Fetal ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Türevi Oligodendrosit Öncül Hücre Kültürlerinin Yüksek İçerik tarama farklılaşması ve olgunlaşma analizi

Özet

Olgun oligodendrositlere dönüşen fetal veya yetişkin nöral kök hücrelerden elde edilen astrositlerin ve oligodendrosit öncül hücrelerin karma kültürlerinin üretimini ve zararlı uyaranların in vitro modellemesini anlatıyoruz. Hücre tabanlı yüksek içerikli tarama tekniği ile bağlantı, güvenilir ve sağlam bir ilaç tarama sistemi oluşturur.

Özet

Karmaşık hastalıklarda terapötik stratejilerin etkinliğini değerlendirmek için ilaç tarama tekniklerinin geliştirilmesindeki temel engel, in vitro basitleştirme ve karmaşık in vivo ortamını yeniden oluşturma ile tüm tarama stratejileri tarafından paylaşılan, sağlam ve güvenilir veriler elde etme, in vivo çeviri için son derece tahmine dayalı ana amaç arasında bir denge oluşturmaktır.

Demyelinize edici hastalıklar alanında, ilaç tarama stratejilerinin çoğu, yenidoğan hayvanlardan izole edilmiş primer oligodendrosit öncül hücrelerinin (OPC) ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına veya saf kültürlerine dayanmaktadır ve yaşa bağlı farklılıkların olmaması ve herhangi bir gerçek patolojik durum veya karmaşıklık nedeniyle güçlü önyargılara yol açmaktadır.

Burada, demiyelinasyon hastalıklarının tipik patolojik durumlarını taklit etmek için kolayca manipüle edilen nöral kök hücre (NSC) türevi OPC'lerin fizyolojik farklılaşmasını / olgunlaşmasını modellemeyi amaçlayan bir in vitro sistemin kurulumunu gösteriyoruz. Ayrıca, yöntem fetal ve yetişkin beyinlerinden izolasyonu içerir ve Astrositleri de içeren spontan bir ortak kültürde OPC'lerden olgun oligodendrositlere (OL' ler) dinamik olarak farklılaşan bir sistem verir. Bu model fizyolojik olarak tiroid hormon aracılı miyelinasyon ve miyelin onarım sürecine benzer ve hastalık mekanizmalarını model alan patolojik interferanların eklenmesini sağlar. Demiyelinasyon hastalıklarının iki ana bileşenini (yani hipoksi/ iskemi ve inflamasyon), gelişimsel miyelinasyon ve yetişkin miyelin onarımı üzerindeki etkilerini yeniden yaratmayı ve OPC'leri ayırt etmeye odaklanırken sistemin tüm hücre bileşenlerini dikkate almayı gösteriyoruz.

Bu spontan karma model, hücre tabanlı yüksek içerikli tarama teknolojileriyle birleştiğinde, demyelinasyonda yer alan patolojik süreçlerle mücadele etmeyi ve remyelinasyonu teşvik etmeyi amaçlayan terapötik stratejiler için sağlam ve güvenilir bir ilaç tarama sisteminin geliştirilmesini sağlar.

Giriş

Merkezi sinir sisteminde (CNS), miyelin oluşturan hücreler (oligodendrositler, OL'ler) ve öncülleri (oligodendrosit öncül hücreler, OPC'ler) gelişimsel miyelinasyondan, peri ve doğum sonrası dönemlerde meydana gelen bir süreçten ve yetişkinlikte miyelin ciro ve onarımından (remiyelinasyon) sorumludur^1. Bu hücreler son derece uzmanlaşmıştır, anatomik ve fonksiyonel olarak diğer tüm glial ve nöronal bileşenlerle etkileşime girer ve bu da onları CNS yapısının ve işlevinin temel bir parçası haline getirir.

