Visualisation de rencontres répliquantes avec une lésion bloquante marquée avec un antigène

Résumé

Alors que les collisions de fourche de réplication avec des adduits à ADN peuvent induire des cassures double brin, on en sait moins sur l’interaction entre les réplisomes et les lésions bloquantes. Nous avons utilisé le test de ligature de proximité pour visualiser ces rencontres et caractériser les conséquences pour la composition réplisomique.

Résumé

Des informations considérables sont présentes sur la réponse cellulaire aux cassures double brin (DSB), induites par les nucléases, les radiations et autres briseurs d’ADN. Cela s’explique en partie par la disponibilité de méthodes d’identification des sites de rupture et de caractérisation des facteurs recrutés dans les ORD à ces séquences. Cependant, les DSB apparaissent également comme intermédiaires lors du traitement des adduits à l’ADN formés par des composés qui ne provoquent pas directement de cassures et ne réagissent pas à des sites de séquence spécifiques. Par conséquent, pour la plupart de ces agents, les technologies qui permettent d’analyser les interactions de liaison avec les facteurs de réponse et les protéines de réparation sont inconnues. Par exemple, les liaisons croisées interbrins d’ADN (ICL) peuvent provoquer des ruptures à la suite de rencontres de fourche de réplication. Bien que formés par des médicaments largement utilisés comme agents chimiothérapeutiques contre le cancer, il n’existe aucune méthodologie pour surveiller leurs interactions avec les protéines de réplication.

Ici, nous décrivons notre stratégie pour suivre la réponse cellulaire aux collisions de fourche avec ces adduits difficiles. Nous avons lié un antigène stéroïdien au psoralène, qui forme des LCI dépendantes de la photoactivation dans les noyaux des cellules vivantes. Les ICL ont été visualisés par immunofluorescence contre l’étiquette de l’antigène. Le marqueur peut également être un partenaire dans le test de ligature de proximité (PLA) qui rapporte l’association étroite de deux antigènes. Le PLA a été exploité pour distinguer les protéines qui étaient étroitement associées aux ICL marquées de celles qui ne l’étaient pas. Il a été possible de définir les protéines réplisomes qui ont été retenues après des rencontres avec les ICL et d’identifier d’autres qui ont été perdues. Cette approche est applicable à toute structure ou adduit à ADN qui peut être détecté immunologiquement.

Introduction

La réponse cellulaire aux cassures double brin est bien documentée grâce à une succession de méthodes de plus en plus puissantes pour diriger les cassures vers des sites génomiques spécifiques ^1,2,3. La certitude de l’emplacement permet une caractérisation sans ambiguïté des protéines et d’autres facteurs qui s’accumulent sur le site et participent à la réponse aux dommages de l’ADN (DDR), conduisant ainsi les voies de jonction terminale non homologue (NHEJ) et de recombinaison homologue (HR) qui réparent les cassures. Bien sûr, de nombreuses cassures sont introduites par des agents tels que les radiations et les espèces chimiques qui n’attaquent pas des séquences spécifiques⁴. Cependant, pour ceux-ci, il existe des procédures disponibles qui peuvent convertir les extrémités en structures se prêtant au marquage et à la localisation ^5,6. Les cassures sont également introduites par des processus biologiques, tels que le réarrangement des immunoglobulines, et la technologie récente permet leur localisation, ainsi que⁷. La relation entre les facteurs de réponse et ces sites peut alors être déterminée.

Les cassures apparaissent également comme une conséquence indirecte des adduits formés par des composés qui ne sont pas des briseurs inhérents mais perturbent les transactions de l’ADN telles que la transcription et la réplication. Ils peuvent être formés comme une caractéristique de la réponse cellulaire à ces obstructions, peut-être pendant la réparation ou parce qu’ils provoquent une structure vulnérable à l’attaque de la nucléase. En règle générale, la relation physique entre l’adduit, la rupture et l’association avec les facteurs de réponse est inférentielle. Par exemple, les ICL sont formés par des agents chimiothérapeutiques tels que le cisplatine et la mitomycine^C8 et comme produit de réaction des sites abasiques⁹. Les ICL sont bien connus comme des blocs puissants pour les fourches de réplication¹⁰, bloquant ainsi les fourches qui peuvent être clivées par les nucléases¹¹. La liaison covalente entre les brins est souvent soulagée par des voies qui ont des ruptures obligatoires comme intermédiaires^12,13, nécessitant une recombinaison homologue pour reconstruire la fourche de réplication ¹⁴. Dans la plupart des expériences, l’investigateur suit la réponse des facteurs d’intérêt aux ruptures qui se forment en aval de la collision d’une fourche de réplication avec une ICL. Cependant, comme il n’y a pas eu de technologie pour localiser une lésion provocatrice, la proximité du réplisome et de ses composants avec la LMIC ne peut que supposer.

