Antijen Etiketli Blokaj Lezyonu ile Tekrarlayan Karşılaşmaların Görselleştirilmesi

Özet

DNA adduktları ile replikasyon çatalı çarpışmaları çift iplikçik kopmalarına neden olabilirken, replikomlar ve bloke edici lezyonlar arasındaki etkileşim hakkında daha az şey bilinmektedir. Bu karşılaşmaları görselleştirmek ve replisome kompozisyonunun sonuçlarını karakterize etmek için yakınlık ligasyon testini kullandık.

Özet

Nükleazlar, radyasyon ve diğer DNA kırıcılar tarafından indüklenen çift iplikçik kırılmalarına (DSB'ler) hücresel yanıt hakkında önemli bilgiler mevcuttur. Bu kısmen, kırılma yerlerinin tanımlanması için yöntemlerin kullanılabilirliğini ve bu dizilerde DSB'lere alınan faktörlerin karakterizasyonunu yansıtır. Bununla birlikte, DSB'ler, doğrudan kırılmalara neden olmayan ve belirli sekans bölgelerinde reaksiyona girmeyen bileşikler tarafından oluşturulan DNA adduktlarının işlenmesi sırasında ara ürünler olarak da görünür. Sonuç olarak, bu ajanların çoğu için, yanıt faktörleri ile bağlanma etkileşimlerinin analizine ve onarım proteinlerine izin veren teknolojiler bilinmemektedir. Örneğin, DNA interstrand çapraz bağları (ICL'ler), replikasyon çatalı karşılaşmalarını takiben kırılmalara neden olabilir. Kanser kemoterapötikleri olarak yaygın olarak kullanılan ilaçlar tarafından oluşturulmasına rağmen, replikasyon proteinleri ile etkileşimlerini izlemek için herhangi bir metodoloji bulunmamaktadır.

Burada, bu zorlu adduct'larla çatal çarpışmalarına hücresel tepkiyi takip etme stratejimizi açıklıyoruz. Bir steroid antijenini, canlı hücrelerin çekirdeklerinde fotoaktivasyona bağımlı ICL'ler oluşturan psoralen'e bağladık. ICL'ler antijen etiketine karşı immünofloresan ile görselleştirildi. Etiket ayrıca iki antijenin yakın ilişkisini bildiren Yakınlık Ligasyon Testi'nde (PLA) bir ortak olabilir. PLA, etiketlenmiş ICL'lerle yakından ilişkili olan proteinleri olmayanlardan ayırt etmek için kullanıldı. ICL'lerle karşılaştıktan sonra tutulan replisome proteinleri tanımlamak ve kaybolan diğerlerini tanımlamak mümkündü. Bu yaklaşım, immünolojik olarak tespit edilebilen herhangi bir yapı veya DNA katkısı için geçerlidir.

Giriş

Çift iplikçik kopmalarına hücresel yanıt, kopmaları spesifik genomik bölgelere yönlendirmek için giderek daha güçlü yöntemlerin art arda gelmesi nedeniyle iyi belgelenmiştir ^1,2,3. Konumun kesinliği, bölgede biriken ve DNA Hasar Yanıtına (DDR) katılan proteinlerin ve diğer faktörlerin kesin karakterizasyonunu sağlar, böylece kırılmaları onaran Homolog Olmayan Son Birleştirme (NHEJ) ve Homolog Rekombinasyon (HR) yollarını yönlendirir. Tabii ki, birçok kırılma, radyasyon ve belirli dizilere saldırmayan kimyasal türler gibi ajanlar tarafından tanıtılır⁴. Bununla birlikte, bunlar için uçları etiketleme ve yerelleştirme için uygun yapılara dönüştürebilen prosedürler mevcuttur ^5,6. Kırılmalar, immünoglobulinin yeniden düzenlenmesi gibi biyolojik süreçlerle de ortaya çıkar ve son teknoloji, lokalizasyonlarına da izin verir⁷. Yanıt veren faktörler ve bu siteler arasındaki ilişki daha sonra belirlenebilir.