Demiyelinerasyon olayları farklı CNS yaralanmaları ve hastalıkları²'de yer almaktadır ve esas olarak hem gelişim hem de yetişkinlik döneminde çok yönlü mekanizmalar yoluyla OPC'ler ve OL'ler üzerinde hareket eder. Farklılaşmamış öncüller, başta tiroid hormonu (TH) olmak üzere farklılaşan faktörler tarafından yönlendirilir, senkronize bir işlem^3'te, OPC'nin çoğalmaya, miyelinlenmemiş aksona göçe ve miyelin kılıtını geliştiren olgun OL'lere farklılaşmaya neden olan belirli uyaranları tanımasına ve yanıt vermesine neden olur⁴. Tüm bu işlemler ince bir şekilde kontrol edilir ve karmaşık bir ortamda gerçekleşir.

Miyelinasyon, remiyelinasyon ve demiyelinasyon olaylarının karmaşık doğası nedeniyle, temel mekanizmaları incelemek ve ana hücresel oynatıcıya odaklanarak yeni terapötik stratejiler geliştirmek için basitleştirilmiş ve güvenilir bir in vitro yönteme büyük ihtiyaç vardır: OPC⁵.

Bir in vitro sistemin güvenilir olması için bir dizi faktörün dikkate alınması gerekir: hücresel ortamın karmaşıklığı, yaşa bağlı hücre içsel farklılıklar, fizyolojik TH aracılı farklılaşma, patolojik mekanizmalar ve verilerin sağlamlığı⁶. Gerçekten de, alandaki karşılanmamış ihtiyaç, in vivo durumun karmaşıklığını taklit eden, izole saf OPC kültürlerinin kullanımıyla başarıyla elde edilmeyen bir modeldir. Ek olarak, demiyelinasyon olaylarının iki ana bileşeni olan inflamasyon ve hipoksi/iskemi (HI), aşırı basitleştirilmiş in vitro modellerde çalışılamayan bir yön olan OPC'lerin fizyolojik farklılaşmasını ve olgunlaşmasını dolaylı olarak etkileyebilecek diğer hücre bileşenlerini doğrudan içerir.

Son derece tahmine dayalı bir kültür sisteminden başlayarak, sonraki ve daha genel zorluk sağlam ve güvenilir verilerin üretilmesidir. Bu bağlamda, hücre tabanlı yüksek içerikli tarama (HCS) en uygun^{tekniktir 7}, çünkü amacımız öncelikle tüm kültürü otomatik bir iş akışında analiz etmek, temsili alanlar seçme önyargısını önlemek ve ikincisi görüntüleme tabanlı yüksek içerikli verilerin otomatik ve eşzamanlı neslini elde^{etmektir 8}.

Temel ihtiyacın in vitro basitleştirme ve in vivo taklit karmaşıklık arasında en iyi dengeyi sağlamak olduğu göz önüne alındığında, burada fetal forebrandan ve yetişkin alt ventrikül bölgesinden (SVZ) izole edilmiş sinirsel kök hücrelerden (NSC' ler) elde edilen OPC'leri elde etmek için oldukça tekrarlanabilir bir yöntem sunuyoruz. Bu in vitro model, çok güçlü NSC'den olgun/miyelinasyon ol'a kadar tüm OPC farklılaşma sürecini fizyolojik TH'ye bağımlı bir şekilde kapsar. Ortaya çıkan kültür, dinamik olarak farklılaşan/olgunlaşan bir sistemdir ve bu da esas olarak nöronların düşük bir yüzdesiyle, farklılaşan OPC'ler ve astrositlerden oluşan spontan bir ortak kültürle sonuçlanır. Bu birincil kültür karmaşık in vivo ortamı daha iyi taklit ederken, kök hücre türetme, istenen hücre soy zenginleştirmesini elde etmek için basit manipülasyonların yapılmasına izin verir.

Hücre hatlarını veya birincil OPC'lerin saf kültürlerini kullanan diğer ilaç tarama stratejilerinin aksine, burada açıklanan yöntem, patolojik interferentlerin veya terapötik moleküllerin karmaşık bir ortamda, istenen hücre tipine odaklanmayı kaybetmeden etkisinin araştırılmasına izin verir. Açıklanan HCS iş akışı, hücre canlılığı ve soy spesifikasyonunun yanı sıra soyuna özgü hücre ölümü ve morfolojik parametrelerin analizine izin sağlar.

