항원 태그가 붙은 차단 병변을 사용한 반응체 만남의 시각화

요약

DNA 부가물과의 복제 포크 충돌은 이중 가닥 절단을 유발할 수 있지만 리플리솜과 차단 병변 사이의 상호 작용에 대해서는 알려진 바가 적습니다. 우리는 이러한 만남을 시각화하고 반응 구성에 대한 결과를 특성화하기 위해 근접 결찰 분석을 사용했습니다.

초록

뉴클레아제, 방사선 및 기타 DNA 차단기에 의해 유도된 이중 가닥 절단(DSB)에 대한 세포 반응에 대한 상당한 통찰력이 있습니다. 부분적으로, 이것은 휴식 부위의 식별을 위한 방법의 가용성과 해당 서열에서 DSB에 모집된 인자의 특성화를 반영합니다. 그러나 DSB는 직접 파손을 일으키지 않고 특정 서열 부위에서 반응하지 않는 화합물에 의해 형성된 DNA 부가물을 처리하는 동안 중간체로도 나타납니다. 결과적으로, 이들 제제의 대부분에 대해, 반응 인자 및 복구 단백질과의 결합 상호작용을 분석할 수 있는 기술은 알려져 있지 않다. 예를 들어, DNA 가닥 간 가교 (ICL)는 복제 포크 발생 후 중단을 유발할 수 있습니다. 암 화학 요법제로 널리 사용되는 약물에 의해 형성되었지만 복제 단백질과의 상호 작용을 모니터링하는 방법론은 없었습니다.

여기에서는 이러한 까다로운 부가물과의 포크 충돌에 대한 세포 반응을 따르기 위한 전략을 설명합니다. 우리는 스테로이드 항원을 살아있는 세포의 핵에서 광활성화 의존성 ICL을 형성하는 소랄렌에 연결했습니다. ICL은 항원 태그에 대한 면역형광으로 시각화되었습니다. 태그는 또한 두 항원의 밀접한 연관성을 보고하는 근접 결찰 분석(PLA)의 파트너가 될 수 있습니다. PLA는 태그가 부착된 ICL과 밀접하게 관련된 단백질과 그렇지 않은 단백질을 구별하기 위해 이용되었습니다. ICL과의 만남 후에 유지된 반응성 단백질을 정의하고 손실된 다른 단백질을 식별하는 것이 가능했습니다. 이 접근법은 면역학적으로 검출될 수 있는 모든 구조 또는 DNA 부가물에 적용할 수 있습니다.

서문

이중 가닥 절단에 대한 세포 반응은 특정 게놈 부위 ^1,2,3으로 절단을 지시하는 점점 더 강력한 방법의 연속으로 인해 잘 문서화되어 있습니다. 위치의 확실성은 부위에 축적되고 DNA 손상 반응(DDR)에 참여하는 단백질 및 기타 요인의 명확한 특성 분석을 가능하게 하여 파손을 복구하는 NHEJ(Non-Homologous End Conjoining) 및 HR(Homologous Recombination) 경로를 유도합니다. 물론, 방사선 및 특정 서열을 공격하지 않는 화학종과 같은 작용제에 의해 많은 단절이 발생한다⁴. 그러나, 이들을 위해, 태깅 및 현지화 ^5,6에 적합한 구조로 끝을 변환할 수 있는 절차가 있다. 면역글로불린 재배열(immunoglobulin rearrangement)과 같은 생물학적 과정에 의해서도 단절이 발생하며, 최근의 기술은 면역글로불린의 국소화를 허용하고 있다⁷. 그런 다음 응답 요인과 해당 사이트 간의 관계를 결정할 수 있습니다.