Kırılmalar ayrıca, doğal kırıcılar olmayan, ancak transkripsiyon ve replikasyon gibi DNA işlemlerini bozan bileşikler tarafından oluşturulan adduktların dolaylı bir sonucu olarak ortaya çıkar. Bu tıkanıklıklara hücresel yanıtın bir özelliği olarak, belki onarım sırasında veya nükleaz saldırısına karşı savunmasız bir yapıyı tetikledikleri için oluşabilirler. Tipik olarak, addukt, mola ve yanıt veren faktörlerle ilişki arasındaki fiziksel ilişki çıkarımsaldır. Örneğin, ICL'ler sisplatin ve Mitomisin C⁸ gibi kemoterapötikler tarafından ve abazik bölgeler^9'un bir reaksiyon ürünü olarak oluşturulur. ICL'ler, replikasyon çatalları^10'a güçlü bloklar olarak bilinir, böylece nükleazlar¹¹ tarafından bölünebilen çatalları durdurur. İplikçikler arasındaki kovalent bağlantı genellikle ara^12,13 olarak zorunlu kırılmalara sahip yollar tarafından rahatlatılır ve replikasyon çatalı^14'ü yeniden oluşturmak için homolog rekombinasyon gerektirir. Çoğu deneyde araştırmacı, bir replikasyon çatalının bir ICL ile çarpışmasının aşağı yönünde oluşan kırılmalara ilgi faktörlerinin tepkisini takip eder. Bununla birlikte, provokatif bir lezyonun lokalizasyonu için herhangi bir teknoloji bulunmadığından, replisome'un ve bileşen parçalarının ICL'ye yakınlığı ancak varsayılabilir.

Burada ICL'ler tarafından gösterilen, sekansa özgü olmayan kovalent katkılarla protein ilişkilerinin analizini sağlamak için bir strateji geliştirdik. Sistemimizde bunlar, binlerce yıldır cilt bozuklukları için terapötik olarak kullanılan fotoaktif bir doğal ürün olan psoralen tarafından tanıtılmaktadır¹⁵. Yaklaşımımız psoralenslerin iki önemli özelliğine dayanmaktadır. Birincisi, sisplatin veya Mitomisin C 8,16 gibi popüler bileşiklerin oluşturduğu% ^10'dan azının aksine^, adduktların% 90'ını aşabilen yüksek çapraz bağlantı oluşum sıklığıdır. İkincisi, bileşiğin çapraz bağlama kapasitesi kaybı olmadan konjugasyona erişilebilirliğidir. Trimetil psoralen'i kovalent olarak uzun zamandır kurulmuş bir immünoetiket olan Digoxigenin'e (Dig) bağladık. Bu, genomik DNA'daki psoralen adduktlarının Dig etiketinin immünoboyaması ile tespit edilmesini ve konvansiyonel immünofloresan¹⁷ ile görselleştirilmesini sağlar.

Bu reaktif, önceki çalışmamızda, DNA lifi bazlı bir tahlil¹⁶ kullanılarak ICL'lerle replikasyon çatalı karşılaşmalarının analizine uygulandı. Bu çalışmada, replikasyonun bozulmamış bir ICL'den sonra devam edebileceğini bulduk. Bu, replikasyon stresi ile aktive olan ATR kinazına bağlıydı. CMG replikatif helikazın yapısı göz önüne alındığında replikasyon yeniden başlatma beklenmiyordu. Bu, GINS kompleksinin (PSF1, 2, 3 ve SLD5'ten oluşan G) ve CDC45 (C)^18'in proteinleri tarafından kilitlenen lider iplik sentezi için şablon ipliği etrafında ofset aralıklı bir halka oluşturan MCM hetero-heksamerinden (M) oluşur. Replikasyonun, ICL distal tarafında, replisome çarpışmasının yanına kadar yeniden başlayabileceği önerisi, replisome'un yapısında bir değişiklik yapılmasını savundu. Bir ICL ile karşılaşma sırasında hangi bileşenlerin yanıt verdiği sorusunu ele almak için, burada açıklanan yaklaşımı geliştirdik. Dig etiketini, ICL'nin replisome^20'nin proteinleriyle yakın ilişkisini sorgulamak için Proximity Ligation Assays'da (PLA)^19'da bir ortak olarak kullandık.

