Analyse de la différenciation et de la maturation de criblage à haute teneur de cultures de cellules souches neurales fœtales et adultes dérivées de cellules souches oligodendrocytes

Résumé

Nous décrivons la production de cultures mixtes d’astrocytes et de cellules précurseurs d’oligodendrocytes dérivées de cellules souches neurales fœtales ou adultes se différenciant en oligodendrocytes matures, et la modélisation in vitro de stimuli nocifs. Le couplage avec une technique de dépistage à haute teneur à base de cellules permet de construire un système de dépistage de médicaments fiable et robuste.

Résumé

Le principal obstacle au développement de techniques de dépistage des médicaments pour évaluer l’efficacité des stratégies thérapeutiques dans les maladies complexes est de trouver un équilibre entre la simplification in vitro et la recréation de l’environnement in vivo complexe, ainsi que l’objectif principal, partagé par toutes les stratégies de dépistage, d’obtenir des données robustes et fiables, hautement prédictives pour la traduction in vivo.

Dans le domaine des maladies démyélinisantes, la majorité des stratégies de dépistage des médicaments sont basées sur des lignées cellulaires immortalisées ou des cultures pures de cellules précurseurs d’oligodendrocytes primaires (OPC) isolées provenant d’animaux nouveau-nés, ce qui entraîne de forts biais en raison de l’absence de différences liées à l’âge et de toute condition ou complexité pathologique réelle.

Nous montrons ici la mise en place d’un système in vitro visant à modéliser la différenciation physiologique / maturation des OPC dérivés de cellules souches neurales (NSC), facilement manipulables pour imiter les conditions pathologiques typiques des maladies démyélinisantes. De plus, la méthode comprend l’isolement des cerveaux fœtaux et adultes, donnant un système qui se différencie dynamiquement des OPC aux oligodendrocytes matures (OL) dans une co-culture spontanée qui comprend également des astrocytes. Ce modèle ressemble physiologiquement à la myélinisation médiée par les hormones thyroïdiennes et au processus de réparation de la myéline, permettant l’ajout d’interférents pathologiques qui modélisent les mécanismes de la maladie. Nous montrons comment imiter les deux principaux composants des maladies démyélinisantes (c’est-à-dire l’hypoxie / ischémie et l’inflammation), en recréant leur effet sur la myélinisation développementale et la réparation de la myéline adulte et en tenant compte de tous les composants cellulaires du système tout au long, tout en nous concentrant sur la différenciation des OPC.

Ce modèle mixte spontané, couplé à des technologies de criblage cellulaire à haute teneur, permet le développement d’un système de dépistage médicamenteux robuste et fiable pour les stratégies thérapeutiques visant à lutter contre les processus pathologiques impliqués dans la démyélinisation et à induire la remyélinisation.

Introduction

Dans le système nerveux central (SNC), les cellules formant la myéline (oligodendrocytes, LAL) et leurs précurseurs (cellules précurseurs des oligodendrocytes, OPC) sont responsables de la myélinisation développementale, un processus qui se produit pendant les périodes péri- et postnatale, et du renouvellement et de la réparation de la myéline (remyélinisation) à l’âge adulte¹. Ces cellules sont hautement spécialisées, interagissant anatomiquement et fonctionnellement avec tous les autres composants gliaux et neuronaux, ce qui en fait une partie fondamentale de la structure et de la fonction du SNC.

Les événements démyélinisants sont impliqués dans différentes lésions et maladies du^{SNC 2}, et agissent principalement sur les OPC et les OL par le biais de mécanismes multifactoriels, à la fois pendant le développement et à l’âge adulte. Les précurseurs indifférenciés sont entraînés par des facteurs de différenciation, principalement l’hormone thyroïdienne (TH), dans un processus synchronisé³ qui conduit l’OPC à reconnaître et à répondre à des stimuli spécifiques qui induisent la prolifération, la migration vers l’axone non myélinisé et la différenciation en OL matures qui à leur tour développent la gaine de myéline⁴. Tous ces processus sont finement contrôlés et se produisent dans un environnement complexe.

En raison de la nature complexe des événements de myélinisation, de remyélinisation et de démyélinisation, il existe un grand besoin d’une méthode in vitro simplifiée et fiable pour étudier les mécanismes sous-jacents et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, en se concentrant sur le principal acteur cellulaire: l’OPC⁵.