Nous avons développé une stratégie pour permettre l’analyse des associations protéiques avec des adduits covalents non spécifiques à la séquence, illustrée ici par les ICL. Dans notre système, ceux-ci sont introduits par le psoralène, un produit naturel photoactif utilisé depuis des milliers d’années comme thérapeutique pour les troubles cutanés¹⁵. Notre approche est basée sur deux caractéristiques importantes des psoralènes. Le premier est leur fréquence élevée de formation de réticulation, qui peut dépasser 90% des adduits, contrairement aux moins de 10% formés par des composés populaires tels que le cisplatine ou la mitomycine C ^8,16. La seconde est l’accessibilité du composé à la conjugaison sans perte de capacité de réticulation. Nous avons lié de manière covalente le triméthyl psoralène à la digoxigénine (Dig), un immunomarqueur établi de longue date. Cela permet la détection des adduits psoralènes dans l’ADN génomique par immunomarquage du marqueur Dig, et la visualisation par immunofluorescence conventionnelle¹⁷.

Ce réactif a été appliqué, dans nos travaux précédents, à l’analyse des rencontres de fourche de réplication avec des ICL à l’aide d’un test à base de fibres d’ADN¹⁶. Dans ce travail, nous avons constaté que la réplication pouvait se poursuivre au-delà d’une LMIC intacte. Cela dépendait de la kinase ATR, qui est activée par la contrainte de réplication. Le redémarrage de la réplication était inattendu compte tenu de la structure de l’hélicase réplicative CMG. Il s’agit de l’hétéro-hexamère MCM (M) qui forme un anneau décalé autour du brin modèle pour la synthèse du brin principal qui est verrouillé par les protéines du complexe GINS (G, constitué de PSF1, 2, 3 et SLD5) et CDC45 (C) ¹⁸. La proposition selon laquelle la réplication pourrait redémarrer du côté de la distale ICL du côté de la collision du replisome plaide en faveur d’un changement de la structure du réplisome. Pour répondre à la question de savoir quels composants étaient dans le réplisome au moment de la rencontre avec une ICL, nous avons développé l’approche décrite ici. Nous avons exploité l’étiquette Dig en tant que partenaire dans les tests de ligature de proximité (PLA)¹⁹ pour interroger l’association étroite de la LCI avec les protéines du réplisome²⁰.

Protocole

1. Préparation cellulaire

1. Jour 1
   1. Prétraiter les boîtes de culture à fond de verre de 35 mm avec une solution adhésive cellulaire.
   2. Cellules de plaque dans les plats prétraités un jour avant le traitement. La cellule doit se diviser activement et confluer à 50-70% le jour de l’expérience.
      NOTE: Les cellules HeLa ont été utilisées dans cette expérience avec Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, complété par 10% de sérum bovin fœtal, 1x pénicilline / streptomycine. Il n’y a pas de restriction pour les lignées cellulaires adhérentes. Cependant, les cellules non adhérentes doivent être centrifugées sur des lames et fixées avant l’analyse par PLA.
2. Jour 2
   1. Préparer une solution mère de digoxigénine triméthyl psoralène (Dig-TMP) en remettant en suspension une aliquote congelée de Dig-TMP préalablement synthétisé dans 1:1 EtOH:H 2O. Déterminer la concentration en mesurant OD à₂₅₀nm d’une dilution 100x (en_H2O) du Dig-TMP dissous. Le coefficient d’extinction de Dig-TMP est de 25 000. Vérifier la concentration en mesurant la DO à 250 nm avant chaque utilisation et calculer la concentration stock: Abs x 100 x 10⁶/25 000 = Concentration (en μM). Généralement, la solution mère est d’environ 3 mM. La solution peut être conservée à –20 °C pendant environ un mois.
      NOTE: Dig-TMP doit être synthétisé chimiquement à l’avance, en suivant la procédure décrite ici. Reflux 4'-chlorométhyl-4,5',8-triméthylpsoralène avec le 4,7,10-trioxa-1,13-tridécanedi-amine dans le toluène sous azote pendant 12 h. Prélever le solvant et récupérer le produit 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminométhyl-4,5',8-triméthylpsoralène par chromatographie sur gel de silice. Conjuguer le produit à l’ester de digoxigénine NHS dans du diméthylformamide et de la triéthylamine à 50 °C pendant 18 h. Éliminer le solvant et purifier le résidu par chromatographie sur gel de silice sur couche mince préparative. Éluer la bande de produits chloroforme: méthanol: hydroxyde d’ammonium à 28% (8:1:0,1) mélange. Évaporer les solvants et dissoudre la pastille dans 50% EtOH:_H2O.
   2. Ajouter le stock Dig-TMP dans 50% EtOH:H₂O au milieu de culture cellulaire jusqu’à une concentration finale de 5 μM. Porter le milieu à 37 °C. Aspirer le milieu des plaques, ajouter le milieu contenant du Dig-TMP préchauffé et placer les plaques dans un incubateur (37 °C, 5% CO₂) pendant 30 min pour permettre au Dig-TMP de s’équilibrer.
   3. Pendant l’incubation des cellules, préchauffer la boîte UV (voir le tableau des matériaux) à 37 °C.
   4. Placez les plaques dans la boîte UV préchauffée et exposez les cellules à une dose de 3 J/^cm2 de lumière UVA pendant 5 min pour cette expérience. Des plaques ont été placées sur un bloc thermique maintenu à 37 °C pendant l’irradiation. Calculez le temps à l’aide de la formule:
      
