に加えて細胞死やゲルの分解を防ぎます。

3. フィジーマクロ

注:フィジーは、画像解析を高速化するマクロの開発を可能にするパブリックドメインで開発された画像分析プログラムです。手動分析も可能ですが、これは遅いプロセスであり、バイアスを引き起こす可能性があります。イメージはソフトウェアのドラッグアンドドロップでインポートし、ROIマネージャーツールプラグインで定量化することができます。この研究で使用される手順は、以下のとおりです。

1. マクロウィンドウを開く:プラグイン |マクロ |インタラクティブインタプリタ.
2. 次の紫色のループをコピーして貼り付けます。紫色の文章を保持し、関心のある緑色の文を追加します (補足文書 1)。
3. シリーズ全体を分析するには、特定の定量化に合わせてパラメータを赤色で調整し、マクロ|マクロを実行するか、Ctrl キーを押しながら Rキーを押します。
4. 必要に応じて、対象領域 (ROI) を手動で調整します。

4. スフェロイドの電子顕微鏡

注:次の手順のほとんどは、化学フードで行う必要があります。

1. 固定ステップ
   1. 切り取ったピペットチップでスフェロイドを回収し、1.5mLチューブに入れ、0.1Mリン酸緩衝液(PB)で1倍洗います。
   2. スフェロイドを2%グルタルアルデヒド/2%パラホルムアルデヒド(PFA)で4°Cで一晩0.1M PBで固定します。
   3. 0.1 M PBの1%PFAの溶液に置換し、次にサンプル調製物を置き換えます。
2. サンプル準備
   1. ストレーナーにスフェロイドを移し、スフェロイドの損傷を避けるためにガラスビーカーに入れます。
   2. 0.1 M PBで3倍丁寧に洗います。
   3. 暗闇の中でオスミウムを2時間インキュベートする。1%0.1 M PBの緩衝液の4%にオスミウムを希釈する。
   4. 0.1 M PBで3倍丁寧に洗います。
      1. 脱水乾燥:50%エタノールを10分間、70%エタノールで10分間、2x90%エタノールで15分間、2x100%エタノール20分間、2xアセトンを30分間に浸します。
   5. アセトン/樹脂の混合物を50/50で2時間インキュベートします。このステップの間に、EPON樹脂を準備する(埋め込み-812:11.25グラム;DDSA: 9 g;NMA: 4.5 g)。
   6. アセトン/樹脂混合物を捨て、作りたての樹脂に交換し、一晩インキュベートします。
   7. 樹脂を新しいものに交換し、2~6時間の間にインキュベートします。
   8. 樹脂中のスフェロイドを60°Cの金型に48-72時間加えます。

結果

スフェロイドはプロトコルセクションに記載されているように調製し、移行、浸潤、増殖、顕微鏡観察に関する観察を行った。球状構造の異なる領域における低酸素症を測定するために、低酸素活性を決定するためにカルボキシ性無水酵素IX染色を用いた(図1A-C)。スフェロイド中心では、より多くのCAIX陽性細胞が観察された(

ディスカッション

腫瘍スフェロイドアッセイは、増殖、浸潤、および移動、ならびに細胞死および薬物応答を含む腫瘍特性を研究するのに適している。癌細胞は、図4B,Cに見られるように、侵襲的な微小腫瘍を形成する3Dマトリックスに侵入する。侵襲的プロセス中、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)は、腫瘍細胞¹³を取り囲むマトリックスを消化し、M...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well round-bottom plate	Falcon	08-772-212
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
DPBS 10X	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm2	Falcon	10497302
Matrigel	Corning	354230	Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Neurobasal medium	Gibco	21103049	Stored at 4 °C
Penicillin - Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used to cell counting
Type I Collagen	Corning	354236	Stored at 4 °C