Visualizzazione di incontri replisali con una lesione bloccante con tag antigene

Riepilogo

Mentre le collisioni della forcella di replicazione con gli addotti del DNA possono indurre rotture a doppio filamento, meno si sa sull'interazione tra replisomi e lesioni bloccanti. Abbiamo impiegato il saggio di legatura di prossimità per visualizzare questi incontri e per caratterizzare le conseguenze per la composizione delle risposte.

Abstract

Sono presenti informazioni considerevoli sulla risposta cellulare alle rotture a doppio filamento (DSB), indotte da nucleasi, radiazioni e altri rompitori di DNA. In parte, ciò riflette la disponibilità di metodi per l'identificazione dei siti di rottura e la caratterizzazione dei fattori reclutati per i DSB in tali sequenze. Tuttavia, i DSB appaiono anche come intermedi durante l'elaborazione di addotti del DNA formati da composti che non causano direttamente rotture e non reagiscono in siti di sequenza specifici. Di conseguenza, per la maggior parte di questi agenti, le tecnologie che consentono l'analisi delle interazioni di legame con i fattori di risposta e le proteine di riparazione sono sconosciute. Ad esempio, i legami incrociati tra filamenti di DNA (ICL) possono provocare rotture in seguito a incontri di fork di replicazione. Sebbene formata da farmaci ampiamente usati come chemioterapici del cancro, non esiste una metodologia per monitorare le loro interazioni con le proteine di replicazione.

Qui, descriviamo la nostra strategia per seguire la risposta cellulare alle collisioni della forcella con questi addotti impegnativi. Abbiamo collegato un antigene steroideo allo psoralene, che forma ICL dipendenti dalla fotoattivazione nei nuclei delle cellule viventi. Le ICL sono state visualizzate mediante immunofluorescenza contro il tag dell'antigene. Il tag può anche essere un partner nel Proximity Ligation Assay (PLA) che riporta la stretta associazione di due antigeni. Il PLA è stato sfruttato per distinguere le proteine che erano strettamente associate alle ICL marcate da quelle che non lo erano. È stato possibile definire le proteine replisome che sono state trattenute dopo incontri con ICL e identificare altre che sono state perse. Questo approccio è applicabile a qualsiasi struttura o addotto del DNA che può essere rilevato immunologicamente.

Introduzione

La risposta cellulare alle rotture del doppio filamento è ben documentata a causa di una successione di metodi sempre più potenti per dirigere le rotture verso siti genomici specifici ^1,2,3. La certezza della posizione consente una caratterizzazione univoca delle proteine e di altri fattori che si accumulano nel sito e partecipano alla risposta al danno del DNA (DDR), guidando così i percorsi di giunzione finale non omologa (NHEJ) e ricombinazione omologa (HR) che riparano le rotture. Naturalmente, molte rotture sono introdotte da agenti come radiazioni e specie chimiche che non attaccano sequenze specifiche⁴. Tuttavia, per questi sono disponibili procedure che possono convertire le estremità in strutture suscettibili di tagging e localizzazione ^5,6. Le rotture sono introdotte anche da processi biologici, come il riarrangiamento delle immunoglobuline, e la tecnologia recente consente la loro localizzazione, così come⁷. La relazione tra i fattori di risposta e tali siti può quindi essere determinata.

Le rotture appaiono anche come conseguenza indiretta di addotti formati da composti che non sono interruttori intrinseci ma interrompono le transazioni del DNA come la trascrizione e la replicazione. Possono formarsi come caratteristica della risposta cellulare a queste ostruzioni, forse durante la riparazione o perché provocano una struttura vulnerabile all'attacco della nucleasi. Tipicamente, la relazione fisica tra l'addotto, la rottura e l'associazione con i fattori di risposta è inferenziale. Ad esempio, le ICL sono formate da chemioterapici come il cisplatino e la mitomicina C⁸ e come prodotto di reazione dei siti abasici⁹. Le ICL sono ben note come potenti blocchi delle forcelle di replicazione¹⁰, bloccando così le forcelle che possono essere scisse dalle nucleasi¹¹. Il legame covalente tra i filamenti è spesso alleviato da vie che hanno rotture obbligate come intermedi^12,13, che richiedono una ricombinazione omologa per ricostruire la forcella di replicazione¹⁴. Nella maggior parte degli esperimenti il ricercatore segue la risposta dei fattori di interesse alle rotture che si formano a valle della collisione di una forcella di replicazione con una ICL. Tuttavia, poiché non esiste una tecnologia per la localizzazione di una lesione provocatoria, la vicinanza del rispondente e delle sue parti componenti alla ICL può essere solo assunta.