Protokol

1. Hücre hazırlığı

1. 1. Gün
   1. 35 mm'lik cam tabanlı kültür tabaklarını hücre yapıştırıcı çözeltisi ile ön işlemden geçirin.
   2. Tedaviden bir gün önce önceden işlenmiş bulaşıklardaki plaka hücreleri. Hücre deney gününde aktif olarak bölünmeli ve% 50-70 oranında birleşmelidir.
      NOT: Bu deneyde HeLa hücreleri,% 10 fetal sığır serumu, 1x penisilin / streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco Modifiye Kartal Orta DMEM ile kullanılmıştır. Yapışkan hücre hatları için herhangi bir kısıtlama yoktur. Bununla birlikte, yapışkan olmayan hücreler slaytlar üzerine santrifüj edilmeli ve PLA tarafından analizden önce sabitlenmelidir.
2. 2. Gün
   1. Daha önce sentezlenmiş Dig-TMP'nin dondurulmuş bir alikotunu 1: 1 EtOH: H 2 O'da yeniden askıya alarak bir Digoxigenin Trimetil psoralen (Dig-TMP) stok çözeltisi hazırlayın. çözünmüş Dig-TMP'nin 100x seyreltmesinin (H₂O cinsinden) 250 nm'de OD'yi ölçerek konsantrasyonu belirleyin. Dig-TMP'nin yok olma katsayısı 25.000'dir. Her kullanımdan önce OD'yi 250 nm'de ölçerek konsantrasyonu doğrulayın ve stok konsantrasyonunu hesaplayın: Abs x 100 x 10⁶/25.000 = Konsantrasyon (μM cinsinden). Genel olarak, stok çözeltisi yaklaşık 3 mM'dir. Çözelti yaklaşık bir ay boyunca –20 ° C'de saklanabilir.
      NOT: Dig-TMP, burada açıklanan prosedürü izleyerek önceden kimyasal olarak sentezlenmelidir. Reflü 4'-klorometil-4,5',8-trimetilpsoralen, 12 saat boyunca azot altında toluen içinde 4,7,10-trioksa-1,13-tridekanidi-amin ile. Çözücüyü çıkarın ve silika jel kromatografisi ile 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5',8-trimetilpsoralen ürününü geri kazanın. Ürünü, 18 saat boyunca 50 ° C'de dimetil formamid ve trietilamin içinde digoxigenin NHS esterine konjuge edin. Çözücüyü çıkarın ve hazırlayıcı ince tabaka silika jel kromatografisi ile kalıntıyı saflaştırın. Ürün bandı kloroformunu elute edin: metanol:% 28 amonyum hidroksit (8: 1: 0.1) karışımı. Solventleri buharlaştırın ve peleti %50 EtOH:_H2O içinde çözün.
   2. Dig-TMP stoğunu% 50 EtOH: H₂O'da hücre kültürü ortamına 5 μM'lik son bir konsantrasyona kadar ekleyin. Ortamı plakalardan aspire edin, önceden ısıtılmış Dig-TMP içeren ortamı ekleyin ve Dig-TMP'nin dengelenmesini sağlamak için plakaları 30 dakika boyunca bir inkübatöre (37 ° C,% 5 CO₂) yerleştirin.
   3. Hücreler inkübe edilirken, UV kutusunu ( Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'ye önceden ısıtın.
   4. Plakaları önceden ısıtılmış UV kutusuna yerleştirin ve hücreleri bu deney için 5 dakika boyunca 3 J /^cm2 UVA ışığı dozuna maruz bırakın. Plakalar, ışınlama sırasında 37 ° C'de tutulan bir termo-bloğun üzerine yerleştirildi. Formülü kullanarak zamanı hesaplayın:
      