Pour qu’un système in vitro soit fiable, un certain nombre de facteurs doivent être pris en compte : la complexité de l’environnement cellulaire, les différences intrinsèques cellulaires liées à l’âge, la différenciation physiologique médiée par la TH, les mécanismes pathologiques et la robustesse des données⁶. En effet, le besoin non satisfait sur le terrain est un modèle qui imite la complexité de la condition in vivo, qui n’est pas atteinte avec succès grâce à l’utilisation de cultures OPC pures isolées. En outre, les deux principaux composants des événements démyélinisants, l’inflammation et l’hypoxie/ischémie (IH), impliquent directement d’autres composants cellulaires qui peuvent affecter indirectement la différenciation physiologique et la maturation des OPC, un aspect qui ne peut pas être étudié dans des modèles in vitro trop simplifiés.

Partant d’un système de culture hautement prédictif, le défi ultérieur et plus général est la production de données robustes et fiables. Dans ce contexte, le criblage cellulaire à haute teneur (HCS) est la technique la plus appropriée⁷, car notre objectif est d’une part d’analyser l’ensemble de la culture dans un flux de travail automatique, en évitant le biais de choisir des champs représentatifs, et d’autre part d’obtenir la génération automatique et simultanée de données à haut contenu basées sur l’imagerie⁸.

Étant donné que le besoin principal est d’atteindre le meilleur équilibre entre la simplification in vitro et la complexité imitant in vivo, nous présentons ici une méthode hautement reproductible pour obtenir des OPC dérivés de cellules souches neurales (NSC) isolées du cerveau antérieur fœtal et de la zone sous-ventriculaire adulte (SVZ). Ce modèle in vitro englobe l’ensemble du processus de différenciation OPC, du NSC multipotent à l’OL mature/myélinisant, d’une manière physiologique dépendante de la TH. La culture résultante est un système de différenciation / maturation dynamique qui se traduit par une co-culture spontanée composée principalement d’OPC et d’astrocytes différenciants, avec un faible pourcentage de neurones. Cette culture primaire imite mieux l’environnement complexe in vivo, tandis que sa dérivation de cellules souches permet d’effectuer des manipulations simples pour obtenir l’enrichissement de la lignée cellulaire souhaité.

Contrairement à d’autres stratégies de dépistage de médicaments utilisant des lignées cellulaires ou des cultures pures d’OPC primaires, la méthode décrite ici permet d’étudier l’effet d’interférents pathologiques ou de molécules thérapeutiques dans un environnement complexe, sans perdre de vue le type de cellule souhaité. Le flux de travail HCS décrit permet une analyse de la viabilité cellulaire et des spécifications de la lignée, ainsi que de la mort cellulaire et des paramètres morphologiques spécifiques à la lignée.

Protocole

Tous les protocoles animaux décrits dans le présent document ont été mis en œuvre conformément aux directives du Conseil de la Communauté européenne (86/609/CEE) et sont conformes aux lignes directrices publiées dans le Guide des NIH pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Solutions et réactifs

1. Préparer le support standard: DMEM / F12 GlutaMAX 1x; 8 mmol/L HEPES; 100 U/100 μg de pénicilline/streptomycine (1 % P/S); 1x B27; 1x N-2.
2. Préparer le milieu de la neurosphère: ajouter 10 ng / mL bFGF; 10 ng/mL EGF au milieu standard.
3. Préparer le milieu oligosphère/OPC : ajouter 10 ng/mL de bFGF; 10 ng/mL PDGF-AA au support standard.
4. Préparer le milieu de différenciation oligodendroctye : ajouter 50 nM T3 ; 10 ng/mL CNTF; 1x N-acétyl-L-cystéine (NAC) au milieu standard.
5. Préparez un tampon de dissociation non enzymatique : ajoutez 1 % de P/S au tampon de dissociation non enzymatique et gardez la glace au froid.
6. Préparer la solution de saccharose : HBSS, 0,3 g/mL de saccharose.
7. Préparer la solution de lavage BSA : EBSS, 40 mg/mL BSA, 0,02 mL/l HEPES.
8. Préparer un tampon de dissociation enzymatique : HBSS, 5,4 mg/mL de D-glucose, 15 mmol/L HEPES, 1,33 mg/mL de trypsine, 0,7 mg/mL de hyaluronidase, 80 U/mL de DNase.
9. Préparer un mélange de cytokines : TGF-β1, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17 et IFN-γ (20 ng/mL chacun).
10. Préparer le véhicule de mélange de cytokines: 0,04% du stock (10% glycérol / 100 nM glycine / 25 nM Tris, pH 7,3).
11. Préparer le milieu de privation oxygène-glucose : milieu standard en utilisant le DMEM sans glucose. Selon la rigueur de l’état de privation de glucose souhaité, il est possible d’éliminer également B27 et/ou N2 du milieu pour éviter les composés liés au glucose (par exemple, D-Galactose dans B27).

