High-Content-Screening-Differenzierungs- und Reifungsanalyse von fetalen und adulten neuralen Stammzellen-abgeleiteten Oligodendrozyten-Vorläuferzellkulturen

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Produktion von Mischkulturen von Astrozyten und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, die aus fetalen oder adulten neuralen Stammzellen gewonnen werden, die sich in reife Oligodendrozyten unterscheiden, und in vitro die Modellierung schädlicher Reize. Die Kopplung mit einer zellbasierten High-Content-Screening-Technik bildet ein zuverlässiges und robustes Wirkstoff-Screening-System.

Zusammenfassung

Die Haupthürde bei der Entwicklung von Arzneimittel-Screening-Techniken zur Beurteilung der Wirksamkeit therapeutischer Strategien bei komplexen Krankheiten besteht darin, ein Gleichgewicht zwischen in vitro Vereinfachung und der Wiederherstellung der komplexen In-vivo-Umgebung zu finden, zusammen mit dem Hauptziel, das von allen Screening-Strategien geteilt wird, robuste und zuverlässige Daten zu erhalten, die für die In-vivo-Translation hochprädiktiv sind.

Im Bereich der demyelinisierenden Erkrankungen basiert die Mehrheit der Arzneimittel-Screening-Strategien auf immortalisierten Zelllinien oder reinen Kulturen isolierter primärer Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) von neugeborenen Tieren, was zu starken Verzerrungen aufgrund des Fehlens altersbedingter Unterschiede und eines realen pathologischen Zustands oder einer realen pathologischen Komplexität führt.

Hier zeigen wir den Aufbau eines In-vitro-Systems, das darauf abzielt, die physiologische Differenzierung / Reifung von aus neuronalen Stammzellen (NSC) abgeleiteten OPCs zu modellieren, die leicht manipuliert werden können, um pathologische Zustände nachzuahmen, die für demyelinisierende Krankheiten typisch sind. Darüber hinaus beinhaltet die Methode die Isolierung von fetalen und erwachsenen Gehirnen, wodurch ein System entsteht, das sich dynamisch von OPCs zu reifen Oligodendrozyten (OLs) in einer spontanen Kokultur unterscheidet, die auch Astrozyten umfasst. Dieses Modell ähnelt physiologisch dem Schilddrüsenhormon-vermittelten Myelinisierungs- und Myelinreparaturprozess, was die Zugabe von pathologischen Interferenzen ermöglicht, die Krankheitsmechanismen modellieren. Wir zeigen, wie man die beiden Hauptkomponenten demyelinisierender Erkrankungen (d.h. Hypoxie/Ischämie und Entzündung) nachahmen kann, indem man ihre Wirkung auf die Entwicklungsmyelinisierung und die adulte Myelinreparatur nachbildet und alle Zellkomponenten des Systems durchgehend berücksichtigt, während wir uns auf die Differenzierung von OPCs konzentrieren.

Dieses spontane Mischmodell, gekoppelt mit zellbasierten High-Content-Screening-Technologien, ermöglicht die Entwicklung eines robusten und zuverlässigen Wirkstoff-Screening-Systems für therapeutische Strategien, die darauf abzielen, die pathologischen Prozesse der Demyelinisierung zu bekämpfen und die Remyelinisierung zu induzieren.

Einleitung

Im zentralen Nervensystem (ZNS) sind myelinbildende Zellen (Oligodendrozyten, OLs) und ihre Vorläufer (Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, OPCs) für die Entwicklungsmyelinisierung, ein Prozess, der während der peri- und postnatalen Periode auftritt, sowie für den Myelinumsatz und die Myelinreparatur (Remyelinisierung) im Erwachsenenalter verantwortlich¹. Diese Zellen sind hochspezialisiert und interagieren anatomisch und funktionell mit allen anderen glialen und neuronalen Komponenten, was sie zu einem grundlegenden Bestandteil der Struktur und Funktion des ZNS macht.

Demyelinisierende Ereignisse sind an verschiedenen ZNS-Verletzungen und^{-Erkrankungen 2}beteiligt und wirken hauptsächlich über multifaktorielle Mechanismen sowohl während der Entwicklung als auch im Erwachsenenalter auf OPCs und OLs. Die undifferenzierten Vorläufer werden durch differenzierende Faktoren, hauptsächlich Schilddrüsenhormon (TH), in einem synchronisierten Prozess³ angetrieben, der den OPC dazu bringt, spezifische Reize zu erkennen und darauf zu reagieren, die Proliferation, Migration zum nicht myelinisierten Axon und Differenzierung in reife OLs induzieren, die wiederum die Myelinscheide entwickeln⁴. All diese Prozesse werden fein gesteuert und laufen in einem komplexen Umfeld ab.