   5. Bir pipet kullanarak ortamı aspire edin, taze önceden ısıtılmış ortam ekleyin ve plakaları inkübatöre 37 ° C'de, 1 saat boyunca% 5 CO_2'de geri yerleştirin.
   6. Ortamı çıkarın ve bulaşıkları fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez nazikçe yıkayın.
   7. PBS'yi çıkarın ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca PBS'ye% 0.1 formaldehit (FA) ekleyin. Bu, sitoplazmik elementleri çıkarmak ve PLA arka planını azaltmak için gereken CSK-R (RNaz içeren sitoiskelet ekstraksiyon tamponu, 1.2.9'da tarif edilmiştir.) ön işlemi sırasında hücre ayrılmasını önler.
   8. FA'dan kurtulun ve bulaşıkları PBS ile bir kez yıkayın.
   9. CSK-R tamponu ekleyin ve sitoplazmayı çıkarmak için RT'de 5 dakika inkübe edin [CSK-R tamponu: 10 mM BORULAR, pH 7.0, 100 mM NaCl, 300 mM sakaroz, 3 mM MgCl₂, %0.5 Triton X-100, 300 μg/mL RNaz A]. Arabelleği aspire edin, taze CSK-R ekleyin ve RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: CSK tampon stoğu 4 °C'de saklanabilir ve kullanımdan hemen önce Triton X ve RNaseA eklenebilir.
   10. PBS ile üç kez yıkayın.
   11. RT'de 10 dakika boyunca PBS'de% 4 formaldehit içeren hücreleri sabitleyin.
   12. PBS ile hücreleri yıkayın. Bu adımı üç kez gerçekleştirin.
   13. Soğuk% 100 metanol ekleyin ve -20 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
   14. PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. Bu noktada hücreler PBS'de 4 °C'de nemli bir odada bir haftaya kadar saklanabilir.
   15. Hücreleri 80 μL 5 mM TritonX-100'de 4 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
   16. PBS'de 100 μL 5 mM EDTA içeren hücreleri, 37 ° C'de 30 dakika boyunca 1 μL 100 mg / mL RNaz A ile desteklenmiş olarak inkübe edin.
   17. PBS ile hücreleri üç kez yıkayın.
   18. Hücreleri bloke edici tamponda (PBS'de% 5 BSA ve% 10 keçi serumu) 4 ° C'de bir gece boyunca nemli bir odada saklayın.

2. Yakınlık ligasyon testi

NOT: 3. Günde yakınlık ligasyon testi yapın.

1. Antikor boyama
   1. Plaka başına 40 μL birincil antikor çözeltisi hazırlayın: İstenilen seyreltmeyi elde etmek için uygun miktarda birincil antikorları ekleyin (MCM5, CDC45, PSF1 veya pMCM2 gibi replisome bir bileşene karşı fare anti Digoxigenin ve tavşan antikoru, Malzeme Tablosunda belirtilen seyreltmeler) bloke tamponuna (24 μL'lik nihai hacme ulaşmak için). Dokunarak karıştırın ve RT'de 20 dakika bekletin. birden fazla numune için bir ana karışım hazırlayın ve kuyucuklara uygulamadan önce dokunarak karıştırın.
   2. Kuyunun merkezine 40 μL birincil antikor çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat boyunca nemli bir odada inkübe edin. Boyama sırasında, PLA problarının ve bloke edici tamponun oda sıcaklığına ısınmasına izin verin.
   3. RT'de PBS-T [PBS-T: 1X PBS'de% 0.05 Ara-20] ile hücreleri yıkayın.
   4. Yıkarken bulaşık başına 40 μL PLA probu çözeltisi hazırlayın (PLA probları, bir PLUS veya MINUS oligonükleotidine kovalent olarak bağlı tavşan veya fare IgG'sini tanıyan ikincil bir antikordan oluşur): 8 μL PLA probu anti mouse-PLUS + 8 μL PLA probu anti tavşan-EKSI antikoru + 24 μL bloke tamponu. Karıştırın ve RT'de 20 dakika bekletin. birden fazla numune için bir ana karışım hazırlayın ve kuyucuklara uygulamadan önce iyice karıştırın. Çözeltiyi plakadaki kuyunun ortasına yerleştirin.
   5. Son yıkamayı çıkarın, kuyunun ortasına 40 μL PLA prob çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat nemli bir odada inkübe edin.
   6. Tamponda yıkayın RT'de eğimli bir platformda her biri 10 dakika boyunca üç kez. Yıkama sırasında, ligasyon karışımını RT'ye getirin.
2. Ligasyon ve amplifikasyon
   1. Plaka başına 40 μL Ligasyon karışımı hazırlayın: 8 μL (5x) ligasyon stoğu + 31 μL damıtılmış su + 1 μL ligaz. Birden fazla plaka için ana karışımı hazırlayın ve kuyucuklara uygulamadan önce iyice karıştırın.
   2. Her plakaya 40 μL ligasyon çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca nemli bir odada inkübe edin.
   3. RT'de eğilebilen bir platformda hücreleri tampon A ile her biri 2 dakika boyunca 3 kat yıkayın.
   4. Çanak başına 40 μL amplifikasyon çözeltisi hazırlayın: 8 μL (5x) amplifikasyon stoğu + 31.5 μL damıtılmış su + 0.5 μL DNA Polimeraz. Birden fazla numune için bir ana karışım hazırlayın ve kuyucuklara uygulamadan önce iyice karıştırın.
   5. Her plakaya 40 μL amplifikasyon çözeltisi ekleyin ve 100 dakika boyunca 37 ° C'de nemli bir odada inkübe edin.
   6. Amplifikasyon çözeltisini aspire edin ve tampon B ile yıkayın. RT'de eğimli bir platformda her biri 10 dakika boyunca 6 yıkama yapın.
   7. RT'de 1 dakika boyunca 0.01x tampon B ile bir kez yıkayın.
   8. Tampon B'yi aspire edin ve ikincil antikorlar, Alexa Fluor 488 anti-fare IgG ve Alexa Fluor 568 anti-tavşan IgG'yi bloke edici çözelti içinde ikincil antikorlar, Alexa Fluor 488 anti-fare IgG ve Alexa Fluor 568 anti-tavşan IgG'yi bloke eden çözeltide, bloke edici tamponda, nemli bir odada, 37 ° C'de 30 dakika veya 4 ° C'de bir gecede inkübe edin.
   9. PBS-T ile hücreleri RT'de eğilebilir bir platformda her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
   10. PBS-T'yi aspire edin ve DAPI ile montaj ortamına monte edin. Monte edilen plakalar hemen görüntülenebilir veya görüntülemeden önce karanlıkta en fazla 4 gün boyunca 4 ° C'de saklanabilir.