2. Dissection et isolement NSC

REMARQUE: Les CSN fœtaux et adultes ont été isolés à partir du cerveau antérieur fœtal E13.5 ou de la zone sous-ventriculaire adulte (SVZ) de 2,5 mois, conformément au protocole⁹ d’Ahlenius et Kokaia avec des modifications.

1. Cultures Fœtales NSC
   REMARQUE: Avant de commencer les dissections, préparer des tubes de 1,5 mL contenant chacun 150 μL de tampon de dissociation non enzymatique; nettoyer les boîtes de Petri et ajouter du HBSS glacé.
   1. Recueillir les embryons à E13,5 - 14,5 de souris gravides chronométrées et placer dans une boîte de Pétri contenant du HBSS froid.
   2. Décapiter les embryons à l’aide de pinces.
   3. Placez les têtes des embryons dans une boîte de Petri propre contenant du PBS glacé et retirez la peau du crâne avec une pince, à l’aide de loupes ou d’un stéréoscope.
   4. Une fois que le cerveau est visible et débarrassé de la peau, pressez-le en appliquant une pression sur les côtés avec une pince.
   5. Retirez le cervelet, ne gardez que le cerveau antérieur et retirez les méninges avec une pince.
   6. Placez le tissu isolé dans le tampon de dissociation non enzymatique et répétez les étapes de dissection avec les autres embryons. Insérez le tissu de 2 à 3 animaux dans chaque tube contenant le tampon.
   7. Incuber à 37 °C pendant 15 min sous agitation continue.
   8. Après incubation, ajouter 850 μL de milieu standard et mélanger par pipetage jusqu’à ce que la suspension soit exempte d’amas.
   9. Si un tissu non dissocié est encore visible, attendez 2 min à TA jusqu’à ce qu’il se dépose au fond du tube.
   10. Lorsque la dissociation est terminée, comptez les cellules et plaquez-les en suspension à une densité de 10 à 50 cellules/μL dans une fiole T-25 ou T-45 contenant 10 à 30 mL de milieu neurosphère, maintenue en position verticale pour éviter l’adhésion cellulaire.
2. Cultures adultes NSC
   1. Sacrifier des animaux par luxation cervicale.
   2. Recueillir les cerveaux de 4 à 5 souris dans un tube de 50 mL contenant du HBSS glacé.
   3. Placez le cerveau sur une surface stérile froide. À cette fin, utilisez une fiole T-25 remplie d’eau et placée à -20 °C pendant la nuit. Au moment de l’expérience, recouvrir la fiole avec du papier d’aluminium stérile.
   4. Placez la face ventrale du cerveau vers le bas, dans le sens rostro-caudal, et retirez les bulbes olfactifs à l’aide d’une lame de rasoir.
   5. À l’aide d’une lame de rasoir, coupez 2 à 3 tranches coronales de 1 mm d’épaisseur, du cortex au chiasma optique.
   6. Placez les tranches sur la surface froide en position ventro-dorsale et identifiez le corps calleux et les deux ventricules latéraux.
   7. À l’aide de loupes ou d’un stéréoscope, isolez les parois des ventricules latéraux, en prenant soin de ne pas porter de morceaux du corps calleux.
   8. Placer le tissu isolé dans le tampon de dissociation enzymatique (5–10 mL) et incuber à 37 °C pendant 15 min.
   9. Mélanger la solution en pipetant plusieurs fois (au moins 50) et incuber à nouveau à 37 °C pendant 10 min.
   10. Neutraliser la trypsine en ajoutant 5 mL de milieu de culture standard et filtrer la solution à l’aide d’un filtre de 70 μm.
   11. Centrifuger la solution filtrée pendant 5 min à 400 x g.
   12. Remettre la pastille dans la solution de saccharose et centrifuger pendant 10 min à 500 x g.
   13. Remettre en suspension la pastille dans une solution de lavage BSA et centrifuger pendant 7 min à 400 x g.
   14. Remettez la pastille dans le milieu de culture standard, comptez les cellules et effectuez le placage comme décrit ci-dessus (à l’étape 2.1.10).