Protokol

Burada açıklanan tüm hayvan protokolleri Avrupa Toplum Konseyi Direktiflerine (86/609/EEC) göre gerçekleştirilmiştir ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndayayınlanan yönergelere uygundur.

1. Çözümler ve reaktifler

1. Standart ortamı hazırlayın: DMEM/F12 GlutaMAX 1x; 8 mmol/L HEPES; 100 U/100 μg Penisilin/Streptomisiin (%1 P/S); 1x B27; 1x N-2.
2. Nörosfer ortamını hazırlayın: 10 ng/mL bFGF ekleyin; 10 ng/mL EGF'den standart ortama.
3. Oligosfer/OPC ortamı hazırlayın: 10 ng/mL bFGF ekleyin; Standart ortama 10 ng/mL PDGF-AA.
4. Oligodendroctye farklılaşma ortamını hazırlayın: 50 nM T3 ekleyin; 10 ng/mL CNTF; 1x N-asetil-L-sistein (NAC) standart ortama.
5. Enzmatik olmayan ayrışma tamponu hazırlayın: Enzmatik olmayan ayrışma tamponu için %1 P/S ekleyin ve buzları soğuk tutun.
6. Sakkaroz çözeltisi hazırlayın: HBSS, 0.3 g/mL sakkaroz.
7. BSA yıkama solüsyonu hazırlayın: EBSS, 40 mg/mL BSA, 0.02 mL/l HEPES.
8. Enzymatic dissosiyatif tampon hazırlayın: HBSS, 5.4 mg/mL D-glikoz, 15 mmol/L HEPES, 1.33 mg/mL Tripsin, 0.7 mg/mL Hyaluronidaz, 80 U/mL DNase.
9. Sitokin karışımı hazırlayın: TGF-β1, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17 ve IFN-γ (her biri 20 ng/mL).
10. Sitokin karışımı aracı hazırlayın: stokun% 0.04'ü (10% gliserol / 100 nM glisin / 25 nM Tris, pH 7.3).
11. Oksijen-glukoz yoksunluğu ortamını hazırlayın: DMEM w/o glikoz kullanarak standart ortam. İstenen glikoz yoksunluğu durumunun sıkılığına bağlı olarak, glikozla ilgili bileşiklerden kaçınmak için orta alandan B27 ve/veya N2'yi de çıkarmak mümkündür (örneğin, B27'de D-Galaktoz).

2. Diseksiyon ve NSC yalıtımı

NOT: Fetal ve erişkin NSC'ler, değişikliklerle Ahlenius ve Kokaia protokolü 9'u izleyerek E13.5 fetal forebrain veya^2.5 aylık yetişkin alt-ventrikül bölgesinden (SVZ) izole edildi.