Abbiamo sviluppato una strategia per consentire l'analisi delle associazioni proteiche con addotti covalenti non specifici di sequenza, illustrati qui dalle ICL. Nel nostro sistema questi sono introdotti dallo psoralene, un prodotto naturale fotoattivo utilizzato da migliaia di anni come terapeutico per i disturbi della pelle¹⁵. Il nostro approccio si basa su due importanti caratteristiche degli psoraleni. Il primo è la loro alta frequenza di formazione di reticoli, che può superare il 90% degli addotti, in contrasto con il meno del 10% formato da composti popolari come il cisplatino o la mitomicina C ^8,16. Il secondo è l'accessibilità del composto alla coniugazione senza perdita di capacità di reticolazione. Abbiamo collegato covalentemente il trimetil psoralene alla digoxigenina (Dig), un immunotag di lunga data. Ciò consente la rilevazione degli addotti psoraleni nel DNA genomico mediante immunocolorazione del tag Dig e visualizzazione mediante immunofluorescenza convenzionale¹⁷.

Questo reagente è stato applicato, nel nostro lavoro precedente, all'analisi degli incontri della forcella di replicazione con ICL utilizzando un saggio basato su fibre di DNA¹⁶. In quel lavoro abbiamo scoperto che la replica poteva continuare oltre una ICL intatta. Questo dipendeva dalla chinasi ATR, che è attivata dallo stress di replicazione. Il riavvio della replica era inaspettato data la struttura dell'elicasi replicativa CMG. Questo consiste nell'etero-esamero MCM (M) che forma un anello gapped sfalsato attorno al filamento modello per la sintesi del filamento principale che è bloccato dalle proteine del complesso GINS (G, costituito da PSF1, 2, 3 e SLD5) e CDC45 (C) ¹⁸. La proposta che la replica potesse ricominciare sul lato del distale ICL sul lato della collisione del risposo sosteneva un cambiamento nella struttura del rispososo. Per rispondere alla questione di quali componenti fossero presenti nella risposta al momento dell'incontro con una Lci, abbiamo sviluppato l'approccio qui descritto. Abbiamo sfruttato il tag Dig come partner in Proximity Ligation Assays (PLA)¹⁹ per interrogare la stretta associazione della ICL con le proteine del replisome²⁰.

Protocollo

1. Preparazione delle cellule

1. Giorno 1
   1. Pretrattare i piatti di coltura con fondo di vetro da 35 mm con una soluzione adesiva cellulare.
   2. Cellule a piastre nei piatti pretrattati un giorno prima del trattamento. La cellula dovrebbe dividersi attivamente e confluente al 50-70% il giorno dell'esperimento.
      NOTA: Le cellule HeLa sono state utilizzate in questo esperimento con Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, integrato con siero bovino fetale al 10%, 1x penicillina / streptomicina. Non vi è alcuna restrizione per le linee cellulari aderenti. Tuttavia, le celle non aderenti devono essere centrifugate su vetrini e fissate prima dell'analisi mediante PLA.
2. Giorno 2
   1. Preparare una soluzione madre di digossigenina trimetil psoralene (Dig-TMP) risospendendo un'aliquota congelata di Dig-TMP precedentemente sintetizzato in 1:1 EtOH:H 2 O. Determinarela concentrazione misurando OD a 250 nm di una diluizione 100x (in H₂O) del Dig-TMP disciolto. Il coefficiente di estinzione di Dig-TMP è 25.000. Verificare la concentrazione misurando OD a 250 nm prima di ogni utilizzo e calcolare la concentrazione dello stock: Abs x 100 x 10⁶/25.000 = Concentrazione (in μM). Generalmente, la soluzione madre è di circa 3 mM. La soluzione può essere conservata a –20 °C per circa un mese.
      NOTA: Dig-TMP deve essere sintetizzato chimicamente in anticipo, seguendo la procedura descritta qui. Reflusso 4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsoralene con 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-ammina in toluene sotto azoto per 12 ore. Rimuovere il solvente e recuperare il prodotto 4'-[N-(13-ammino-4,7,10-trioxatrideca)] amminometil-4,5',8-trimetilpsoralene mediante cromatografia su gel di silice. Coniugare il prodotto all'estere della digoxigenina NHS in dimetil formammide e trietilammina a 50 °C per 18 ore. Rimuovere il solvente e purificare il residuo mediante cromatografia preparativa su gel di silice su strato sottile. Eluire la banda del prodotto cloroformio: metanolo: miscela di idrossido di ammonio al 28% (8:1:0.1). Evaporare i solventi e sciogliere il pellet in 50% EtOH:H₂O.
   2. Aggiungere il materiale di Dig-TMP al 50% di EtOH:H₂O al terreno di coltura cellulare fino a una concentrazione finale di 5 μM. Portare il terreno a 37 °C. Aspirare il mezzo dalle piastre, aggiungere il mezzo contenente Dig-TMP preriscaldato e posizionare le piastre in un incubatore (37 °C, 5% CO₂) per 30 minuti per consentire al Dig-TMP di equilibrarsi.
   3. Mentre le cellule sono in incubazione, preriscaldare la scatola UV (vedi Tabella dei materiali) a 37 °C.
   4. Posizionare le piastre nella scatola UV preriscaldata ed esporre le cellule a una dose di 3 J / cm² di luce UVA per 5 minuti per questo esperimento. Le piastre sono state posizionate sopra un blocco termico mantenuto a 37 °C, durante l'irradiazione. Calcola il tempo usando la formula:
      