3. Neurosphères primaires

1. Ajouter les facteurs de croissance (bFGF/EGF) tous les 2 jours.
2. Tous les 4 à 6 jours (selon la densité cellulaire), changez la moitié du milieu comme suit :
   1. Transférer toute la suspension cellulaire dans un tube de 15 ou 50 mL.
   2. Centrifugeuse pendant 5 min à 400 x g.
   3. Retirez la moitié du volume.
   4. Ajouter la même quantité de milieu frais, mélanger doucement par pipetage et ajouter des facteurs de croissance.

4. Oligosphères

REMARQUE: La différenciation des oligodendrocytes est effectuée en suivant le protocole Chen¹⁰ avec des modifications.

1. Lorsque les neurosphères atteignent un diamètre de 100 à 150 μm, elles sont prêtes à être passées. Pour ce faire, transférer toute la suspension cellulaire dans un tube de 15 ou 50 mL, et centrifuger pendant 5 min à 400 x g.
   1. Évaluez rapidement le diamètre en prenant des photos des sphères à l’aide d’un microscope à lumière transmise inversée et en les ouvrant par le logiciel ImageJ.
   2. Cliquez sur le menu Analyser et dans la fenêtre Outils, sélectionnez Barre d’échelle.
   3. Définissez 150 μm comme Largeur en microns et comparez la barre d’échelle avec les sphères.
2. Retirer tout le volume par inversion et remettre la pastille en suspension dans 180 μL de milieu de culture standard frais. Pipette 50 fois pour permettre la désagrégation des sphères.
3. Ajouter 810 μL de milieu de culture standard frais, compter les cellules et les plaquer à nouveau comme décrit pour les neurosphères.
4. Ajouter bFGF/PDGF-AA 10 ng/mL tous les 2 jours.
5. Tous les 4 à 6 jours (selon la densité cellulaire), changez la moitié du milieu comme suit :
6. Transférer toute la suspension cellulaire dans un tube de 15 ou 50 mL.
7. Centrifugeuse pendant 5 min à 400 x g.
8. Retirez la moitié du volume.
9. Ajouter la même quantité de milieu frais, mélanger doucement par pipetage et ajouter des facteurs de croissance.

5. Revêtement de plaque

1. Revêtement poly-D,L-ornithine/laminine : au moins 2 jours avant le placage des OPC, ajouter 50 μg/mL de solution de poly-D,L-ornithine, diluée dans du PBS, à chaque puits (40 μL/puits pour les plaques de 96 puits) et incuber à RT pendant la nuit.
2. Le lendemain, retirez le liquide et lavez trois fois avec de l’eau stérile distillée.
3. Laissez les assiettes sécher à RT pendant la nuit. Le lendemain, ajouter une solution de laminine diluée dans du PBS (5 μg/mL; 40 μL/puits pour les plaques à 96 puits) et incuber pendant 2 h à 37 °C.

6. Ensemencement cellulaire

1. Lorsque les oligosphères atteignent un diamètre de 100 à 150 μm, elles sont prêtes à être dissociées et ensemencées sur les plaques revêtues de poly-D,L-ornithine/laminine. Pour ce faire, transférer toute la suspension de la cellule dans un tube de 15 ou 50 mL et centrifuger pendant 5 min à 400 x g (comme indiqué à l’étape 4.1)
2. Retirer tout le volume par inversion et remettre la pastille en suspension dans 180 μL de milieu de culture standard frais. Pipette 50 fois pour permettre la désagrégation des sphères.
3. Ajouter 810 μL de milieu de culture standard frais et compter les cellules.
4. Retirer la solution de laminine des puits et plaquer les cellules à une densité de 3 000 cellules/cm2 (100 μL/puits pour les plaques de 96 puits).