절단은 또한 고유한 차단기가 아니지만 전사 및 복제와 같은 DNA 거래를 방해하는 화합물에 의해 형성된 부가물의 간접적인 결과로 나타납니다. 그들은 아마도 수리 중에 또는 뉴클레아제 공격에 취약한 구조를 유발하기 때문에 이러한 장애물에 대한 세포 반응의 특징으로 형성될 수 있습니다. 전형적으로, 부가물, 단절 및 반응 인자와의 연관성 사이의 물리적 관계는 추론적이다. 예를 들어, ICL은 시스플라틴(cisplatin)과 미토마이신 C(Mitomycin)⁸와 같은 화학요법제(chemamotherapeutics)에 의해 형성되며, 비염기성 부위(abasic site⁾⁹의 반응 생성물로서 형성된다. ICL은 복제 포크(¹⁰)에 대한 강력한 블록으로 잘 알려져 있으며, 이에 따라 뉴클레아제⁽¹¹)에 의해 절단될 수 있는 포크를 지연시킨다. 가닥들 사이의 공유 결합은 종종 중간체(^{intermediates)12,13}로서 절제된 단절을 갖는 경로에 의해 완화되며^, 복제 포크(replication fork)를 재구축하기 위해 상동성 재조합을 필요로 한다(¹⁴). 대부분의 실험에서 조사자는 복제 포크와 ICL의 충돌 하류에서 형성되는 파손에 대한 관심 요인의 반응을 따릅니다. 그러나 도발적인 병변의 국소화에 대한 기술이 없었기 때문에 ICL에 대한 반응체 및 그 구성 요소의 근접성을 가정 할 수 있습니다.

우리는 ICL에 의해 여기에 설명된 비서열 특이적 공유 부가물과의 단백질 연관성을 분석할 수 있는 전략을 개발했습니다. 우리 시스템에서는 피부 질환 치료제로 수천 년 동안 사용 된 광활성 천연 제품인 psoralen에 의해 도입되었습니다¹⁵. 우리의 접근 방식은 psoralens의 두 가지 중요한 기능을 기반으로합니다. 첫 번째는 시스플라틴 또는 미토마이신 C ^8,16과 같은 인기 있는 화합물에 의해 형성된 10% 미만과 달리 부가물의 90%를 초과할 수 있는 높은 가교 형성 빈도입니다. 두 번째는 가교 능력의 손실 없이 접합에 대한 화합물의 접근성입니다. 우리는 트리메틸 소랄렌을 오랫동안 확립된 면역태그인 디곡시제닌(Dig)에 공유 결합시켰습니다. 이를 통해 Dig 태그의 면역염색을 통해 게놈 DNA에서 소랄렌 부가물을 검출하고 기존 면역형광법으로 시각화할 수 있습니다¹⁷.

이 시약은 이전 연구에서 DNA 섬유 기반 분석¹⁶을 사용하여 ICL과의 복제 포크 만남 분석에 적용되었습니다. 그 작업에서 우리는 복제가 온전한 ICL을 지나 계속될 수 있음을 발견했습니다. 이는 ATR 키나아제에 의존적이었고, 이는 복제 스트레스에 의해 활성화된다. 복제 다시 시작은 CMG 복제 헬리케이스의 구조를 고려할 때 예기치 않은 것입니다. 이것은 GINS 복합체(G, PSF1, 2, 3 및 SLD5로 구성됨) 및 CDC45(C)¹⁸의 단백질에 의해 고정되는 선도적 가닥 합성을 위한 주형 가닥 주위에 오프셋 갭 고리를 형성하는 MCM 헤테로헥사머(M)로 구성됩니다. 복제가 ICL의 원위 쪽에서 리플리솜 충돌의 쪽에서 다시 시작될 수 있다는 제안은 리플리솜의 구조 변경을 주장했습니다. ICL과의 만남 당시 응답에 어떤 구성 요소가 있었는지에 대한 질문을 해결하기 위해 우리는 여기에 설명된 접근 방식을 개발했습니다. 우리는 Proximity Ligation Assays(PLA)¹⁹ 의 파트너로서 Dig 태그를 활용하여 ICL과 반응²⁰의 단백질의 밀접한 연관성을 조사했습니다.