3. Görüntüleme ve nicelleştirme

1. Bir epifloresan veya konfokal mikroskopta görüntüleme yapın (3D görüntüleme isteniyorsa, 15 yığında en az 3 μm örtün). Üçlü deneyler yapın ve numune veya koşul başına en az 100 gözlem yapmak için yeterli sayıda alanı görüntüleyin. Aynı pozlama ayarlarını kullanarak kontroller de dahil olmak üzere tüm alanları ve örnekleri görüntüleyin.
2. Uygun bir görüntü analiz yazılımı ile sayısallaştırın (bu analizi tek veya çoklu düzlem görüntülerinde gerçekleştirebilen açık kaynaklı ve ticari yazılımlar için Malzeme Tablosuna bakınız).
   1. DAPI boyamasına dayalı hücre çekirdeklerini segmentlere ayırın. Nükleer PLA noktalarının tespitini gerçekleştirin. PLA noktalarını karşılık gelen çekirdeklerine atayın. Çekirdek başına PLA noktalarını csv dosyası olarak dışa aktarın (bkz. Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2).
3. İstatistiksel analiz (önerilen açık kaynaklı ve ticari yazılımlar için Malzeme Tablosuna bakınız).
   1. Numunelerin Shapiro-Wilk testi ile normal bir dağılımı takip edip etmediğini doğrulayın.
   2. Bir Student-t testi (normal dağılım varsayımı karşılanıyorsa) veya Wilcoxon-Rank Sum testi (bir örnek için normal dağılım varsayımı ihlal edilmişse) kullanarak iki örnek arasında anlamlı bir fark olup olmadığını belirleyin.
4. Veri görselleştirme: Farklı örnekler için veri dağılımını, medyan (Q₂), 25^{. (Q} ₁) ve 75^{. yüzdelik} dilimi görselleştirmek için kutu grafikleriyle birleştirilmiş nokta grafikleri oluşturun (Önerilen açık kaynak ve ticari yazılımlar için Malzeme Tablosuna bakın).

pMCM2'nin 4.3D gösterimi: ICL etkileşimleri

1. Plan Fluor 60x/1.25 sayısal diyaframlı yağ hedefi kullanarak dönen diskli konfokal mikroskop üzerinde PLA plakalarını görüntüleyin. 1,6 mm'yi kapsayan 16 yığın elde edin ve uygun görüntü analiz yazılımıyla 3B rekonstrüksiyonu oluşturun (bkz.