Aufgrund der komplexen Natur von Myelinisierungs-, Remyelinisierungs- und Demyelinisierungsereignissen besteht ein großer Bedarf an einer vereinfachten und zuverlässigen In-vitro-Methode, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen und neue therapeutische Strategien zu entwickeln, wobei der Schwerpunkt auf dem zellulären Hauptakteur^liegt:dem OPC 5 .

Damit ein In-vitro-System zuverlässig ist, müssen eine Reihe von Faktoren berücksichtigt werden: die Komplexität der zellulären Umgebung, altersbedingte zellintrinsische Unterschiede, physiologische TH-vermittelte Differenzierung, pathologische Mechanismen und die Robustheit der Daten⁶. Tatsächlich ist der unerfüllte Bedarf auf diesem Gebiet ein Modell, das die Komplexität des In-vivo-Zustands nachahmt, der durch die Verwendung isolierter reiner OPC-Kulturen nicht erfolgreich erreicht wird. Darüber hinaus betreffen die beiden Hauptkomponenten demyelinisierender Ereignisse, Entzündung und Hypoxie/Ischämie (HI), direkt andere Zellkomponenten, die indirekt die physiologische Differenzierung und Reifung von OPCs beeinflussen können, ein Aspekt, der in zu vereinfachten In-vitro-Modellen nicht untersucht werden kann.

Ausgehend von einem hochprädiktiven Kultursystem besteht die nachfolgende und allgemeinere Herausforderung darin, robuste und zuverlässige Daten zu erzeugen. In diesem Zusammenhang ist das zellbasierte High-Content-Screening (HCS) die am besten geeignete Technik 7 , da es unser Ziel ist, erstens die gesamte Kultur in^einemautomatischen Workflow zu analysieren, die Verzerrung der Auswahl repräsentativer Felder zu vermeiden, und zweitens die automatische und gleichzeitige Generierung von bildgebenden High-Content-Daten zu erhalten⁸.

Da die Hauptanforderung darin besteht, das beste Gleichgewicht zwischen in vitro Vereinfachung und in vivo-nachahmender Komplexität zu erreichen, stellen wir hier eine hochreproduzierbare Methode zur Gewinnung von OPCs aus neuralen Stammzellen (NSCs) vor, die aus dem fetalen Vorderhirn und der adulten subventrikulären Zone (SVZ) isoliert wurden. Dieses in vitro Modell umfasst den gesamten OPC-Differenzierungsprozess, vom multipotenten NSC bis zur reifen/myelinisierenden OL, physiologisch TH-abhängig. Die resultierende Kultur ist ein dynamisch differenzierendes / reifendes System, das zu einer spontanen Kokultur führt, die hauptsächlich aus differenzierenden OPCs und Astrozyten besteht, mit einem geringen Prozentsatz an Neuronen. Diese Primärkultur ahmt die komplexe In-vivo-Umgebung besser nach, während ihre Stammzellableitung einfache Manipulationen ermöglicht, um die gewünschte Zelllinienanreicherung zu erhalten.

Im Gegensatz zu anderen Drug-Screening-Strategien unter Verwendung von Zelllinien oder Reinkulturen primärer OPCs ermöglicht die hier beschriebene Methode die Untersuchung der Wirkung pathologischer Interferenzen oder therapeutischer Moleküle in einer komplexen Umgebung, ohne den Fokus auf den gewünschten Zelltyp zu verlieren. Der beschriebene HCS-Workflow erlaubt eine Analyse der Zelllebensfähigkeit und Abstammungsspezifikation sowie des linienspezifischen Zelltods und morphologischer Parameter.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Tierprotokolle wurden gemäß den Richtlinien des Rates der Europäischen Gemeinschaft (86/609/EWG) durchgeführt und entsprechen den im NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren veröffentlichtenRichtlinien.