프로토콜

1. 세포 준비

1. 1일차
   1. 35mm 유리 바닥 배양 접시를 세포 접착제 용액으로 전처리합니다.
   2. 플레이트 세포는 처리 하루 전에 전처리 된 접시에 담겨 있습니다. 세포는 실험 당일에 활발하게 분열하고 50-70 % 합류해야합니다.
      참고: HeLa 세포는 10% 소 태아 혈청, 1x 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM과 함께 이 실험에 사용되었습니다. 부착 세포주에 대한 제한은 없습니다. 그러나 비부착성 세포는 PLA에 의한 분석 전에 슬라이드 상에 원심분리되고 고정되어야 합니다.
2. 2일차
   1. 이전에 합성된 Dig-TMP의 동결 분취액을 1:1 EtOH:H 2O로 재현탁하여 Digoxigenin Trimethyl psoralen(Dig-TMP)의 저장 용액을 준비합니다. 용해된 Dig-TMP의 100x 희석액(in H_2O)의 250nm에서 OD를 측정하여 농도를 결정합니다. Dig-TMP의 소멸 계수는 25,000입니다. 매번 사용하기 전에 250nm에서 OD를 측정하여 농도를 확인하고 스톡 농도를 계산합니다: Abs x 100 x 10⁶/25,000 = 농도(μM). 일반적으로, 원액은 약 3 mM이다. 이 용액은 약 한 달 동안 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다.
      알림: Dig-TMP는 여기에 설명된 절차에 따라 미리 화학적으로 합성해야 합니다. 4'-클로로메틸-4,5',8-트리메틸소랄렌과 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디-아민을 질소 하에서 톨루엔에 12시간 동안 환류시킨다. 용매를 제거하고 실리카겔 크로마토그래피로 4'-[N-(13-아미노-4,7,10-트리옥사트리데카)]아미노메틸-4,5',8-트리메틸소랄렌 생성물을 회수한다. 생성물을 디메틸포름아미드 및 트리에틸아민 중의 디곡시제닌 NHS 에스테르에 18시간 동안 50°C에서 접합한다. 용매를 제거하고 제조용 박층 실리카겔 크로마토그래피로 잔류물을 정제한다. 생성물 밴드를 클로로포름:메탄올:28% 수산화암모늄(8:1:0.1) 혼합물로 용출시킨다. 용매를 증발시키고 펠릿을 50% EtOH:H_2O에 용해시킨다.
   2. 50% EtOH:_H2O중의 Dig-TMP 스톡을 세포 배양 배지에 5 μM의 최종 농도로 첨가한다. 배지를 37°C로 가져온다. 플레이트에서 배지를 흡인하고, 예열된 Dig-TMP 함유 배지를 추가하고, 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5%_CO2)에 30분 동안 두어 Dig-TMP가 평형을 이루도록 합니다.
   3. 세포가 인큐베이션되는 동안, UV 박스( 재료 표 참조)를 37°C로 예열한다.
   4. 플레이트를 예열된 UV 상자에 넣고 이 실험을 위해 세포를 3J/^cm2 의 UVA 광선에 5분 동안 노출시킵니다. 플레이트는 조사 동안, 37°C로 유지된 열 블록의 상부에 놓였다. 공식을 사용하여 시간을 계산하십시오.
      