1. Fetal NSC kültürleri
   NOT: Diseksiyonlara başlamadan önce, her biri 150 μL enzmatik olmayan ayrışma tamponu içeren 1,5 mL tüpler hazırlayın; Petri tabaklarını temizleyin ve buz gibi HBSS ekleyin.
   1. Embriyoları zamanlanmış hamile farelerden E13.5 - 14.5'te toplayın ve soğuk HBSS içeren bir Petri kabına yerleştirin.
   2. Yabanarı kullanarak embriyoların kafasını koparın.
   3. Embriyoların kafalarını buz gibi soğuk PBS içeren temiz bir Petri kabına yerleştirin ve büyüteç veya stereoskop kullanarak deriyi kafatasından çıkardı.
   4. Beyin görülüp deriden temizlendikten sonra, yanlaraps ile basınç uygulayarak sıkın.
   5. Beyincikleri çıkarın, sadece beyinleri tutun ve menenjitleri forsepsle çıkarın.
   6. İzole edilmiş dokuyu enzmatik olmayan ayrışma tamponuna yerleştirin ve diseksiyon adımlarını diğer embriyolarla tekrarlayın. 2-3 hayvandan gelen dokuyu tamponu içeren her tüpe yerleştirin.
   7. Sürekli sallanarak 15 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatır.
   8. Kuluçkadan sonra, 850 μL standart ortam ekleyin ve süspansiyon kümelerden arınana kadar pipetleme yaparak karıştırın.
   9. Ayrışmayan doku hala görünür durumdaysa, tüpün dibinde birikine kadar RT'de 2 dakika bekleyin.
   10. Ayrışma tamamlandığında, hücreleri sayın ve hücre yapışıklığından kaçınmak için dikey konumda tutulan 10-30 mL nörosfer ortamı içeren bir T-25 veya T-45 şişesinde 10-50 hücre/μL yoğunluğunda süspansiyona yerleştirin.
2. Yetişkin NSC kültürleri
   1. Servikal çıkık ile hayvanları kurban edin.
   2. Buz gibi HBSS içeren 50 mL'lik bir tüpte 4-5 fareden beyin toplayın.
   3. Beyni soğuk steril bir yüzeye yerleştirin. Bu amaçla, suyla doldurulmuş ve gece boyunca -20 °C'ye yerleştirilmiş bir T-25 şişesi kullanın. Deney anında, şişeyi steril alüminyum folyo ile örtün.
   4. Beyin ventral tarafını aşağı doğru, rostro-kaudal yönde yerleştirin ve bir jilet kullanarak koku ampullerini çıkarın.
   5. Jilet kullanarak, korteksten optik chiasma'ya kadar 1 mm kalınlığında 2-3 koronal dilim kesin.
   6. Dilimleri soğuk yüzeye ventro-dorsal bir konuma yerleştirin ve korpus callosum ve iki lateral ventrikülleri tanımlayın.
   7. Büyüteç veya stereoskop kullanarak, korpus callosum parçalarını taşımamaya dikkat ederek lateral ventriküllerin duvarlarını izole edin.
   8. İzole dokuyu enzimamatik ayrışma tamponuna (5-10 mL) koyun ve 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
   9. Çözeltiyi karıştırın, birkaç kez borulayın (en az 50) ve 10 dakika boyunca 37 °C'de tekrar kuluçkaya yatırın.
   10. 5 mL standart kültür ortamı ekleyerek tripsinleri nötralize edin ve çözeltiyi 70 μm filtre kullanarak filtreleyin.
   11. Filtrelenmiş çözeltiyi 400 x g'da5 dakika santrifüjleyin.
   12. Pelezi sakkaroz çözeltisinde ve santrifüjde 500 x g'da 10 dakika boyunca yeniden kullanın.
   13. Peletin BSA yıkama çözeltisinde ve santrifüjde 400 x g'da 7 dakika boyunca yeniden kullanın.
   14. Peletin standart kültür ortamında yeniden süzme, hücreleri sayma ve yukarıda açıklandığı gibi kaplama gerçekleştirme (adım 2.1.10).

3. Birincil nörosferler

1. Her 2 günde bir büyüme faktörlerini (bFGF/EGF) ekleyin.
2. Her 4-6 günde bir (hücre yoğunluğuna bağlı olarak), ortamın yarısını aşağıdaki gibi değiştirin:
   1. Tüm hücre süspansiyonu 15 veya 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
   2. 400 x g'da5 dakika santrifüj.
   3. Birimin yarısını çıkarın.
   4. Aynı miktarda taze ortam ekleyin, pipetleme ile hafifçe karıştırın ve büyüme faktörleri ekleyin.

4. Oligosferler

NOT: Oligodendrosit farklılaşması Chen protokolü^10'u takiben değişikliklerle gerçekleştirilir.