7. Induction de différenciation OPC

1. Après 3 jours, retirez tout le milieu et ajoutez le même volume de milieu de différenciation des oligodendrocytes.
2. Changer la moitié du milieu tous les 4 jours et ajouter un nouveau mélange de différenciation (T3 / CNTF / NAC) tous les 2 jours.

8. Induction du bloc de différenciation médié par l’inflammation

1. Après la dissociation de la neurosphère et la production d’oligosphères (section 4), ajouter le mélange de cytokines au milieu de culture et maintenir les oligosphères exposées aux cytokines pendant toute l’étape de formation des sphères.
   REMARQUE: Le volume dépend du nombre de cellules, car pour les sphères formant des cellules sont ensemencées à 10–50 cellules / μL.
2. Si le milieu doit être changé, changez tout le volume et ajoutez à nouveau le mélange de cytokines.

9. Induction de la mort cellulaire de privation d’oxygène-glucose

1. À -1 DIV (2 jours après l’ensemencement cellulaire dans des plaques multipuits), retirez le milieu et conservez-le dans une nouvelle plaque multipuits.
2. Ajouter la moitié du volume (50 μL pour les plaques de 96 puits) du milieu OGD (groupe OGD) ou du milieu frais (groupe témoin). La demi-quantité de volume est utilisée pour réduire l’échange d’oxygène entre le liquide et l’air.
3. Placer les cultures du groupe OGD dans une chambre d’hypoxie hermétique saturée de 95% de N₂ et 5% de CO_2. Pour obtenir la saturation de la chambre, laissez le mélange de gaz s’écouler pendant 6 min à 25 l/min avant de fermer les tuyaux de la chambre.
4. Incuber la chambre hypoxique dans l’incubateur pendant 3 h. Le groupe témoin et les plaques contenant le milieu retiré et conservé à l’étape 9.1 doivent également être laissés dans l’incubateur.
5. Retirer le milieu sans glucose (groupe OGD) ou le nouveau milieu (groupe témoin) et ajouter le milieu retiré et conservé à l’étape 9.1.

10. Immunocytochimie

1. Au moment souhaité, fixez les cellules avec du paraformaldéhyde froid à 4% pendant 20 min à TA.
2. Laver deux fois avec du PBS (10 min d’incubation pour chaque lavage à RT).
3. Incuber 1 h à TA avec la solution bloquante (PBS Triton 0,3% contenant 1% de BSA et 1% de sérum normal âne/chèvre).
4. Incuber avec un mélange d’anticorps primaires (Tableau 1), dilué dans du triton PBS 0,3%, pendant la nuit à 4 °C.
5. Laver deux fois avec du PBS (10 min d’incubation pour chaque lavage à RT).
6. Incuber avec une solution d’anticorps secondaire(tableau 1)diluée dans du triton PBS à 0,3 % en ajoutant Hoechst 33258 pendant 30 min à 37 °C.
7. Laver deux fois avec du PBS (10 min d’incubation pour chaque lavage à RT).

11. Analyse HCS de la viabilité cellulaire, de la composition de la lignée et de la mort cellulaire spécifique à la lignée

REMARQUE : Les images représentatives HCS et le flux de travail sont illustrés à la Figure 2A, B.