   5. 피펫을 사용하여 배지를 흡인하고, 예열된 신선한 배지를 첨가하고, 플레이트를 37°C, 5%_CO2 에서 1시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.
   6. 배지를 제거하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 접시를 한 번 부드럽게 씻으십시오.
   7. PBS를 제거하고 실온(RT)에서 5분 동안 PBS에 0.1% 포름알데히드(FA)를 첨가합니다. 이는 세포질 요소를 추출하고 PLA 배경을 감소시키는 데 필요한 CSK-R (RNase를 함유하는 세포골격 추출 완충액, 1.2.9.에 기술됨) 전처리 동안 세포 박리를 방지한다.
   8. FA를 흡인하고 PBS로 한 번 설거지하십시오.
   9. CSK-R 완충액을 첨가하고 RT에서 5분 동안 배양하여 세포질을 제거한다[CSK-R 완충액: 10mM PIPES, pH 7.0, 100mM NaCl, 300mM 자당, 3mM_MgCl2, 0.5%Triton X-100, 300μg/mL RNase A]. 완충액을 흡인하고 신선한 CSK-R을 첨가하고 RT에서 5분 동안 배양합니다.
      참고: CSK 버퍼의 스톡은 4°C에서 보관할 수 있으며 사용 직전에 Triton X 및 RNaseA를 추가할 수 있습니다.
   10. PBS로 세 번 씻으십시오.
   11. RT에서 10분 동안 PBS에 4% 포름알데히드로 세포를 고정합니다.
   12. PBS로 세포를 세척하십시오. 이 단계를 세 번 수행합니다.
   13. 차가운 100% 메탄올을 첨가하고 -20°C에서 20분 동안 배양한다.
   14. PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 이 시점에서 세포는 최대 일주일 동안 4°C의 습한 챔버에서 PBS에 보관할 수 있습니다.
   15. 4°C에서 10분 동안 80μL의 5mM TritonX-100으로 세포를 배양합니다.
   16. 37°C에서 30분 동안 100mg/mL RNase A 1μL가 보충된 PBS에서 5mM EDTA 100μL로 세포를 배양합니다.
   17. PBS로 세포를 세 번 세척합니다.
   18. 세포를 차단 완충액(PBS 중 5% BSA 및 10% 염소 혈청)에 4°C에서 하룻밤 동안 습한 챔버에 보관합니다.

2. 근접 결찰 분석

참고: 3일차에 근접 결찰 분석을 수행합니다.

1. 항체 염색
   1. 플레이트당 1차 항체 용액 40μL를 준비합니다: 원하는 희석(MCM5, CDC45, PSF1 또는 pMCM2와 같은 반응체 성분에 대한 마우스 항 디곡시제닌 및 토끼 항체, 재료 표에 명시된 희석액)을 블로킹 완충액(최종 부피 24μL에 도달)에 추가합니다. 두드려서 혼합하고 RT에서 20분 동안 그대로 두십시오. 여러 샘플에 대한 마스터 믹스를 준비하고 웰에 적용하기 전에 두드려서 혼합합니다.
   2. 40μL의 1차 항체 용액을 웰 중앙에 넣고 37°C에서 1시간 동안 습한 챔버에서 배양합니다. 염색하는 동안, PLA 프로브 및 블로킹 완충액이 실온으로 가온되도록 한다.
   3. RT에서 PBS-T[PBS-T: 0.05% Tween-20 in 1X PBS]로 세포를 세척한다.
   4. 세척하는 동안 접시당 40μL의 PLA 프로브 용액을 준비합니다(PLA 프로브는 토끼 또는 마우스 IgG를 인식하는 2차 항체로 구성되며 PLUS 또는 MINUS 올리고뉴클레오티드에 공유 결합됨): 8μL의 PLA 프로브 항-마우스-PLUS + 8μL의 PLA 프로브 항토끼-MINUS 항체 + 24μL의 차단 완충액. 혼합하고 RT에서 20분 동안 그대로 두십시오. 여러 샘플에 대한 마스터 믹스를 준비하고 웰에 적용하기 전에 잘 혼합합니다. 플레이트의 우물 중앙에 용액을 놓습니다.
   5. 마지막 세척을 제거하고 40μL의 PLA 프로브 용액을 웰 중앙에 추가하고 37°C에서 1시간 동안 습한 챔버에서 배양합니다.
   6. 버퍼 A에서 RT의 틸팅 플랫폼에서 각각 10분 동안 세 번 세척합니다. 세척하는 동안 결찰 혼합물을 RT로 가져옵니다.
2. 결찰 및 증폭
   1. 플레이트당 40 μL의 결찰 혼합물을 준비합니다: 8 μL(5x)의 결찰 스톡 + 31 μL의 증류수 + 1 μL의 리가아제. 여러 플레이트에 대한 마스터 믹스를 준비하고 웰에 적용하기 전에 잘 혼합하십시오.
   2. 40 μL의 결찰 용액을 각 플레이트에 첨가하고 습한 챔버에서 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
   3. RT의 틸팅 플랫폼에서 버퍼 A로 세포를 각각 2분 동안 3배 세척합니다.
   4. 접시당 증폭 용액 40μL를 준비합니다: 증폭 스톡 8μL(5x) + 증류수 31.5μL + DNA 중합효소 0.5μL. 여러 샘플에 대한 마스터 믹스를 준비하고 웰에 적용하기 전에 잘 혼합합니다.
   5. 증폭 용액 40μL를 각 플레이트에 넣고 37°C의 습한 챔버에서 100분 동안 배양합니다.
   6. 증폭 용액을 흡인하고 완충액 B로 세척합니다. RT의 틸팅 플랫폼에서 각각 6분 동안 10회 세척을 수행합니다.
   7. RT에서 0.01x 버퍼 B로 1분 동안 한 번 세척합니다.
   8. Aspirate 완충액 B와 함께 플레이트를 차단 완충액에 적절히 희석하여 차단 용액에 2차 항체인 Alexa Fluor 488 항-마우스 IgG 및 Alexa Fluor 568 항-토끼 IgG와 함께 37°C에서 30분 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   9. PBS-T로 세포를 RT의 틸팅 플랫폼에서 각각 10분 동안 세 번 세척합니다.
   10. PBS-T를 흡인하고 DAPI를 사용하여 장착 매체에 장착합니다. 장착된 플레이트는 즉시 이미징하거나 이미징 전에 4일 이상 어두운 곳에서 4°C에서 보관할 수 있습니다.

