Visualizzazione di incontri replisali con una lesione bloccante con tag antigene

Riepilogo

Mentre le collisioni della forcella di replicazione con gli addotti del DNA possono indurre rotture a doppio filamento, meno si sa sull'interazione tra replisomi e lesioni bloccanti. Abbiamo impiegato il saggio di legatura di prossimità per visualizzare questi incontri e per caratterizzare le conseguenze per la composizione delle risposte.

Abstract

Sono presenti informazioni considerevoli sulla risposta cellulare alle rotture a doppio filamento (DSB), indotte da nucleasi, radiazioni e altri rompitori di DNA. In parte, ciò riflette la disponibilità di metodi per l'identificazione dei siti di rottura e la caratterizzazione dei fattori reclutati per i DSB in tali sequenze. Tuttavia, i DSB appaiono anche come intermedi durante l'elaborazione di addotti del DNA formati da composti che non causano direttamente rotture e non reagiscono in siti di sequenza specifici. Di conseguenza, per la maggior parte di questi agenti, le tecnologie che consentono l'analisi delle interazioni di legame con i fattori di risposta e le proteine di riparazione sono sconosciute. Ad esempio, i legami incrociati tra filamenti di DNA (ICL) possono provocare rotture in seguito a incontri di fork di replicazione. Sebbene formata da farmaci ampiamente usati come chemioterapici del cancro, non esiste una metodologia per monitorare le loro interazioni con le proteine di replicazione.

Qui, descriviamo la nostra strategia per seguire la risposta cellulare alle collisioni della forcella con questi addotti impegnativi. Abbiamo collegato un antigene steroideo allo psoralene, che forma ICL dipendenti dalla fotoattivazione nei nuclei delle cellule viventi. Le ICL sono state visualizzate mediante immunofluorescenza contro il tag dell'antigene. Il tag può anche essere un partner nel Proximity Ligation Assay (PLA) che riporta la stretta associazione di due antigeni. Il PLA è stato sfruttato per distinguere le proteine che erano strettamente associate alle ICL marcate da quelle che non lo erano. È stato possibile definire le proteine replisome che sono state trattenute dopo incontri con ICL e identificare altre che sono state perse. Questo approccio è applicabile a qualsiasi struttura o addotto del DNA che può essere rilevato immunologicamente.

Introduzione

La risposta cellulare alle rotture del doppio filamento è ben documentata a causa di una successione di metodi sempre più potenti per dirigere le rotture verso siti genomici specifici ^1,2,3. La certezza della posizione consente una caratterizzazione univoca delle proteine e di altri fattori che si accumulano nel sito e partecipano alla risposta al danno del DNA (DDR), guidando così i percorsi di giunzione finale non omologa (NHEJ) e ricombinazione omologa (HR) che riparano le rotture. Naturalmente, molte rotture sono introdotte da agenti come radiazioni e specie chimiche che ....

Protocollo

1. Preparazione delle cellule

1. Giorno 1
   1. Pretrattare i piatti di coltura con fondo di vetro da 35 mm con una soluzione adesiva cellulare.
   2. Cellule a piastre nei piatti pretrattati un giorno prima del trattamento. La cellula dovrebbe dividersi attivamente e confluente al 50-70% il giorno dell'esperimento.
      NOTA: Le cellule HeLa sono state utilizzate in questo esperimento con Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, integrato con siero bovino fetale al 10%, 1x penicillina / streptomicina. Non vi è alcuna restrizione per le linee cellulari aderenti. Tuttavia, le celle non aderenti devono essere centrifugate su vetrini e fissate prima dell'analisi m....

Risultati

PLA di Dig-TMP con proteine replisome
La struttura del Dig-TMP è illustrata nella Figura 1. I dettagli della sintesi, in cui il trimetil psoralene è stato coniugato attraverso un glicole linker alla digoxigenina, sono stati discussi in precedenza^17,21. L'incubazione delle cellule con il composto seguita dall'esposizione alla luce a 365 nm (UVA) fotoattiva il composto e guida la reazione di reticolazione. Poco pi.......

Discussione

Sebbene il PLA sia una tecnica molto potente, ci sono problemi tecnici che devono essere risolti per ottenere risultati chiari e riproducibili. Gli anticorpi devono essere di elevata affinità e specificità. Inoltre, è importante ridurre il più possibile i segnali di fondo non specifici. Abbiamo scoperto che le membrane e i detriti cellulari contribuiscono allo sfondo e li abbiamo rimossi il più possibile. I lavaggi con detergente contenente tamponi prima del fissaggio e il lavaggio con metanolo dopo il fissaggio aiu.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Invitrogen	A-10011	1 in 1000
35 mm plates with glass 1.5 coverslip	MatTek	P35-1.5-14-C	Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell
Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Invitrogen	A-10001	1 in 1000
Bovine serum albumin (BSA)	SeraCare	1900-0012	Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
CDC45 antibody (rabbit)	Abcam	ab126762	1 in 200
Cell adhesive	Life Science	354240	for cell-TAK solution
Confocal microscope	Nikkon	Nikon TE2000 spinning disk microscope	equiped with Volocity software
Digoxigenin (Dig) antibody (mouse)	Abcam	ab420	1 in 200
Dig-TMP	synthesized in the Seidman Lab
Duolink Amplification reagents (5×)	Sigma-Aldrich	DUO82010	reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ detection reagents	Sigma-Aldrich	DUO92007	reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004	anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
epifluorescent microscope	Zeiss	Axiovert 200M microscope	Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)
Formaldehyde 16%	Fisher Scientific	PI28906	for fix solution
Goat serum	Thermo	31873	Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
Image analysis software	open source	Cell profiler	works for analysis of single plane images
Image analysis software-license required	Bitplane	Imaris	Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions
Ligase (1 unit/μl)	Sigma-Aldrich	DUO82029	reagents need to be stored at -20 °C
Ligation reagent (5×)	Sigma-Aldrich	DUO82009	reagents need to be stored at -20 °C
MCM2 antibody (rabbit)	Abcam	ab4461	1 in 200
MCM5 antibody (rabbit monoclonal)	Abcam	Ab75975	1 in 1000
Methanol	Lab ALLEY	A2076	pre-cold at -20°C before use
phosphoMCM2S108 antibody (rabbit)	Abcam	ab109271	1 in 200
Polymerase (10 unit/μl)	Sigma-Aldrich	DUO82030	reagents need to be stored at -20 °C
Prolong gold mounting media with DAPI	ThermoFisher Scientific	P36935
PSF1 antibody (rabbit)	Abcam	ab181112	1 in 200
RNAse A 100 mg/ml	Qiagen	19101	reagents need to be stored at 4 °C
Statistical analysis and data visualization software	open source	R studio	ggplot2 package for generation of dot plot and box plots
Statistical analysis and data visualization software-license required	Systat Software	Sigmaplot V13
TMP (trioxalen)	Sigma-Aldrich	T6137_1G
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787_250ML
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416_100ML
UV box	Southern New England Ultraviolet		Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement
UV test Chamber	Opsytec	UV TEST CHAMBER BS-04
VE-821	Selleckchem	S8007	final concentrtion is 1µM