   5. Aspirer le milieu à l’aide d’une pipette, ajouter un milieu frais préchauffé et remettre les plaques dans l’incubateur à 37 °C, 5% de CO₂ pendant 1 h.
   6. Retirer le média et laver la vaisselle une fois doucement avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   7. Retirer le PBS et ajouter 0,1 % de formaldéhyde (FA) dans le PBS pendant 5 min à température ambiante (RT). Cela empêche le décollement cellulaire pendant le prétraitement CSK-R (tampon d’extraction du cytosquelette contenant de la RNase, décrit au point 1.2.9.) nécessaire pour extraire les éléments cytoplasmiques et réduire le fond de PLA.
   8. Aspirez l’AF et lavez la vaisselle avec PBS une fois.
   9. Ajouter le tampon CSK-R et incuber pendant 5 min à TA pour éliminer le cytoplasme [tampon CSK-R : 10 mM PIPES, pH 7,0, 100 mM NaCl, 300 mM saccharose, 3 mM MgCl₂, 0,5% Triton X-100, 300 μg/mL RNase A]. Aspirer le tampon, ajouter du CSK-R frais et incuber pendant 5 min à TA.
      REMARQUE: Un stock de tampon CSK peut être stocké à 4 ° C, et Triton X et RNaseA ajoutés juste avant utilisation.
   10. Laver avec PBS trois fois.
   11. Fixer les cellules avec 4% de formaldéhyde dans PBS pendant 10 min à TA.
   12. Lavez les cellules avec du PBS. Effectuez cette étape trois fois.
   13. Ajouter froid 100% méthanol et incuber pendant 20 min à -20 °C.
   14. Lavez les cellules avec du PBS trois fois. À ce stade, les cellules peuvent être stockées dans le PBS dans une chambre humide à 4 °C pendant une semaine maximum.
   15. Incuber les cellules dans 80 μL de TritonX-100 5 mM pendant 10 min à 4 °C.
   16. Incuber des cellules avec 100 μL d’EDTA 5 mM dans du PBS supplémenté avec 1 μL de RNase A à 100 mg/mL pendant 30 min à 37 °C.
   17. Lavez les cellules avec du PBS trois fois.
   18. Conserver les cellules dans un tampon de blocage (5 % de BSA et 10 % de sérum de chèvre dans du PBS) dans une chambre humide pendant une nuit à 4 °C.

2. Essai de ligature de proximité

REMARQUE: Effectuer un test de ligature de proximité le jour 3.