Sonuçlar

Sürüngen proteinler ile Dig-TMP'nin PLA'sı
Dig-TMP'nin yapısı Şekil 1'de gösterilmiştir. Trimetil psoralenin bir glikol bağlayıcı aracılığıyla digoxigenin'e konjuge edildiği sentezin detayları daha önce^{tartışılmıştı 17,21}. Hücrelerin bileşik ile inkübasyonu ve ardından 365 nm ışığa (UVA) maruz kalmak, bileşiği fotoaktive eder ve çapraz bağlama reaksiyonunu yönlendirir. Adducts'...

Tartışmalar

PLA çok güçlü bir teknik olmasına rağmen, net ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için çözülmesi gereken teknik kaygılar vardır. Antikorlar yüksek afinite ve özgüllükte olmalıdır. Ayrıca, spesifik olmayan arka plan sinyallerini mümkün olduğunca azaltmak önemlidir. Membranların ve hücresel kalıntıların arka plana katkıda bulunduğunu bulduk ve bunları mümkün olduğunca çıkardık. Sabitlemeden önce deterjan içeren tamponlarla yapılan yıkamalar ve sabitlemeden sonra metanol ile yık...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Invitrogen	A-10011	1 in 1000
35 mm plates with glass 1.5 coverslip	MatTek	P35-1.5-14-C	Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell
Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Invitrogen	A-10001	1 in 1000
Bovine serum albumin (BSA)	SeraCare	1900-0012	Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
CDC45 antibody (rabbit)	Abcam	ab126762	1 in 200
Cell adhesive	Life Science	354240	for cell-TAK solution
Confocal microscope	Nikkon	Nikon TE2000 spinning disk microscope	equiped with Volocity software
Digoxigenin (Dig) antibody (mouse)	Abcam	ab420	1 in 200
Dig-TMP	synthesized in the Seidman Lab
Duolink Amplification reagents (5×)	Sigma-Aldrich	DUO82010	reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ detection reagents	Sigma-Aldrich	DUO92007	reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004	anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
epifluorescent microscope	Zeiss	Axiovert 200M microscope	Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)
Formaldehyde 16%	Fisher Scientific	PI28906	for fix solution
Goat serum	Thermo	31873	Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
Image analysis software	open source	Cell profiler	works for analysis of single plane images
Image analysis software-license required	Bitplane	Imaris	Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions
Ligase (1 unit/μl)	Sigma-Aldrich	DUO82029	reagents need to be stored at -20 °C
Ligation reagent (5×)	Sigma-Aldrich	DUO82009	reagents need to be stored at -20 °C
MCM2 antibody (rabbit)	Abcam	ab4461	1 in 200
MCM5 antibody (rabbit monoclonal)	Abcam	Ab75975	1 in 1000
Methanol	Lab ALLEY	A2076	pre-cold at -20°C before use
phosphoMCM2S108 antibody (rabbit)	Abcam	ab109271	1 in 200
Polymerase (10 unit/μl)	Sigma-Aldrich	DUO82030	reagents need to be stored at -20 °C
Prolong gold mounting media with DAPI	ThermoFisher Scientific	P36935
PSF1 antibody (rabbit)	Abcam	ab181112	1 in 200
RNAse A 100 mg/ml	Qiagen	19101	reagents need to be stored at 4 °C
Statistical analysis and data visualization software	open source	R studio	ggplot2 package for generation of dot plot and box plots
Statistical analysis and data visualization software-license required	Systat Software	Sigmaplot V13
TMP (trioxalen)	Sigma-Aldrich	T6137_1G
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787_250ML
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416_100ML
UV box	Southern New England Ultraviolet		Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement
UV test Chamber	Opsytec	UV TEST CHAMBER BS-04
VE-821	Selleckchem	S8007	final concentrtion is 1µM