1. Nörosferler 100-150 μm çapa ulaştığında geçirilmeye hazırdır. Bunu yapmak için, tüm hücre süspansiyonu 15 veya 50 mL tüpe aktarın ve 400 x g'da5 dakika santrifüj yapın.
   1. Ters iletilen ışık mikroskobu kullanarak kürelerin fotoğraflarını çekerek ve ImageJ yazılımı ile açarak çapı hızla değerlendirin.
   2. Çözümle menüsünü tıklatın ve Araçlar penceresinde Ölçek çubuğu 'nuseçin.
   3. Mikron cinsinden Genişlik olarak 150 μm ayarlayın ve ölçek çubuğunu kürelerle karşılaştırın.
2. Ters çevrilerek tüm hacmi çıkarın ve peletin 180 μL taze standart kültür ortamında yeniden diriltmesi. Pipet 50 kez kürelerin parçalanmasına izin vermek için.
3. 810 μL taze standart kültür ortamı ekleyin, hücreleri sayın ve nörosferler için açıklandığı gibi yeniden plakalayın.
4. Her 2 günde bir bFGF/PDGF-AA 10 ng/mL ekleyin.
5. Her 4-6 günde bir (hücre yoğunluğuna bağlı olarak), ortamın yarısını aşağıdaki gibi değiştirin:
6. Tüm hücre süspansiyonu 15 veya 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
7. 400 x g'da5 dakika santrifüj.
8. Birimin yarısını çıkarın.
9. Aynı miktarda taze ortam ekleyin, pipetleme ile hafifçe karıştırın ve büyüme faktörleri ekleyin.

5. Plaka kaplaması

1. Poli-D, L-ornit/laminin kaplama: OPC'leri kaplamadan en az 2 gün önce, PBS'de seyreltilmiş 50 μg/mL poli-D, L-ornit çözeltisini her kuyuya (96 kuyu plakası için 40 μL/ kuyu) ekleyin ve bir gecede RT'de kuluçkaya yatın.
2. Ertesi gün, sıvıyı çıkarın ve damıtılmış steril su ile üç kez yıkayın.
3. Tabakları rt'de bir gecede kurutun. Ertesi gün, PBS'de seyreltilmiş bir laminin çözeltisi ekleyin (5 μg / mL; 96 kuyu plakaları için 40 μL / kuyu) ve 37 ° C'de 2 saat kuluçkaya yatın.

6. Hücre tohumlama

1. Oligosferler 100-150 μm çapa ulaştığında, poli-D, L-ornitin / lamine kaplı plakalarda ayrıştırılmaya ve tohum edilmeye hazırdır. Bunu yapmak için, tüm hücre süspansiyonu 15 veya 50 mL tüpe aktarın ve 400 x g'da 5 dakika santrifüj yapın (adım 4.1'de belirtildiği gibi)
2. Ters çevrilerek tüm hacmi çıkarın ve peletin 180 μL taze standart kültür ortamında yeniden diriltmesi. Pipet 50 kez kürelerin parçalanmasına izin vermek için.
3. 810 μL taze standart kültür ortamı ekleyin ve hücreleri sayın.
4. Laminin çözeltisini kuyulardan çıkarın ve hücreleri 3.000 hücre/cm² yoğunlukta (96 kuyu plakası için 100 μL/kuyu) plakalayın.

7. OPC farklılaşma indüksiyonu

1. 3 gün sonra, tüm ortamı çıkarın ve aynı hacimde oligodendrosit farklılaşma ortamını ekleyin.
2. Ortamın yarısını her 4 günde bir değiştirin ve her 2 günde bir taze farklılaşma karışımı (T3/CNTF/NAC) ekleyin.

8. İnflamasyon aracılı farklılaşma bloğunun indüksiyonu

1. Nörosfer ayrışması ve oligosfer üretiminden sonra (bölüm 4), sitokin karışımını kültür ortamına ekleyin ve tüm küre oluşumu adımı için sitokinlere maruz kalan oligosferleri tutun.
   NOT: Hacim hücre sayısına bağlıdır, çünkü hücre oluşturan küreler için 10-50 hücre / μL'de tohumlanır.
2. Ortamın değiştirilmesi gerekiyorsa, tüm hacmi değiştirin ve sitokin karışımını bir kez daha ekleyin.