   5. Aspirare il mezzo con una pipetta, aggiungere un mezzo fresco preriscaldato e riporre le piastre nell'incubatore a 37 °C, 5% di CO₂ per 1 ora.
   6. Rimuovere i terreni e lavare delicatamente i piatti una volta con soluzione salina tamponata fosfato (PBS).
   7. Rimuovere PBS e aggiungere lo 0,1% di formaldeide (FA) in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Ciò impedisce il distacco cellulare durante il pretrattamento CSK-R (tampone di estrazione del citoscheletro contenente RNasi, descritto al punto 1.2.9.) necessario per estrarre gli elementi citoplasmatici e ridurre il fondo di PLA.
   8. Aspirare la FA e lavare i piatti con PBS una volta.
   9. Aggiungere tampone CSK-R e incubare per 5 minuti a RT per rimuovere il citoplasma [tampone CSK-R: 10 mM PIPES, pH 7,0, 100 mM NaCl, 300 mM saccarosio, 3 mM MgCl₂, 0,5% Triton X-100, 300 μg/mL RNasi A]. Aspirare il buffer, aggiungere CSK-R fresco e incubare per 5 minuti a RT.
      NOTA: Una scorta di tampone CSK può essere conservata a 4 °C e Triton X e RNaseA aggiunti subito prima dell'uso.
   10. Lavare con PBS tre volte.
   11. Fissare le cellule con formaldeide al 4% in PBS per 10 minuti a RT.
   12. Lavare le celle con PBS. Eseguire questo passaggio tre volte.
   13. Aggiungere metanolo freddo al 100% e incubare per 20 minuti a -20 °C.
   14. Lavare le celle con PBS tre volte. A questo punto le celle possono essere conservate in PBS in una camera umida a 4 °C per un massimo di una settimana.
   15. Incubare le cellule in 80 μL di 5 mM TritonX-100 per 10 minuti a 4 °C.
   16. Incubare cellule con 100 μL di 5 mM EDTA in PBS integrato con 1 μL di 100 mg/mL RNasi A per 30 minuti a 37 °C.
   17. Lavare le celle con PBS tre volte.
   18. Conservare le cellule in tampone bloccante (5% BSA e 10% siero di capra in PBS) in camera umida per una notte a 4 °C.

2. Saggio di legatura di prossimità

NOTA: eseguire il test di legatura di prossimità il giorno 3.