1. Coloration des anticorps
   1. Préparer 40 μL de la solution d’anticorps primaires par plaque: Ajouter le volume approprié d’anticorps primaires pour obtenir la dilution souhaitée (anticorps antidigoxigénine et anticorps de lapin de souris contre un composant réplisome tel que MCM5, CDC45, PSF1 ou pMCM2, dilutions spécifiées dans le tableau des matières) dans un tampon de blocage (pour atteindre un volume final de 24 μL). Mélanger en tapotant et laisser reposer pendant 20 minutes à TA. Préparer un mélange maître pour plusieurs échantillons et mélanger en tapant avant de l’appliquer sur les puits.
   2. Ajouter 40 μL de solution d’anticorps primaires au centre du puits et incuber dans une chambre humide pendant 1 h à 37 °C. Pendant la coloration, laissez les sondes PLA et le tampon de blocage se réchauffer à la température ambiante.
   3. Lavez les cellules avec PBS-T [PBS-T : 0,05 % Tween-20 dans 1X PBS] à RT. Effectuez cette étape trois fois.
   4. Pendant le lavage, préparer 40 μL de solution de sonde PLA par plat (les sondes PLA sont constituées d’un anticorps secondaire reconnaissant les IgG de lapin ou de souris, lié de manière covalente à un oligonucléotide PLUS ou MOINS) : 8 μL de sonde PLA anti souris-PLUS + 8 μL d’anticorps anti lapin-MOINS de sonde PLA + 24 μL de tampon bloquant. Mélanger et laisser reposer pendant 20 minutes à TA. Préparer un mélange maître pour plusieurs échantillons et bien mélanger avant de l’appliquer sur les puits. Placez la solution au milieu du puits dans l’assiette.
   5. Retirer le dernier lavage, ajouter 40 μL de solution de sonde PLA au centre du puits et incuber dans une chambre humide pendant 1 h à 37 °C.
   6. Laver trois fois dans un tampon A pendant 10 minutes chacun, sur une plate-forme basculante à RT. Pendant le lavage, apportez le mélange de ligature à RT.
2. Ligature et amplification
   1. Préparer 40 μL de mélange de ligature par plaque: 8 μL (5x) de papier de ligature + 31 μL d’eau distillée + 1 μL de ligase. Préparer le mélange principal pour plusieurs plaques et bien mélanger avant de l’appliquer sur les puits.
   2. Ajouter 40 μL de solution de ligature dans chaque plaque et incuber dans une chambre humide pendant 30 min. à 37 °C.
   3. Laver les cellules 3x avec le tampon A, chacune pendant 2 min, sur une plate-forme basculante à RT.
   4. Préparer 40 μL de solution d’amplification par boîte: 8 μL (5x) de stock d’amplification + 31,5 μL d’eau distillée + 0,5 μL d’ADN polymérase. Préparer un mélange maître pour plusieurs échantillons et bien mélanger avant de l’appliquer sur les puits.
   5. Ajouter 40 μL de solution d’amplification à chaque plaque et incuber dans une chambre humide à 37 °C pendant 100 min.
   6. Aspirer la solution d’amplification et laver avec le tampon B. Effectuer 6 lavages chacun pendant 10 min, sur une plate-forme basculante à RT.
   7. Laver une fois avec 0,01x tampon B pendant 1 min à TA.
   8. Aspirer le tampon B et les plaques d’incubation avec des anticorps secondaires, Alexa Fluor 488 anti-souris IgG et Alexa Fluor 568 anti-lapin IgG en solution de blocage à des dilutions appropriées dans un tampon de blocage, dans une chambre humide, pendant 30 min à 37 °C ou pendant une nuit à 4 °C.
   9. Lavez les cellules trois fois avec PBS-T, pendant 10 minutes chacune sur une plate-forme basculante à RT.
   10. Aspirer PBS-T et monter dans le support de montage avec DAPI. Les plaques montées peuvent être imagées immédiatement ou stockées à 4 °C dans l’obscurité pendant 4 jours au maximum avant l’imagerie.

3. Imagerie et quantification

1. Effectuer l’imagerie dans un microscope épifluorescent ou confocale (si l’imagerie 3D est souhaitable, couvrir au moins 3 μm dans 15 piles). Effectuer des expériences en trois exemplaires et imager suffisamment de champs pour faire au moins 100 observations par échantillon ou condition. Imagez tous les champs et échantillons, y compris les contrôles, en utilisant les mêmes paramètres d’exposition.
2. Quantifier à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images approprié (voir le tableau des matériaux pour les logiciels open source et commerciaux capables d’effectuer cette analyse dans des images à plan unique ou multiple).
   1. Segmenter les noyaux cellulaires en fonction de la coloration DAPI. Effectuer la détection des points PLA nucléaires. Attribuez des points PLA à leur noyau correspondant. Exportez les points PLA par noyau sous forme de fichier csv (voir Fichier supplémentaire 1 et Fichier supplémentaire 2).
3. Analyse statistique (voir le tableau des matériaux pour les logiciels libres et commerciaux suggérés).
   1. Vérifiez si les échantillons suivent une distribution normale avec un test de Shapiro-Wilk.
   2. Déterminer s’il y a une différence significative entre deux échantillons à l’aide d’un test de Student-t (si l’hypothèse de distribution normale est respectée) ou d’un test de somme de Wilcoxon (si l’hypothèse de distribution normale est violée pour un échantillon).
4. Visualisation des données : Générez des diagrammes à points combinés à des diagrammes en boîte pour visualiser la distribution des données, la médiane (Q₂), le 25e (Q₁) et le 75e^percentile pour les différents^{échantillons (voir} le tableau des matériaux pour les logiciels open source et commerciaux suggérés).

