Визуализация ответных встреч с поражением, помеченным антигеном, блокирующим поражение

Резюме

В то время как репликационные вилочные столкновения с аддуктами ДНК могут вызывать разрывы двойной цепи, меньше известно о взаимодействии между реплисомами и блокирующими поражениями. Мы использовали анализ лигирования близости, чтобы визуализировать эти встречи и охарактеризовать последствия для состава реплисом.

Аннотация

Значительное понимание клеточного ответа на двухцепочечные разрывы (DSB), индуцированные нуклеазами, радиацией и другими разрушителями ДНК. Отчасти это отражает наличие методов идентификации участков разрыва и характеристику факторов, привлекаемых в ОРС в этих последовательностях. Однако DSB также появляются в качестве промежуточных продуктов при обработке аддуктов ДНК, образованных соединениями, которые непосредственно не вызывают разрывов и не реагируют на определенные участки последовательности. Следовательно, для большинства из этих агентов технологии, позволяющие анализировать связывающие взаимодействия с факторами ответа и белками репарации, неизвестны. Например, межцепочечные сшивки ДНК (ICL) могут провоцировать разрывы после встреч репликационной вилки. Несмотря на то, что они формируются препаратами, широко используемыми в качестве химиотерапии рака, не было методологии мониторинга их взаимодействия с репликационными белками.

Здесь мы описываем нашу стратегию отслеживания клеточного ответа на столкновения вилок с этими сложными аддуктами. Мы связали стероидный антиген с псораленом, который образует фотоактивационно-зависимые ICL в ядрах живых клеток. ICL визуализировали с помощью иммунофлуоресценции против метки антигена. Метка также может быть партнером в анализе бесконтактного лигирования (PLA), который сообщает о тесной связи двух антигенов. PLA использовали, чтобы отличить белки, которые были тесно связаны с мечеными ICL, от тех, которые не были связаны. Удалось определить реплисомные белки, которые были сохранены после встреч с ICL, и идентифицировать другие, которые были потеряны. Этот подход применим к любой структуре или аддукту ДНК, которые могут быть обнаружены иммунологически.

Введение

Клеточная реакция на двухцепочечные разрывы хорошо задокументирована благодаря последовательности все более мощных методов направления разрывов к определенным участкам генома ^1,2,3. Определенность местоположения позволяет однозначно охарактеризовать белки и другие факторы, которые накапливаются на участке и участвуют в реакции на повреждение ДНК (DDR), тем самым управляя путями негомологичного концевого соединения (NHEJ) и гомологичной рекомбинации (HR), которые восстанавливают разрывы. Конечно, многие разрывы вводятся такими агентами, как радиация и химические вещества, которые не атакуют определенные последовательности⁴. Однако для них существуют процедуры, которые могут преобразовать концы в структуры, поддающиеся маркировке и локализации ^5,6. Разрывы также вносятся биологическими процессами, такими как перестройка иммуноглобулинов, и последние технологии позволяют их локализовать, а также⁷. Затем можно определить взаимосвязь между реагирующими факторами и этими сайтами.

Разрывы также появляются как косвенное следствие аддуктов, образованных соединениями, которые не являются врожденными разрушителями, но нарушают транзакции ДНК, такие как транскрипция и репликация. Они могут быть сформированы как особенность клеточного ответа на эти препятствия, возможно, во время восстановления или потому, что они провоцируют структуру, которая уязвима для атаки нуклеаз. Как правило, физическая связь между аддуктом, разрывом и ассоциацией с реагирующими факторами является выводной. Например, ICL образуются химиотерапевтическими средствами, такими как цисплатин и митомицин^С8, и в качестве продукта реакции основных сайтов⁹. ICL хорошо известны как мощные блоки репликационных вилок¹⁰, тем самым останавливая вилки, которые могут быть расщеплены нуклеазами¹¹. Ковалентная связь между цепями часто облегчается путями, которые имеют облигатные разрывы в качестве промежуточных^{продуктов 12,13,} что требует гомологичной рекомбинации для восстановления репликационной вилки¹⁴. В большинстве экспериментов исследователь следит за реакцией интересующих факторов на разрывы, которые образуются ниже по течению от столкновения репликационной вилки с ICL. Однако, поскольку не было никакой технологии локализации провокационного поражения, можно только предположить близость реплизомы и ее составных частей к ICL.