1. Sélectionnez l’algorithme d’analyse compartimentale dans le menu principal du logiciel (HCS Studio v 6.6.0) et sélectionnez Scan dans le menu principal Développer un test/plaque de numérisation.
2. Dans la fenêtre iDev, sélectionnez Nouveau, puis Outil de mesure générale de l’intensité dans le modèle Développer un essai.
3. Cliquez sur Créer sur le côté droit du menu, en sélectionnant l’objectif 10x.
4. Cela ouvrira le menu Configurer l’acquisition. Dans cette fenêtre, sélectionnez les paramètres suivants : (a) nombre de canaux : le premier pour la coloration nucléaire Hoechst (BGRFR_386) et un pour chaque marqueur spécifique à la lignée utilisé dans la réaction (b) sélectionnez la mise au point logicielle sur le canal 1 et l’intervalle de mise au point automatique comme 1 (c) sélectionnez le modèle de plaque dans la liste.
5. Dans le menu d’acquisition, examinez la qualité de la coloration dans différents puits et différents champs et sélectionnez manuellement le temps d’exposition en sélectionnant Temps d’exposition fixe dans le menu.
6. Une fois les paramètres d’acquisition définis, sélectionnez Mini Scan en haut du menu et sélectionnez dix champs par puits dans deux puits par condition expérimentale. Cela permettra la configuration de tous les paramètres d’analyse dans un sous-ensemble de champs pour l’ensemble de la plaque.
7. Lorsque la mini-analyse est terminée, cliquez sur le paramètre Configurer le test pour configurer l’algorithme de l’analyse.
8. Cliquez sur Configurer les groupes dans le côté droit de la fenêtre et faites glisser et déposez les puits du miniscan. Cliquez sur le bouton Ajouter dans la sous-section Groupes pour configurer les différents groupes.
9. Suivez le flux de travail sur le côté gauche de la fenêtre étape par étape pour développer l’ensemble de l’algorithme. Sélectionnez d’abord Traiter l’image pour chaque canal et cliquez sur Suppression de l’arrière-plan et au niveau souhaité.
10. Identifiez et sélectionnez d’abord les noyaux par coloration nucléaire. Cliquez sur Identifier l’objet principal – Canal 1 pour sélectionner les noyaux réels et éviter d’analyser les artefacts et les débris. À cette fin, zoomez sur une image représentative de la coloration nucléaire et vérifiez si les noyaux sont bien entourés par le périmètre construit par le logiciel. Il est possible de modifier la valeur seuiluse et d’appliquer des algorithmes de segmentation pour mieux identifier les noyaux uniques.
11. Une fois les noyaux définis correctement, cliquez sur l’étape suivante : Valider l’objet principal. Sélectionnez Object.BorderObject.Ch1 pour éviter l’analyse des noyaux à la bordure de chaque image de champ. Sélectionnez Object.Area.Ch1 et, en déplaçant les barres « bas » et « haut » sur les histogrammes, retirez tous les débris ou objets volumineux identifiés correspondant à des agrégats ou des artefacts.
12. Vérifiez toutes les images représentatives du mini scan de toutes les conditions expérimentales pour vous assurer que les paramètres sélectionnés correspondent à toutes.
13. Cliquez sur Identifier les taches pour chaque canal correspondant aux marqueurs de lignée spécifiques, puis sélectionnez les valeurs de l’anneau: Largeur = 3 et Distance = 0. Cela permettra l’identification de la fluorescence cytoplasmique. Selon la densité cellulaire, ces valeurs peuvent être adaptées. Le logiciel évitera automatiquement le chevauchement entre les anneaux adjacents.
14. Sélectionnez Niveaux de référence dans le flux de travail pour générer l’analyse. Le réglage des niveaux de référence permettra le comptage automatique des noyaux condensés, en fonction de la taille nucléaire et de l’intensité de coloration nucléaire, et des cellules marqueurs positifs spécifiques, en fonction de la fluorescence cytoplasmique identifiée par l’anneau.
15. Cliquez d’abord sur Object.Area.Ch1. Dans les images mini-scan, sélectionnez un noyau condensé et déplacez la barre « LOW » sur les histogrammes afin de sélectionner comme « condensés » tous les noyaux de cette taille.
16. Cliquez sur Object.AvgIntensity.Ch1. Dans les images mini-scan, sélectionnez un noyau condensé et déplacez la barre « HIGH » sur les histogrammes afin de sélectionner comme « condensés » tous les noyaux au-dessus de cette intensité de fluorescence.
17. Cliquez sur Object.RingAvgIntensity pour chaque canal de marqueurs spécifiques à la lignée. Sélectionnez dans vos mini images de numérisation une cellule positive et déplacez la barre « HIGH » sur les histogrammes afin de sélectionner comme « positives » toutes les cellules au-dessus de cette intensité de fluorescence.
18. Vérifiez toutes les images représentatives du mini scan de toutes les conditions expérimentales pour vous assurer que les paramètres sélectionnés correspondent à toutes.
19. Dans le menu supérieur, sélectionnez Caractérisation de la population et sélectionnez Sous-population de l’événement.
20. En tant qu’événement de type 1, sélectionnez ObjectAreaCh1 dans la liste de gauche, puis cliquez sur le bouton ET > et enfin sélectionnez ObjectAvgIntensityCh1. Cela permettra d’identifier les noyaux condensés, comme une combinaison de faible surface et de haute intensité.
21. Dans la même fenêtre, désélectionnez toutes les limites d’analyse.
22. Cliquez sur Sélectionner les fonctionnalités à stocker dans le menu supérieur, pour choisir les paramètres à conserver dans l’analyse.
23. Sélectionnez Fonctions de puits et déplacez de la liste de gauche vers la droite uniquement les paramètres souhaités : (a) SelectedObjectCountPErValidField (b) %EventType1ObjectCount (c) %High_RingAvgIntensity (pour chaque canal des marqueurs de lignure spécifiques).
    REMARQUE: Cette analyse donnera en lecture le nombre total de cellules, le pourcentage de noyaux condensés et le pourcentage de cellules positives spécifiques à la lignée pour chaque marqueur analysé sur le nombre total de cellules. Si le pourcentage des différentes lignées n’est nécessaire que sur les cellules vivantes, est-il possible soit de conserver la valeur « High_RingAvgIntensity » pour le canal (nombre absolu de cellules positives) et de recalculer le pourcentage sur le nombre total de cellules après la soustraction du pourcentage de cellules mortes.
    1. Alternativement, il est possible de retirer les cellules mortes de l’analyse en définissant les mêmes paramètres que ceux utilisés pour identifier les noyaux condensés (étapes 11.14 à 11.15) lors de la validation des noyaux (étape 11.11).
24. Sélectionnez Plaque de numérisation dans le menu principal du haut et cliquez sur le symbole de la plaque dans le sous-menu Paramètre de numérisation dans la section supérieure pour identifier le puits à analyser.
25. Écrivez le nom de l’expérience et la description et une fois tous les paramètres terminés, appuyez sur le symbole de lecture.