9. Oksijen-glukoz yoksunluğu hücre ölümünün indüksiyonu

1. -1 DIV'de (çok katlı plakalarda hücre tohumlanından 2 gün sonra), ortamı çıkarın ve yeni bir çok katlı plakada saklayın.
2. OGD-medium (OGD grubu) veya taze orta (kontrol grubu) hacminin yarısını (96 kuyu plakası için 50 μL) ekleyin. Yarım hacim, sıvı ve hava arasındaki oksijen alışverişini azaltmak için kullanılır.
3. OGD grup kültürlerini% 95 N 2 ve% 5 CO₂ ile doymuş hava geçirmez bir hipoksi odasına_{yerleştirin.} Haznenin doygunluğunu elde etmek için, oda borularını kapatmadan önce gaz karışımının 25 l / dak'ta 6 dakika akmasına izin verin.
4. Hipoksik odayı inkübatörde 3 saat kuluçkaya yatırın. 9.1. adımda çıkarılan ve muhafaza edilen ortamı içeren kontrol grubu ve plakalar da inkübatörde bırakılmalıdır.
5. Glikozsuz (OGD grubu) veya yeni ortamı (kontrol grubu) çıkarın ve 9.1.

10. İmmünosyatokinoloji

1. İstenilen zaman noktasında, rt'de 20 dakika boyunca soğuk% 4 paraformaldehit ile hücreleri sabitleyin.
2. PBS ile iki kez yıkayın (RT'deki her yıkama için 10 dakika kuluçka).
3. Engelleme çözümü ile RT'de 1 saat kuluçkaya yatırın (PBS Triton% 0.3% 1 BSA ve% 1 eşek / keçi normal serum içerir).
4. PBStriton%0.3oranında seyreltilmiş primer antikor karışımı ( Tablo 1) ile kuluçkaya yatırın, bir gecede 4 °C'de.
5. PBS ile iki kez yıkayın (RT'deki her yıkama için 10 dakika kuluçka).
6. PBS tritonunda seyreltilmiş ikincil antikor (Tablo 1) çözeltisi ile inkübte edin% 0.3 hoechst 33258 ekleyerek 37 °C'de 30 dakika.
7. PBS ile iki kez yıkayın (RT'deki her yıkama için 10 dakika kuluçka).

11. Hücre canlılığının, soy bileşiminin ve soyuna özgü hücre ölümünün HCS analizi

NOT: HCS temsili görüntüleri ve iş akışı Şekil 2A,B'de gösterilmiştir.