4.3D affichage de pMCM2 : interactions ICL

1. Imagez des plaques PLA sur un microscope confocal à disque rotatif, à l’aide d’un objectif d’huile à ouverture numérique Plan Fluor 60x/1,25. Acquérir 16 piles couvrant 1,6 mm et générer la reconstruction 3D avec le logiciel d’analyse d’images approprié (voir Tableau des matériaux).

Résultats

PLA de Dig-TMP avec des protéines réplisomes
La structure du Dig-TMP est illustrée à la figure 1. Les détails de la synthèse, dans laquelle le triméthyl psoralène a été conjugué par un agent de liaison du glycol à la digoxigénine, ont été discutés précédemment^17,21. L’incubation des cellules avec le composé suivie d’une exposition à une lumière de 365 nm (UVA) photoactive le composé et en...

Discussion

Bien que le PLA soit une technique très puissante, il existe des problèmes techniques qui doivent être résolus afin d’obtenir des résultats clairs et reproductibles. Les anticorps doivent être de haute affinité et spécificité. En outre, il est important de réduire autant que possible les signaux de fond non spécifiques. Nous avons constaté que les membranes et les débris cellulaires contribuent à l’arrière-plan, et nous les avons enlevés autant que possible. Les lavages avec des tampons contenant du d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Invitrogen	A-10011	1 in 1000
35 mm plates with glass 1.5 coverslip	MatTek	P35-1.5-14-C	Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell
Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Invitrogen	A-10001	1 in 1000
Bovine serum albumin (BSA)	SeraCare	1900-0012	Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
CDC45 antibody (rabbit)	Abcam	ab126762	1 in 200
Cell adhesive	Life Science	354240	for cell-TAK solution
Confocal microscope	Nikkon	Nikon TE2000 spinning disk microscope	equiped with Volocity software
Digoxigenin (Dig) antibody (mouse)	Abcam	ab420	1 in 200
Dig-TMP	synthesized in the Seidman Lab
Duolink Amplification reagents (5×)	Sigma-Aldrich	DUO82010	reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ detection reagents	Sigma-Aldrich	DUO92007	reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004	anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
epifluorescent microscope	Zeiss	Axiovert 200M microscope	Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)
Formaldehyde 16%	Fisher Scientific	PI28906	for fix solution
Goat serum	Thermo	31873	Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
Image analysis software	open source	Cell profiler	works for analysis of single plane images
Image analysis software-license required	Bitplane	Imaris	Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions
Ligase (1 unit/μl)	Sigma-Aldrich	DUO82029	reagents need to be stored at -20 °C
Ligation reagent (5×)	Sigma-Aldrich	DUO82009	reagents need to be stored at -20 °C
MCM2 antibody (rabbit)	Abcam	ab4461	1 in 200
MCM5 antibody (rabbit monoclonal)	Abcam	Ab75975	1 in 1000
Methanol	Lab ALLEY	A2076	pre-cold at -20°C before use
phosphoMCM2S108 antibody (rabbit)	Abcam	ab109271	1 in 200
Polymerase (10 unit/μl)	Sigma-Aldrich	DUO82030	reagents need to be stored at -20 °C
Prolong gold mounting media with DAPI	ThermoFisher Scientific	P36935
PSF1 antibody (rabbit)	Abcam	ab181112	1 in 200
RNAse A 100 mg/ml	Qiagen	19101	reagents need to be stored at 4 °C
Statistical analysis and data visualization software	open source	R studio	ggplot2 package for generation of dot plot and box plots
Statistical analysis and data visualization software-license required	Systat Software	Sigmaplot V13
TMP (trioxalen)	Sigma-Aldrich	T6137_1G
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787_250ML
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416_100ML
UV box	Southern New England Ultraviolet		Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement
UV test Chamber	Opsytec	UV TEST CHAMBER BS-04
VE-821	Selleckchem	S8007	final concentrtion is 1µM