Мы разработали стратегию, позволяющую анализировать белковые ассоциации с непоследовательными специфическими ковалентными аддуктами, проиллюстрированными здесь ICL. В нашу систему они введены псораленом, фотоактивным натуральным продуктом, используемым на протяжении тысячелетий в качестве терапевтического средства для лечения кожных заболеваний¹⁵. Наш подход основан на двух важных особенностях псораленов. Во-первых, это их высокая частота образования сшивки, которая может превышать 90% аддуктов, в отличие от менее 10%, образованных популярными соединениями, такими как цисплатин или митомицин С ^8,16. Во-вторых, доступность соединения к сопряжению без потери сшивающей способности. Мы ковалентно связываем триметилпсорален с дигоксигенином (Dig), давно установленной иммунометкой. Это позволяет обнаруживать аддукты псоралена в геномной ДНК с помощью иммуноокрашивания метки Dig и визуализации с помощью обычной иммунофлуоресценции¹⁷.

Этот реагент был применен в нашей предыдущей работе для анализа встреч репликационной вилки с ICL с использованием анализа на основе ДНК-волокна¹⁶. В этой работе мы обнаружили, что репликация может продолжаться после неповрежденного ICL. Это зависело от ATR-киназы, которая активируется репликационным стрессом. Перезапуск репликации был неожиданным, учитывая структуру репликативной геликазы CMG. Он состоит из гетерогексамера MCM (M), который образует кольцо со смещенным зазором вокруг матричной цепи для синтеза ведущей цепи, которая заблокирована белками комплекса GINS (G, состоящего из PSF1, 2, 3 и SLD5) и CDC45 (C) ¹⁸. Предположение о том, что репликация может быть возобновлена на стороне ICL дистальнее стороны столкновения реплисом, приводило доводы в пользу изменения структуры реплисомы. Чтобы ответить на вопрос о том, какие компоненты были в ответе во время встречи с ICL, мы разработали подход, описанный здесь. Мы использовали тег Dig в качестве партнера в анализах бесконтактного лигирования (PLA)¹⁹ для изучения тесной связи ICL с белками реплиомы²⁰.

протокол

1. Подготовка клеток

1. День 1
   1. Предварительно обработайте 35-миллиметровые чашки для культур со стеклянным дном клеевым раствором.
   2. Пластинчатые клетки в предварительно обработанной посуде за сутки до обработки. Клетка должна быть активно делящейся и на 50–70% сливаться в день эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки HeLa использовались в этом эксперименте с Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, дополненным 10% фетальной бычьей сывороткой, 1x пенициллином / стрептомицином. Нет ограничений для адгезивных клеточных линий. Тем не менее, неадгезивные клетки должны быть центрифугированы на предметных стеклах и зафиксированы перед анализом с помощью PLA.
2. День 2
   1. Приготовьте исходный раствор дигоксигенина триметилпсоралена (Dig-TMP) путем ресуспендирования замороженной аликвоты ранее синтезированного Dig-TMP в 1:1 EtOH:H 2 O. Определите концентрацию,измерив OD при 250 нм 100-кратного разбавления (в H₂O) растворенного Dig-TMP. Коэффициент вымирания Dig-TMP составляет 25 000. Проверяйте концентрацию, измеряя OD на длине волны 250 нм перед каждым использованием, и рассчитывайте концентрацию запасов: Abs x 100 x 10⁶/25 000 = концентрация (в мкМ). Как правило, исходный раствор составляет около 3 мМ. Раствор можно хранить при температуре –20 °C около месяца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Dig-TMP должен быть химически синтезирован заранее, следуя процедуре, описанной здесь. Рефлюкс 4'-хлорметил-4,5',8-триметилпсорален с 4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамином в толуоле под азотом в течение 12 ч. Удалите растворитель и восстановите продукт 4'-[N-(13-амино-4,7,10-триоксатридека)] аминометил-4,5',8-триметилпсорален с помощью силикагелевой хроматографии. Конъюгируют продукт с дигоксигениновым эфиром NHS в диметилформамиде и триэтиламине при 50 °C в течение 18 ч. Удалите растворитель и очистите остаток препаративной тонкослойной силикагелевой хроматографией. Разбавление полосы продукта хлороформ: метанол: смесь 28% гидроксида аммония (8:1:0,1). Выпарить растворители и растворить гранулу в 50% EtOH:H₂O.
   2. Добавьте сырье Dig-TMP в 50% EtOH:H₂O в среду для культивирования клеток до конечной концентрации 5 мкМ. Доведите среду до 37 °C. Аспирируйте среду из пластин, добавьте предварительно подогретую среду, содержащую Dig-TMP, и поместите пластины в инкубатор (37 °C, 5% CO₂) на 30 минут, чтобы дать Dig-TMP уравновеситься.
   3. Во время инкубации клеток предварительно прогрейте УФ-бокс (см. Таблицу материалов) до 37 °C.
   4. Поместите планшеты в предварительно разогретый УФ-бокс и подвергните клетки дозе 3 Дж/^см2 ультрафиолетового света в течение 5 минут для этого эксперимента. Пластины были помещены поверх термоблока, поддерживаемого при 37 ° C во время облучения. Рассчитайте время по формуле:
      