1. Yazılımın ana menüsünden Bölümlere Ayırıcı Analiz algoritmasını seçin (HCS Studio v 6.6.0) ve Ana menüden Test /Tarama Plakası Geliştir 'iseçin.
2. iDev penceresinde, Yeni'yi seçin ve ardından Test Geliştir şablonundan Genel yoğunluk Ölçüm Aracı'nı seçin.
3. 10x hedefini seçerek menünün sağ tarafındaki Oluştur'a tıklayın.
4. Bu, Devralmayı Yapılandır menüsünü açar. Bu pencerede aşağıdaki parametreleri seçin: (a) kanal sayısı: Hoechst nükleer boyama (BGRFR_386) için ilk ve reaksiyonda kullanılan her soylara özgü işaretleyici için bir tane (b) kanal 1'deki yazılım odağını ve otomatik odaklama aralığını 1 (c) olarak seçin.
5. Edinme menüsünden, farklı kuyulardaki ve farklı alanlardaki boyamanın kalitesine bakın ve menüde Sabit Pozlama Süresi'ni seçerek pozlama süresini manuel olarak seçin.
6. Alma parametreleri ayarlandıktan sonra, menünün üst kısmında Mini Tarama'yı seçin ve deneysel durum başına iki kuyuda kuyu başına on alan seçin. Bu, tüm plaka için bir alan alt kümesindeki tüm analiz parametresinin kurulmasına izin verir.
7. Mini tarama tamamlandığında, çözümleme algoritmasını yapılandırmak için Tahlil Parametresini Yapılandır'ı tıklatın.
8. Pencerenin sağ tarafındaki Grupları Yapılandır'a tıklayın ve mini taramanın kuyularını sürükleyip bırakın. Farklı grupları yapılandırmak için Gruplar alt bölümündeki Ekle düğmesini tıklatın.
9. Tüm algoritmayı geliştirmek için pencerenin sol tarafındaki iş akışını adım adım izleyin. Önce her kanal için Görüntüyü İşle'yi seçin ve Arka Plan Kaldırma'ya ve istediğiniz seviyeye tıklayın.
10. Önce çekirdekleri nükleer lekeleme ile tanımlayın ve seçin. Gerçek çekirdeği seçmek ve yapıt ve döküntüleri analiz etmekten kaçınmak için Birincil Nesneyi Tanımla – Kanal 1'e tıklayın. Bu amaçla, nükleer lekelemenin temsili bir resmini yakınlaştırın ve çekirdeğin yazılım tarafından inşa edilen çevre tarafından iyi çevrili olup olmadığını kontrol edin. Eşik değerini değiştirmek ve tek çekirdeği daha iyi tanımlamak için segmentasyon algoritmaları uygulamak mümkündür.
11. Çekirdek doğru tanımlandıktan sonra, aşağıdaki adımı tıklatın: Birincil Nesneyi Doğrula. Her alan görüntüsünün kenarlığındaki çekirdeklerin analizini önlemek için Object.BorderObject.Ch1 öğesini seçin. Object.Area.Ch1 öğesini seçin ve histogramlardaki "düşük" ve "yüksek" çubukları taşıyarak, tanımlanan tüm kalıntıları veya toplamalara veya eserlere karşılık gelen büyük nesneleri kaldırın.
12. Seçilen parametrelerin hepsine uyduğundan emin olmak için tüm deneysel koşulların tüm mini tarama temsilcisi görüntülerini kontrol edin.
13. Belirli soy işaretçilerine karşılık gelen her kanal için Noktaları Tanımla'ya tıklayın ve Halka değerlerini seçin: Genişlik = 3 ve Mesafe = 0. Bu, sitoplazmatik floresanların tanımlanmasını sağlayacaktır. Hücre yoğunluğuna göre bu değerler uyarlanabilir. Yazılım, bitişik halkalar arasında çakışmayı otomatik olarak önler.
14. Analizi oluşturmak için iş akışında Başvuru Düzeyleri'ni seçin. Referans seviyelerinin ayarlanması, nükleer boyuta ve nükleer boyama yoğunluğuna ve Halka tarafından tanımlanan sitoplazmatik floresanlara dayanan belirli işaret pozitif hücrelerin yoğunlaştırılmış çekirdeklerin otomatik olarak sayılmasına izin verecektir.
15. Önce Object.Area.Ch1'i tıklatın. Mini tarama görüntülerinde, yoğunlaştırılmış bir çekirdek seçin ve bu boyutun altındaki tüm çekirdekleri "yoğunlaştırılmış" olarak seçmek için histogramlardaki "DÜŞÜK" çubuğunu hareket ettinin.
16. Object.AvgIntensity.Ch1üzerine tıklayın. Mini tarama görüntülerinde, yoğunlaştırılmış bir çekirdek seçin ve bu floresan yoğunluğunun üzerindeki tüm çekirdekleri "yoğunlaştırılmış" olarak seçmek için histogramlardaki "YÜKSEK" çubuğu hareket ettinin.
17. Her bir soy kanalı için Object.RingAvgIntensity'ye tıklayın. Mini tarama görüntülerinizde pozitif bir hücre seçin ve bu floresan yoğunluğunun üzerindeki tüm hücreleri "pozitif" olarak seçmek için histogramlardaki "YÜKSEK" çubuğu hareket ettinin.
18. Seçilen parametrelerin hepsine uyduğundan emin olmak için tüm deneysel koşulların tüm mini tarama temsilcisi görüntülerini kontrol edin.
19. Üst menüde Nüfus Karakterizasyonu 'na ve Olay Alt Popülasyonu 'naseçin.
20. Tür 1 Olayı olarak, sol listede ObjectAreaCh1'i seçin, ardından AND > düğmesine tıklayın ve son olarak ObjectAvgIntensityCh1'i seçin. Bu, düşük alan ve yüksek yoğunluğun bir kombinasyonu olarak yoğunlaştırılmış çekirdeklerin tanımlanmasına izin verecektir.
21. Aynı pencerede, tüm Tarama Sınırları'nın seçimini kaldırın.
22. Analizde saklanacağı parametreleri seçmek için üst menüde Saklanacağı Özellikleri Seç'e tıklayın.
23. İyi Özellikler'i seçin ve sol listeden yalnızca istenen parametreleri sağa taşıyın: (a) SelectedObjectCountPErValidField (b) %EventType1ObjectCount (c) %High_RingAvgIntensity (Belirli soy işaretleyicilerinin her kanalı için).
    NOT: Bu analiz, toplam hücre sayısını, yoğunlaştırılmış çekirdeklerin yüzdesini ve toplam hücre numarasında analiz edilen her işaretleyici için soyuna özgü pozitif hücrelerin yüzdesini okuma olarak verecektir. Farklı soyların yüzdesi yalnızca canlı hücrelerde gerekliyse, kanal için "High_RingAvgIntensity" değerini (mutlak pozitif hücre sayısı) tutmak ve ölü hücrelerin yüzdesinin çıkarılmasından sonra toplam hücre sayılarındaki yüzdeyi yeniden hesaplamak mümkündür.
    1. Alternatif olarak, çekirdek doğrulamasında (adım 11.11) yoğunlaştırılmış çekirdekleri (adım 11.14–11.15) tanımlamak için kullanılan parametrelerin aynısını analiz ayarından ölü hücreleri çıkarmak mümkündür.
24. Ana üst menüden Plakayı Tara'yı seçin ve analiz etmek için kuyuyu tanımlamak için üst bölümdeki Tarama Ayarı alt menüsündeki plaka sembolüne tıklayın.
25. Deneyin adını ve açıklamayı yazın ve tüm ayarlar tamamlandıktan sonra oynatma sembolüne basın.