1. Lösungen und Reagenzien

1. Standardmedium vorbereiten: DMEM/F12 GlutaMAX 1x; 8 mmol/L HEPES; 100 U/100 μg Penicillin/Streptomycin (1% p/s); 1x B27; 1x N-2.
2. Neurosphärenmedium vorbereiten: 10 ng/ml bFGF hinzufügen; 10 ng/mL EGF auf Standardmedium.
3. Oligosphäre/OPC-Medium vorbereiten: 10 ng/ml bFGF zugeben; 10 ng/mL PDGF-AA auf Standardmedium.
4. Oligodendroktye-Differenzierungsmedium vorbereiten: 50 nM T3 hinzufügen; 10 ng/ml CNTF; 1x N-Acetyl-L-Cystein (NAC) zu Standardmedium.
5. Nicht-enzymatischen Dissoziationspuffer vorbereiten: 1% P /S in den nicht-enzymatischen Dissoziationspuffer geben und eiskalt halten.
6. Saccharoselösung zubereiten: HBSS, 0,3 g/ml Saccharose.
7. BSA-Waschlösung vorbereiten: EBSS, 40 mg/ml BSA, 0,02 ml/l HEPES.
8. Enzymatischer Dissoziationspuffer herstellen: HBSS, 5,4 mg/ml D-Glucose, 15 mmol/L HEPES, 1,33 mg/ml Trypsin, 0,7 mg/ml Hyaluronidase, 80 U/ml DNase.
9. Zytokinmischung vorbereiten: TGF-β1, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17 und IFN-γ (jeweils 20 ng/ml).
10. Zytokin-Mischfahrzeug vorbereiten: 0,04% des Bestands (10% Glycerin/100 nM Glycin/25 nM Tris, pH 7,3).
11. Sauerstoff-Glukose-Deprivationsmedium vorbereiten: Standardmedium mit DMEM ohne Glukose. Abhängig von der Stringenz der gewünschten Glukoseentzugsbedingung ist es möglich, auch B27 und/oder N2 aus dem Medium zu entfernen, um glukosebedingte Verbindungen (z. B. D-Galactose in B27) zu vermeiden.

2. Dissektion und NSC-Isolierung

HINWEIS: Fetale und erwachsene NSCs wurden aus E13,5 fetalem Vorderhirn oder 2,5 Monate alter subventrikulärer Zone (SVZ) isoliert, wobei das Ahlenius- und Kokaia-Protokoll⁹ mit Modifikationen eingehalten wurde.

1. Fetale NSC-Kulturen
   ANMERKUNG: Bevor Sie mit den Dissektionen beginnen, stellen Sie 1,5 ml Röhrchen mit jeweils 150 μL nicht-enzymatischem Dissoziationspuffer her; Petrischalen reinigen und eiskaltes HBSS hinzufügen.
   1. Entnehmen Sie die Embryonen bei E13.5 - 14.5 von zeitgesteuerten trächtigen Mäusen und legen Sie sie in eine Petrischale mit kaltem HBSS.
   2. Enthaupten Sie die Embryonen mit einer Pinzette.
   3. Legen Sie die Köpfe der Embryonen in eine saubere Petrischale mit eiskaltem PBS und entfernen Sie die Haut mit einer Pinzette mit einer Lupe oder einem Stereoskop vom Schädel.
   4. Sobald das Gehirn sichtbar und von der Haut befreit ist, drücken Sie es aus, indem Sie mit einer Pinzette Druck auf die Seiten ausüben.
   5. Entfernen Sie das Kleinhirn, behalten Sie nur das Vorderhirn und entfernen Sie die Hirnhäute mit einer Pinzette.
   6. Legen Sie das isolierte Gewebe in den nicht-enzymatischen Dissoziationspuffer und wiederholen Sie die Dissektionsschritte mit den anderen Embryonen. Führen Sie das Gewebe von 2-3 Tieren in jedes Röhrchen ein, das den Puffer enthält.
   7. Bei 37 °C für 15 min unter kontinuierlichem Schütteln inkubieren.
   8. Nach der Inkubation 850 μL Standardmedium zugeben und durch Pipettieren mischen, bis die Suspension frei von Klumpen ist.
   9. Wenn nicht dissoziiertes Gewebe noch sichtbar ist, warten Sie 2 min bei RT, bis es sich am Boden des Röhrchens ablagert.
   10. Wenn die Dissoziation abgeschlossen ist, zählen Sie die Zellen und platten Sie sie in Suspension mit einer Dichte von 10-50 Zellen / μL in einem T-25- oder T-45-Kolben mit 10-30 ml Neurosphärenmedium, der in einer vertikalen Position gehalten wird, um eine Zelladhäsion zu vermeiden.
2. Erwachsene NSC-Kulturen
   1. Opfertiere durch zervikale Luxation.
   2. Sammeln Sie Gehirne von 4-5 Mäusen in einem 50 ml Röhrchen, das eiskaltes HBSS enthält.
   3. Legen Sie das Gehirn auf eine kalte sterile Oberfläche. Verwenden Sie zu diesem Zweck einen mit Wasser gefüllten T-25-Kolben, der über Nacht bei -20 °C aufgestellt wird. Zum Zeitpunkt des Experiments den Kolben mit steriler Aluminiumfolie abdecken.
   4. Legen Sie die Ventralseite des Gehirns nach unten, in rostro-kaudaler Richtung, und entfernen Sie die Riechkolben mit einer Rasierklinge.
   5. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge 2–3 koronale Scheiben von 1 mm Dicke vom Kortex bis zum optischen Chiasma.
   6. Legen Sie die Scheiben in ventro-dorsaler Position auf die kalte Oberfläche und identifizieren Sie den Corpus callosum und die beiden lateralen Ventrikel.
   7. Isolieren Sie mit einer Lupe oder einem Stereoskop die Wände der seitlichen Ventrikel und achten Sie darauf, keine Stücke des Corpus callosum zu tragen.
   8. Das isolierte Gewebe in den enzymatischen Dissoziationspuffer (5–10 ml) geben und bei 37 °C für 15 min inkubieren.
   9. Mischen Sie die Lösung, pipettieren Sie mehrmals (mindestens 50) und inkubieren Sie erneut bei 37 ° C für 10 min.
   10. Neutralisieren Sie das Trypsin durch Zugabe von 5 ml Standardkulturmedium und filtern Sie die Lösung mit einem 70 μm-Filter.
   11. Zentrifugieren Sie die filtrierte Lösung für 5 min bei 400 x g.
   12. Resuspendieren Sie das Pellet in der Saccharoselösung und zentrifugieren Sie es für 10 min bei 500 x g.
   13. Resuspendieren Sie das Pellet in BSA-Waschlösung und zentrifugieren Sie es für 7 min bei 400 x g.
   14. Resuspendieren Sie das Pellet im Standardkulturmedium, zählen Sie die Zellen und führen Sie die Beschichtung wie oben beschrieben durch (in Schritt 2.1.10).