3. 이미징 및 정량화

1. 에피형광 또는 컨포칼 현미경에서 이미징을 수행합니다(3D 이미징이 필요한 경우 15개 스택에서 최소 3μm 커버). 실험을 세 번 수행하고 샘플 또는 조건당 최소 100개의 관측치를 수행할 수 있는 충분한 수의 필드를 이미지화합니다. 컨트롤을 포함한 모든 필드와 샘플을 동일한 노출 설정을 사용하여 이미지화합니다.
2. 적절한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 정량화합니다(단일 또는 다중 평면 이미지에서 이 분석을 수행할 수 있는 오픈 소스 및 상용 소프트웨어에 대한 재료 표 참조).
   1. DAPI 염색에 기초한 세포핵을 분할합니다. 핵 PLA 도트 탐지를 수행합니다. PLA 점을 해당 핵에 할당합니다. 핵당 PLA 도트 결과를 csv 파일로 내보냅니다(보충 파일 1 및 보충 파일 2 참조).
3. 통계 분석(제안된 오픈 소스 및 상용 소프트웨어에 대한 재료 표 참조).
   1. Shapiro-Wilk 검정을 사용하여 표본이 정규 분포를 따르는지 확인합니다.
   2. Student-t 검정(정규 분포 가정이 충족되는 경우) 또는 Wilcoxon-Rank Sum 검정(표본에 대한 정규 분포 가정이 위반된 경우)을 사용하여 두 표본 간에 유의한 차이가 있는지 여부를 확인합니다.
4. 데이터 시각화: 상자 그림과 결합된 점도표를 생성하여 다양한 샘플에 대한 데이터 분포, 중앙값(_Q2), 25번째(_Q1) 및 75^번째(백분위수)를 시각화합니다(제안된 오픈 소스 및 상용 소프트웨어는 재료 표 참조).