1. Colorazione anticorpale
   1. Preparare 40 μL della soluzione anticorpale primaria per piastra: aggiungere il volume appropriato di anticorpi primari per ottenere la diluizione desiderata (anti-digossigenina del topo e anticorpo di coniglio contro un componente rispondente come MCM5, CDC45, PSF1 o pMCM2, diluizioni specificate nella tabella dei materiali) nel tampone bloccante (per raggiungere un volume finale di 24 μL). Mescolare picchiettando e lasciare riposare per 20 minuti a RT. Preparare un master mix per più campioni e mescolare toccando prima di applicare ai pozzetti.
   2. Aggiungere 40 μL di soluzione anticorpale primaria al centro del pozzetto e incubare in camera umida per 1 h a 37 °C. Durante la colorazione, lasciare che le sonde PLA e il tampone di blocco si riscaldino a temperatura ambiente.
   3. Lavare le celle con PBS-T [PBS-T: 0,05% Tween-20 in 1X PBS] in RT. Eseguire questo passaggio tre volte.
   4. Durante il lavaggio, preparare 40 μL di soluzione di sonda PLA per piatto (le sonde PLA sono costituite da un anticorpo secondario che riconosce le IgG di coniglio o di topo, legate covalentemente a un oligonucleotide PLUS o MINUS): 8 μL di sonda PLA anti mouse-PLUS + 8 μL di sonda PLA anticorpo anti-rabbit-MINUS + 24 μL di tampone bloccante. Mescolare e lasciare riposare per 20 minuti a RT. Preparare un master mix per più campioni e mescolare bene prima di applicare ai pozzetti. Posizionare la soluzione al centro del pozzetto nel piatto.
   5. Rimuovere l'ultimo lavaggio, aggiungere 40 μL di soluzione di sonda PLA al centro del pozzetto e incubare in una camera umida per 1 ora a 37 °C.
   6. Lavare in tampone A tre volte, per 10 minuti ciascuno, su una piattaforma inclinabile a RT. Durante il lavaggio, portare la miscela di legatura a RT.
2. Legatura e amplificazione
   1. Preparare 40 μL di miscela di legatura per piastra: 8 μL (5x) di materiale di legatura + 31 μL di acqua distillata + 1 μL di ligasi. Preparare la miscela master per più piastre e mescolare bene prima di applicare ai pozzetti.
   2. Aggiungere 40 μL di soluzione di legatura su ciascuna piastra e incubare in camera umida per 30 minuti a 37 °C.
   3. Lavare le celle 3x con tampone A, ciascuna per 2 minuti, su una piattaforma inclinabile a RT.
   4. Preparare 40 μL di soluzione di amplificazione per piatto: 8 μL (5x) di stock di amplificazione + 31,5 μL di acqua distillata + 0,5 μL di DNA polimerasi. Preparare un master mix per più campioni e mescolare bene prima di applicare ai pozzetti.
   5. Aggiungere 40 μL di soluzione di amplificazione a ciascuna piastra e incubare in una camera umida a 37 °C per 100 minuti.
   6. Aspirare la soluzione di amplificazione e lavare con tampone B. Eseguire 6 lavaggi ciascuno per 10 minuti, su una piattaforma inclinabile a RT.
   7. Lavare una volta con tampone B 0,01x per 1 minuto a RT.
   8. Aspirare tampone B e piastre di incubazione con anticorpi secondari, Alexa Fluor 488 anti-topo IgG e Alexa Fluor 568 anti-coniglio IgG in soluzione bloccante a diluizioni appropriate in tampone bloccante, in camera umida, per 30 minuti a 37 °C o per una notte a 4 °C.
   9. Lavare le celle tre volte con PBS-T, per 10 minuti ciascuna su una piattaforma inclinabile a RT.
   10. Aspirare PBS-T e montare nel mezzo di montaggio con DAPI. Le lastre montate possono essere visualizzate immediatamente o conservate a 4 °C al buio per non più di 4 giorni prima dell'imaging.

3. Imaging e quantificazione

1. Eseguire l'imaging in un microscopio epifluorescente o confocale (se l'imaging 3D è desiderabile, coprire almeno 3 μm in 15 pile). Eseguire esperimenti in triplice copia e immagine di un numero sufficiente di campi per effettuare almeno 100 osservazioni per campione o condizione. Visualizzare l'immagine di tutti i campi e i campioni, inclusi i controlli, utilizzando le stesse impostazioni di esposizione.
2. Quantificare con un software di analisi delle immagini appropriato (vedi Tabella dei materiali per software open source e commerciale in grado di eseguire questa analisi in immagini piane singole o multiple).
   1. Segmentare i nuclei cellulari in base alla colorazione DAPI. Eseguire il rilevamento di punti PLA nucleari. Assegna i punti PLA al nucleo corrispondente. Esporta i punti PLA per nucleo come file csv (vedi File supplementare 1 e File supplementare 2).
3. Analisi statistica (vedere la tabella dei materiali per il software open source e commerciale suggerito).
   1. Verificare se i campioni seguono una distribuzione normale con un test di Shapiro-Wilk.
   2. Determinare se esiste una differenza significativa tra due campioni utilizzando un test Student-t (se l'ipotesi di distribuzione normale è soddisfatta) o un test Wilcoxon-Rank Sum (se l'ipotesi di distribuzione normale viene violata per un campione).
4. Visualizzazione dei dati: generare grafici a punti combinati con box plot per visualizzare la distribuzione dei dati, mediana (Q₂), 25° (Q₁) e 75^{° percentile} per i diversi^{campioni (vedere} Tabella dei materiali per software open source e commerciale suggerito).