3. Primäre Neurosphären

1. Fügen Sie die Wachstumsfaktoren (bFGF/EGF) alle 2 Tage hinzu.
2. Wechseln Sie alle 4–6 Tage (abhängig von der Zelldichte) die Hälfte des Mediums wie folgt:
   1. Übertragen Sie die gesamte Zellsuspension auf ein 15- oder 50-ml-Röhrchen.
   2. Zentrifuge für 5 min bei 400 x g.
   3. Entfernen Sie die Hälfte des Volumes.
   4. Fügen Sie die gleiche Menge frisches Medium hinzu, mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren und fügen Sie Wachstumsfaktoren hinzu.

4. Oligosphären

HINWEIS: Die Oligodendrozytendifferenzierung erfolgt nach dem Chen-Protokoll¹⁰ mit Modifikationen.

1. Wenn die Neurosphären einen Durchmesser von 100–150 μm erreichen, sind sie bereit, passiert zu werden. Dazu die gesamte Zellsuspension in ein 15- oder 50-ml-Röhrchen überführen und 5 min bei 400 x gzentrifugieren.
   1. Bewerten Sie schnell den Durchmesser, indem Sie Bilder der Kugeln mit einem invertierten Durchlichtmikroskop aufnehmen und sie mit der ImageJ-Software öffnen.
   2. Klicken Sie auf das Menü Analysieren und wählen Sie im Fenster Extras die Option Maßstabsleiste.
   3. Stellen Sie 150 μm als Breite in Mikrometern ein und vergleichen Sie den Maßstabsbalken mit den Kugeln.
2. Entfernen Sie das gesamte Volumen durch Inversion und resuspenieren Sie das Pellet in 180 μL frischem Standardkulturmedium. 50-mal pipettieren, um eine Disaggregation der Kugeln zu ermöglichen.
3. Fügen Sie 810 μL frisches Standardkulturmedium hinzu, zählen Sie die Zellen und platten Sie sie wie für die Neurosphären beschrieben neu.
4. Fügen Sie bFGF / PDGF-AA 10 ng / ml alle 2 Tage hinzu.
5. Wechseln Sie alle 4–6 Tage (abhängig von der Zelldichte) die Hälfte des Mediums wie folgt:
6. Übertragen Sie die gesamte Zellsuspension auf ein 15- oder 50-ml-Röhrchen.
7. Zentrifuge für 5 min bei 400 x g.
8. Entfernen Sie die Hälfte des Volumes.
9. Fügen Sie die gleiche Menge frisches Medium hinzu, mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren und fügen Sie Wachstumsfaktoren hinzu.