4.3D pMCM2 표시: ICL 상호 작용

1. Plan Fluor 60x/1.25 개구수 오일 대물렌즈를 사용하여 스피닝 디스크 컨포칼 현미경에서 PLA 플레이트를 이미지화합니다. 1.6mm를 덮는 16개의 스택을 획득하고 적절한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 3D 재구성을 생성합니다( 재료 표 참조).

결과

반응체 단백질을 가진 Dig-TMP의 PLA
Dig-TMP의 구조는 그림 1에 나와 있습니다. 트리메틸 소랄렌이 글리콜 링커를 통해 디곡시제닌에 접합된 합성의 세부 사항은 이전에 논의되었습니다^17,21. 화합물과 함께 세포를 배양한 후 365nm 광(UVA)에 노출시키면 화합물이 광활성화되고 가교 반응이 촉진됩니다. 부가물의 90 % 이상이...

토론

PLA는 매우 강력한 기술이지만 명확하고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 해결해야 하는 기술적 문제가 있습니다. 항체는 높은 친화력과 특이성을 가져야 합니다. 또한 비특이적 배경 신호를 최대한 줄이는 것이 중요합니다. 우리는 막과 세포 파편이 배경에 기여한다는 것을 발견했으며 가능한 한 많이 제거했습니다. 고정하기 전에 완충액을 함유한 세제로 세척하고, 고정한 후 메탄올로 세척하면 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Invitrogen	A-10011	1 in 1000
35 mm plates with glass 1.5 coverslip	MatTek	P35-1.5-14-C	Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell
Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Invitrogen	A-10001	1 in 1000
Bovine serum albumin (BSA)	SeraCare	1900-0012	Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
CDC45 antibody (rabbit)	Abcam	ab126762	1 in 200
Cell adhesive	Life Science	354240	for cell-TAK solution
Confocal microscope	Nikkon	Nikon TE2000 spinning disk microscope	equiped with Volocity software
Digoxigenin (Dig) antibody (mouse)	Abcam	ab420	1 in 200
Dig-TMP	synthesized in the Seidman Lab
Duolink Amplification reagents (5×)	Sigma-Aldrich	DUO82010	reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ detection reagents	Sigma-Aldrich	DUO92007	reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004	anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
epifluorescent microscope	Zeiss	Axiovert 200M microscope	Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)
Formaldehyde 16%	Fisher Scientific	PI28906	for fix solution
Goat serum	Thermo	31873	Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
Image analysis software	open source	Cell profiler	works for analysis of single plane images
Image analysis software-license required	Bitplane	Imaris	Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions
Ligase (1 unit/μl)	Sigma-Aldrich	DUO82029	reagents need to be stored at -20 °C
Ligation reagent (5×)	Sigma-Aldrich	DUO82009	reagents need to be stored at -20 °C
MCM2 antibody (rabbit)	Abcam	ab4461	1 in 200
MCM5 antibody (rabbit monoclonal)	Abcam	Ab75975	1 in 1000
Methanol	Lab ALLEY	A2076	pre-cold at -20°C before use
phosphoMCM2S108 antibody (rabbit)	Abcam	ab109271	1 in 200
Polymerase (10 unit/μl)	Sigma-Aldrich	DUO82030	reagents need to be stored at -20 °C
Prolong gold mounting media with DAPI	ThermoFisher Scientific	P36935
PSF1 antibody (rabbit)	Abcam	ab181112	1 in 200
RNAse A 100 mg/ml	Qiagen	19101	reagents need to be stored at 4 °C
Statistical analysis and data visualization software	open source	R studio	ggplot2 package for generation of dot plot and box plots
Statistical analysis and data visualization software-license required	Systat Software	Sigmaplot V13
TMP (trioxalen)	Sigma-Aldrich	T6137_1G
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787_250ML
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416_100ML
UV box	Southern New England Ultraviolet		Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement
UV test Chamber	Opsytec	UV TEST CHAMBER BS-04
VE-821	Selleckchem	S8007	final concentrtion is 1µM