4.3D visualizzazione di pMCM2: interazioni ICL

1. Immagini di lastre PLA su un microscopio confocale a disco rotante, utilizzando un obiettivo per olio ad apertura numerica Plan Fluor 60x/1.25. Acquisire 16 pile che coprono 1,6 mm e generare la ricostruzione 3D con l'apposito software di analisi delle immagini (vedi Tabella dei Materiali).

Risultati

PLA di Dig-TMP con proteine replisome
La struttura del Dig-TMP è illustrata nella Figura 1. I dettagli della sintesi, in cui il trimetil psoralene è stato coniugato attraverso un glicole linker alla digoxigenina, sono stati discussi in precedenza^17,21. L'incubazione delle cellule con il composto seguita dall'esposizione alla luce a 365 nm (UVA) fotoattiva il composto e guida la reazione di reticolazione. Poco pi...

Discussione

Sebbene il PLA sia una tecnica molto potente, ci sono problemi tecnici che devono essere risolti per ottenere risultati chiari e riproducibili. Gli anticorpi devono essere di elevata affinità e specificità. Inoltre, è importante ridurre il più possibile i segnali di fondo non specifici. Abbiamo scoperto che le membrane e i detriti cellulari contribuiscono allo sfondo e li abbiamo rimossi il più possibile. I lavaggi con detergente contenente tamponi prima del fissaggio e il lavaggio con metanolo dopo il fissaggio aiu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Invitrogen	A-10011	1 in 1000
35 mm plates with glass 1.5 coverslip	MatTek	P35-1.5-14-C	Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell
Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Invitrogen	A-10001	1 in 1000
Bovine serum albumin (BSA)	SeraCare	1900-0012	Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
CDC45 antibody (rabbit)	Abcam	ab126762	1 in 200
Cell adhesive	Life Science	354240	for cell-TAK solution
Confocal microscope	Nikkon	Nikon TE2000 spinning disk microscope	equiped with Volocity software
Digoxigenin (Dig) antibody (mouse)	Abcam	ab420	1 in 200
Dig-TMP	synthesized in the Seidman Lab
Duolink Amplification reagents (5×)	Sigma-Aldrich	DUO82010	reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ detection reagents	Sigma-Aldrich	DUO92007	reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004	anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
epifluorescent microscope	Zeiss	Axiovert 200M microscope	Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)
Formaldehyde 16%	Fisher Scientific	PI28906	for fix solution
Goat serum	Thermo	31873	Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
Image analysis software	open source	Cell profiler	works for analysis of single plane images
Image analysis software-license required	Bitplane	Imaris	Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions
Ligase (1 unit/μl)	Sigma-Aldrich	DUO82029	reagents need to be stored at -20 °C
Ligation reagent (5×)	Sigma-Aldrich	DUO82009	reagents need to be stored at -20 °C
MCM2 antibody (rabbit)	Abcam	ab4461	1 in 200
MCM5 antibody (rabbit monoclonal)	Abcam	Ab75975	1 in 1000
Methanol	Lab ALLEY	A2076	pre-cold at -20°C before use
phosphoMCM2S108 antibody (rabbit)	Abcam	ab109271	1 in 200
Polymerase (10 unit/μl)	Sigma-Aldrich	DUO82030	reagents need to be stored at -20 °C
Prolong gold mounting media with DAPI	ThermoFisher Scientific	P36935
PSF1 antibody (rabbit)	Abcam	ab181112	1 in 200
RNAse A 100 mg/ml	Qiagen	19101	reagents need to be stored at 4 °C
Statistical analysis and data visualization software	open source	R studio	ggplot2 package for generation of dot plot and box plots
Statistical analysis and data visualization software-license required	Systat Software	Sigmaplot V13
TMP (trioxalen)	Sigma-Aldrich	T6137_1G
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787_250ML
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416_100ML
UV box	Southern New England Ultraviolet		Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement
UV test Chamber	Opsytec	UV TEST CHAMBER BS-04
VE-821	Selleckchem	S8007	final concentrtion is 1µM