   5. Аспирируйте среду с помощью пипетки, добавьте свежую предварительно подогретую среду и поместите пластины обратно в инкубатор при 37 °C, 5%_CO2 на 1 час.
   6. Удалите носитель и аккуратно вымойте посуду один раз фосфатным солевым раствором (PBS).
   7. Удалите PBS и добавьте 0,1% формальдегида (FA) в PBS в течение 5 минут при комнатной температуре (RT). Это предотвращает отслоение клеток во время предварительной обработки CSK-R (буфер экстракции цитоскелета, содержащий РНКазу, описанный в 1.2.9.), необходимой для извлечения цитоплазматических элементов и снижения фона PLA.
   8. Аспирируйте FA и один раз вымойте посуду с помощью PBS.
   9. Добавьте буфер CSK-R и инкубируйте в течение 5 мин при RT для удаления цитоплазмы [буфер CSK-R: 10 мМ PIPES, pH 7,0, 100 мМ NaCl, 300 мМ сахарозы, 3 мМ MgCl₂, 0,5% Triton X-100, 300 мкг/мл РНКазы A]. Аспирируйте буфер, добавьте свежий CSK-R и выдерживайте в течение 5 минут при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запас буфера CSK можно хранить при температуре 4 °C, а Triton X и RNaseA добавлять непосредственно перед использованием.
   10. Трижды вымойте PBS.
   11. Зафиксируйте ячейки с 4% формальдегидом в PBS в течение 10 мин при ЛТ.
   12. Вымойте клетки с помощью PBS. Выполните этот шаг три раза.
   13. Добавьте холодный 100% метанол и выдерживайте в течение 20 мин при -20 °C.
   14. Трижды промойте клетки PBS. На этом этапе клетки можно хранить в PBS во влажной камере при 4 ° C до недели.
   15. Инкубировать клетки в 80 мкл 5 мМ TritonX-100 в течение 10 мин при 4 °C.
   16. Инкубируйте клетки со 100 мкл 5 мМ ЭДТА в PBS с добавлением 1 мкл 100 мг / мл РНКазы А в течение 30 мин при 37 ° C.
   17. Трижды промойте клетки PBS.
   18. Храните клетки в блокирующем буфере (5% BSA и 10% козьей сыворотки в PBS) во влажной камере в течение ночи при 4 ° C.

2. Анализ бесконтактного лигирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните анализ бесконтактного лигирования на 3-й день.