Sonuçlar

Kültürün ilk aşaması, tohumlama yoğunluğuna ve kürelerin fetal veya yetişkin kökenli olup olmadığına bağlı olarak süre olarak değişebilir. Ayrıca, oligosferler nörosferlere kıyasla iki katına daha az popülasyon gösterir (Şekil 1B). Ayrıca, yetişkin dokusundan küre üretimi daha yavaştır ve tohumlama yoğunluğuna bağlı olarak 1-2 hafta sürebilecek fetal ile karşılaştırıldığında oligosferlerin üretilmesi 2-3 hafta sürebilir.

Tartışmalar

Miyelinasyon/remiyelinasyon süreçlerinin ve demiyelinasyon olaylarının karmaşık doğası, tahmine dayalı in vitro sistemlerin geliştirilmesini son derece zorlaştırmamaktadır. En yaygın olarak kullanılan in vitro ilaç tarama sistemleri çoğunlukla insan hücre hatları veya birincil saf OL kültürleridir, daha karmaşık ortak kültürlerin veya organotipik sistemlerin artan kullanımı^{ile 15}. Bu tür sistemler yüksek içerikli teknolojilerle birleşse bile, saf OL kültürleri tar...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates - untreated	NUNC	267313
B27 supplement (100x)	GIBCO	17504-044
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	GIBCO	PHG0024
BSA	Sigma-Aldrich	A2153
Ciliary Neurotropic Factor (CNTF)	GIBCO	PHC7015
DMEM w/o glucose	GIBCO	A14430-01
DMEM/F12 GlutaMAX	GIBCO	31331-028
DNase	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
EBSS	GIBCO	14155-048
Epidermal Growth Factor (EGF)	GIBCO	PHG6045
HBSS	GIBCO	14170-088
HEPES	GIBCO	15630-056
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884
IFN-γ	Origene	TP721239
IL-17A	Origene	TP723199
IL-1β	Origene	TP723210
IL-6	Origene	TP723240
laminin	GIBCO	23017-051
N-acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A9165
N2 supplement (50x)	GIBCO	17502-048
Non-enzymatic dissociation buffer	GIBCO	13150-016
PBS	GIBCO	70011-036
Penicillin / Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA)	GIBCO	PHG0035
poly-D,L-ornitine	Sigma-Aldrich	P4957
TGF-β1	Origene	TP720760
TNF-α	Origene	TP723451
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752-1G
Trypsin	Sigma-Aldrich	T1426