Résultats

La durée de la première phase de la culture peut varier en fonction de la densité d’ensemencement et du fait que les sphères soient d’origine fœtale ou adulte. De plus, les oligosphères affichent une population réduite doublant par rapport aux neurosphères(Figure 1B). De plus, la production de sphères à partir de tissus adultes est plus lente et il peut prendre 2 à 3 semaines pour générer des oligosphères par rapport au fœtus, ce qui peut prendre 1 à 2 semaines, selon la ...

Discussion

La nature complexe des processus de myélinisation/remyélinisation et des événements démyélinisants rend le développement de systèmes prédictifs in vitro extrêmement difficile. Les systèmes de dépistage de médicaments in vitro les plus largement utilisés sont principalement des lignées cellulaires humaines ou des cultures PRIMAIRES d’OL pur, avec une utilisation croissante de co-cultures plus complexes ou de systèmes organotypiques¹⁵. Même si de tels systèmes sont couplés à de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates - untreated	NUNC	267313
B27 supplement (100x)	GIBCO	17504-044
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	GIBCO	PHG0024
BSA	Sigma-Aldrich	A2153
Ciliary Neurotropic Factor (CNTF)	GIBCO	PHC7015
DMEM w/o glucose	GIBCO	A14430-01
DMEM/F12 GlutaMAX	GIBCO	31331-028
DNase	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
EBSS	GIBCO	14155-048
Epidermal Growth Factor (EGF)	GIBCO	PHG6045
HBSS	GIBCO	14170-088
HEPES	GIBCO	15630-056
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884
IFN-γ	Origene	TP721239
IL-17A	Origene	TP723199
IL-1β	Origene	TP723210
IL-6	Origene	TP723240
laminin	GIBCO	23017-051
N-acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A9165
N2 supplement (50x)	GIBCO	17502-048
Non-enzymatic dissociation buffer	GIBCO	13150-016
PBS	GIBCO	70011-036
Penicillin / Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA)	GIBCO	PHG0035
poly-D,L-ornitine	Sigma-Aldrich	P4957
TGF-β1	Origene	TP720760
TNF-α	Origene	TP723451
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752-1G
Trypsin	Sigma-Aldrich	T1426