1. Окрашивание антителами
   1. Приготовьте 40 мкл раствора первичного антитела на планшет: добавьте соответствующий объем первичных антител для достижения желаемого разведения (мышиный антидигоксигенин и кроличье антитело против реплисомного компонента, такого как MCM5, CDC45, PSF1 или pMCM2, разведения, указанные в таблице материалов) в блокирующий буфер (для достижения конечного объема 24 мкл). Перемешайте, постукивая, и дайте ему постоять 20 минут при RT. Приготовьте мастер-смесь для нескольких образцов и перемешайте постукиванием перед нанесением в скважины.
   2. Добавьте 40 мкл раствора первичного антитела в центр лунки и инкубируйте во влажной камере в течение 1 ч при 37 °C. Во время окрашивания дайте зондам PLA и блокирующему буферу нагреться до комнатной температуры.
   3. Промывайте ячейки с помощью PBS-T [PBS-T: 0,05% Tween-20 в 1X PBS] при RT. Выполните этот шаг три раза.
   4. Во время мытья приготовьте 40 мкл раствора зонда PLA на чашку (зонды PLA состоят из вторичного антитела, распознающего IgG кролика или мыши, ковалентно связанного с олигонуклеотидом PLUS или MINUS): 8 мкл зонда PLA против мыши-PLUS + 8 мкл зонда PLA против антитела кролика-МИНУС + 24 мкл блокирующего буфера. Перемешайте и дайте постоять 20 минут при RT. Приготовьте мастер-смесь для нескольких образцов и хорошо перемешайте перед нанесением в лунки. Поместите раствор в середину лунки в тарелку.
   5. Удалите последнюю промывку, добавьте 40 мкл раствора зонда PLA в центр лунки и инкубируйте во влажной камере в течение 1 ч при 37 ° C.
   6. Промываем в буфере А трижды по 10 мин на опрокидывающейся платформе при РТ. Во время промывания доведите смесь для перевязки до RT.
2. Лигирование и амплификация
   1. Приготовьте 40 мкл смеси для лигирования на пластину: 8 мкл (5x) лигационного сырья + 31 мкл дистиллированной воды + 1 мкл лигазы. Приготовьте мастер-микс для нескольких пластин и хорошо перемешайте перед нанесением в лунки.
   2. Добавьте 40 мкл раствора лигирования в каждую пластину и инкубируйте во влажной камере в течение 30 мин. при 37 ° C.
   3. Промойте ячейки 3x с буфером А, каждая в течение 2 минут, на наклонной платформе при RT.
   4. Приготовьте 40 мкл амплификационного раствора на чашку: 8 мкл (5x) амплификационного сырья + 31,5 мкл дистиллированной воды + 0,5 мкл ДНК-полимеразы. Подготовьте мастер-смесь для нескольких образцов и хорошо перемешайте перед нанесением в скважины.
   5. Добавьте 40 мкл амплификационного раствора в каждую пластину и инкубируйте во влажной камере при 37 ° C в течение 100 мин.
   6. Аспирируйте амплификационный раствор и промойте буфером B. Выполните 6 стирок каждый в течение 10 минут на наклонной платформе при RT.
   7. Промойте один раз с 0,01x буфером B в течение 1 мин при RT.
   8. Аспирировать буфер B и инкубировать планшеты с вторичными антителами, Alexa Fluor 488 анти-мышиный IgG и Alexa Fluor 568 анти-кроличий IgG в блокирующем растворе при соответствующих разведениях в блокирующем буфере, во влажной камере, в течение 30 мин при 37 ° C или ночью при 4 ° C.
   9. Трижды промойте ячейки с помощью PBS-T в течение 10 минут каждый на наклонной платформе при RT.
   10. Присощите PBS-T и установите в монтажную среду с помощью DAPI. Установленные пластины можно сразу же получить изображение или хранить при температуре 4 °C в темноте не более 4 дней перед визуализацией.

3. Визуализация и количественная оценка

1. Выполняйте визуализацию в эпифлуоресцентном или конфокальном микроскопе (если желательна 3D-визуализация, охватывайте не менее 3 мкм в 15 стеках). Проведите эксперименты в трех экземплярах и сфотографируйте достаточное количество полей, чтобы сделать не менее 100 наблюдений на образец или условие. Изображение всех полей и образцов, включая элементы управления, с одинаковыми настройками экспозиции.
2. Количественная оценка с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа изображений (см. Таблицу материалов для программного обеспечения с открытым исходным кодом и коммерческого программного обеспечения, способного выполнять этот анализ на одном или нескольких плоских изображениях).
   1. Ядра сегментных клеток основаны на окрашивании DAPI. Выполняйте обнаружение ядерных точек PLA. Назначьте точки PLA соответствующему ядру. Экспортируйте результаты PLA точек на ядро в виде CSV-файла (см. Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2).
3. Статистический анализ (см. Таблицу материалов для предлагаемого программного обеспечения с открытым исходным кодом и коммерческого программного обеспечения).
   1. Проверьте, соответствуют ли образцы нормальному распределению, с помощью теста Шапиро-Уилка.
   2. Определите, есть ли значимая разница между двумя выборками, используя критерий Стьюдента-t (если выполнено предположение о нормальном распределении) или критерий суммы рангов Уилкоксона (если допущение нормального распределения нарушено для выборки).
4. Визуализация данных: Создание точечных диаграмм в сочетании с блочными диаграммами для визуализации распределения данных, медианы (Q₂), 25-го (Q₁) и^{75-го процентиля} для различных выборок (см. Таблицу материалов для предлагаемого программного обеспечения с открытым исходным кодом и коммерческого программного обеспечения).