5. Plattenbeschichtung

1. Poly-D, L-Ornithin / Laminin-Beschichtung: mindestens 2 Tage vor dem Plattieren der OPCs, fügen Sie 50 μg / ml Poly-D, L-Ornithin-Lösung, verdünnt in PBS, zu jeder Vertiefung hinzu (40 μL / Well für 96-Well-Platten) und inkubieren Sie bei RT über Nacht.
2. Am nächsten Tag die Flüssigkeit entfernen und dreimal mit destilliertem sterilem Wasser waschen.
3. Lassen Sie die Platten bei RT über Nacht trocknen. Am nächsten Tag wird eine in PBS verdünnte Lamininlösung (5 μg/ml; 40 μL/Well für 96-Well-Platten) zugegeben und 2 h bei 37 °C inkubiert.

6. Zell-Seeding

1. Wenn die Oligosphären einen Durchmesser von 100–150 μm erreichen, sind sie bereit, dissoziiert und auf den Poly-D,L-Ornithin/Laminin-beschichteten Platten ausgesät zu werden. Dazu wird die gesamte Zellsuspension in ein 15- oder 50-ml-Röhrchen überführt und 5 min bei 400 x g zentrifugiert (wie in Schritt 4.1 angegeben).
2. Entfernen Sie das gesamte Volumen durch Inversion und resuspenieren Sie das Pellet in 180 μL frischem Standardkulturmedium. 50-mal pipettieren, um eine Disaggregation der Kugeln zu ermöglichen.
3. Fügen Sie 810 μL frisches Standardkulturmedium hinzu und zählen Sie die Zellen.
4. Entfernen Sie die Lamininlösung aus den Vertiefungen und platten Sie die Zellen mit einer Dichte von 3.000 Zellen/cm2 (100 μL/Well für 96-Well-Platten).

7. OPC-Differenzierungsinduktion

1. Entfernen Sie nach 3 Tagen das gesamte Medium und fügen Sie das gleiche Volumen oligodendrozytendifferenzierungsmedium hinzu.
2. Wechseln Sie alle 4 Tage die Hälfte des Mediums und fügen Sie alle 2 Tage eine frische Differenzierungsmischung (T3 / CNTF / NAC) hinzu.

8. Induktion eines entzündungsvermittelten Differenzierungsblocks

1. Nach der Neurosphärendissoziation und der Oligosphärenproduktion (Abschnitt 4) wird die Zytokinmischung in das Kulturmedium gegeben und die Oligosphären während des gesamten Sphärenbildungsschritts Zytokinen ausgesetzt.
   HINWEIS: Das Volumen hängt von der Anzahl der Zellen ab, da für die Kugeln, die Zellen bilden, mit 10–50 Zellen/μL ausgesät werden.
2. Wenn das Medium gewechselt werden muss, ändern Sie das gesamte Volumen und fügen Sie die Zytokinmischung erneut hinzu.

9. Induktion des Sauerstoff-Glukose-Deprivations Zelltods

1. Bei -1 DIV (2 Tage nach dem Cell Seeding in Multiwell-Platten) entfernen Sie das Medium und konservieren es in einer neuen Multiwell-Platte.
2. Fügen Sie die Hälfte des Volumens (50 μL für 96-Well-Platten) des OGD-Mediums (OGD-Gruppe) oder des frischen Mediums (Kontrollgruppe) hinzu. Die halbe Volumenmenge wird verwendet, um den Sauerstoffaustausch zwischen der Flüssigkeit und der Luft zu reduzieren.
3. Legen Sie die OGD-Gruppenkulturen in eine luftdichte Hypoxiekammer, die mit 95%_N2 und 5% CO2 gesättigt_ist. Um eine Sättigung der Kammer zu erreichen, lassen Sie das Gasgemisch 6 min bei 25 l/min fließen, bevor Sie die Kammerrohre schließen.
4. Inkubieren Sie die hypoxische Kammer im Inkubator für 3 h. Die Kontrollgruppe und die Platten, die das in Schritt 9.1 entfernte und konservierte Medium enthalten, sollten ebenfalls im Inkubator verbleiben.
5. Entfernen Sie das glucosefreie (OGD-Gruppe) oder das neue Medium (Kontrollgruppe) und fügen Sie das in Schritt 9.1 entfernte und konservierte Medium hinzu.