4.3D отображение pMCM2: взаимодействия ICL

1. Изображение пластин PLA на конфокальном микроскопе с вращающимся диском с использованием масляного объектива Plan Fluor 60x/1.25 с числовой апертурой. Приобретите 16 стеков размером 1,6 мм и создайте 3D-реконструкцию с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа изображений (см. Таблицу материалов).

Результаты

PLA Dig-TMP с белками-реплисомами
Структура Dig-TMP показана на рисунке 1. Детали синтеза, в котором триметилпсорален был конъюгирован через гликолевый линкер с дигоксигенином, обсуждались ранее^17,21. Инкубация клеток с соединением с пос...

Обсуждение

Хотя НОАК является очень мощным методом, существуют технические проблемы, которые необходимо решить, чтобы получить четкие и воспроизводимые результаты. Антитела должны обладать высоким сродством и специфичностью. Кроме того, важно максимально уменьшить количество неспецифических ф...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Invitrogen	A-10011	1 in 1000
35 mm plates with glass 1.5 coverslip	MatTek	P35-1.5-14-C	Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell
Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Invitrogen	A-10001	1 in 1000
Bovine serum albumin (BSA)	SeraCare	1900-0012	Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
CDC45 antibody (rabbit)	Abcam	ab126762	1 in 200
Cell adhesive	Life Science	354240	for cell-TAK solution
Confocal microscope	Nikkon	Nikon TE2000 spinning disk microscope	equiped with Volocity software
Digoxigenin (Dig) antibody (mouse)	Abcam	ab420	1 in 200
Dig-TMP	synthesized in the Seidman Lab
Duolink Amplification reagents (5×)	Sigma-Aldrich	DUO82010	reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ detection reagents	Sigma-Aldrich	DUO92007	reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004	anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
epifluorescent microscope	Zeiss	Axiovert 200M microscope	Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)
Formaldehyde 16%	Fisher Scientific	PI28906	for fix solution
Goat serum	Thermo	31873	Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
Image analysis software	open source	Cell profiler	works for analysis of single plane images
Image analysis software-license required	Bitplane	Imaris	Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions
Ligase (1 unit/μl)	Sigma-Aldrich	DUO82029	reagents need to be stored at -20 °C
Ligation reagent (5×)	Sigma-Aldrich	DUO82009	reagents need to be stored at -20 °C
MCM2 antibody (rabbit)	Abcam	ab4461	1 in 200
MCM5 antibody (rabbit monoclonal)	Abcam	Ab75975	1 in 1000
Methanol	Lab ALLEY	A2076	pre-cold at -20°C before use
phosphoMCM2S108 antibody (rabbit)	Abcam	ab109271	1 in 200
Polymerase (10 unit/μl)	Sigma-Aldrich	DUO82030	reagents need to be stored at -20 °C
Prolong gold mounting media with DAPI	ThermoFisher Scientific	P36935
PSF1 antibody (rabbit)	Abcam	ab181112	1 in 200
RNAse A 100 mg/ml	Qiagen	19101	reagents need to be stored at 4 °C
Statistical analysis and data visualization software	open source	R studio	ggplot2 package for generation of dot plot and box plots
Statistical analysis and data visualization software-license required	Systat Software	Sigmaplot V13
TMP (trioxalen)	Sigma-Aldrich	T6137_1G
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787_250ML
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416_100ML
UV box	Southern New England Ultraviolet		Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement
UV test Chamber	Opsytec	UV TEST CHAMBER BS-04
VE-821	Selleckchem	S8007	final concentrtion is 1µM