10. Immunzytochemie

1. Fixieren Sie die Zellen zum gewünschten Zeitpunkt mit kaltem 4% Paraformaldehyd für 20 min bei RT.
2. Zweimal mit PBS waschen (10 Minuten Inkubation für jede Wäsche bei RT).
3. 1 h bei RT mit der Blockierungslösung (PBS Triton 0,3% mit 1% BSA und 1% Esel/Ziege normalem Serum) inkubieren.
4. Inkubieren mit primärer Antikörpermischung (Tabelle 1), verdünnt in PBS triton 0,3%, über Nacht bei 4 °C.
5. Zweimal mit PBS waschen (10 Minuten Inkubation für jede Wäsche bei RT).
6. Inkubieren mit sekundärer Antikörperlösung (Tabelle 1), verdünnt in PBS-Triton 0,3% unter Zugabe von Hoechst 33258 für 30 min bei 37 °C.
7. Zweimal mit PBS waschen (10 Minuten Inkubation für jede Wäsche bei RT).

11. HCS-Analyse der Zelllebensfähigkeit, der Abstammungszusammensetzung und des linienspezifischen Zelltods

HINWEIS: Die repräsentativen HCS-Bilder und der Workflow sind in Abbildung 2A,B dargestellt.

1. Wählen Sie den Kompartimentanalyse-Algorithmus aus dem Hauptmenü der Software (HCS Studio v 6.6.0) und wählen Sie Scannen aus dem Hauptmenü Assay/Scanplatte entwickeln.
2. Wählen Sie im iDev-Fenster Neu und dann in der Vorlage Assay entwickeln die Option Allgemeines Intensitätsmesstool aus.
3. Klicke auf der rechten Seite des Menüs auf "Erstellen" und wähle das 10-fache Ziel aus.
4. Dadurch wird das Menü Erfassung konfigurieren geöffnet. Wählen Sie in diesem Fenster die folgenden Parameter aus: (a) Anzahl der Kanäle: der erste für die Hoechst-Kernfärbung (BGRFR_386) und einer für jeden in der Reaktion verwendeten linienspezifischen Marker (b) Wählen Sie den Softwarefokus auf Kanal 1 und das Autofokusintervall als 1 (c) wählen Sie das Plattenmodell aus der Liste.
5. Schauen Sie sich im Erfassungsmenü die Qualität der Färbung in verschiedenen Vertiefungen und verschiedenen Feldern an und wählen Sie die Belichtungszeit manuell aus, indem Sie im Menü Feste Belichtungszeit auswählen.
6. Sobald die Erfassungsparameter eingestellt sind, wählen Sie oben im Menü Mini-Scan und wählen Sie zehn Felder pro Vertiefung in zwei Vertiefungen pro Versuchsbedingung aus. Dies ermöglicht die Einrichtung aller Analyseparameter in einer Teilmenge von Feldern für die gesamte Platte.
7. Wenn der Mini-Scan abgeschlossen ist, klicken Sie auf Assay-Parameter konfigurieren, um den Algorithmus der Analyse zu konfigurieren.
9. Folgen Sie dem Workflow auf der linken Seite des Fensters Schritt für Schritt, um den gesamten Algorithmus zu entwickeln. Wählen Sie zunächst Prozessabbild für jeden Kanal und klicken Sie auf Hintergrundentfernung und auf die gewünschte Ebene.
10. Identifizieren und selektieren Sie zunächst die Kerne durch Kernfärbung. Klicken Sie auf Primäres Objekt identifizieren – Kanal 1, um die realen Kerne auszuwählen und die Analyse von Artefakten und Trümmern zu vermeiden. Zoomen Sie dazu in ein repräsentatives Bild der Kernfärbung und prüfen Sie, ob die Kerne von dem von der Software aufgebauten Perimeter gut umgeben sind. Es ist möglich, den Schwellenwert zu ändern und Segmentierungsalgorithmen anzuwenden, um einzelne Kerne besser zu identifizieren.
11. Sobald die Kerne korrekt definiert sind, klicken Sie auf den folgenden Schritt: Primärobjekt validieren. Wählen Sie Object.BorderObject.Ch1 aus, um die Analyse von Kernen am Rand jedes Feldbildes zu vermeiden. Wählen Sie Object.Area.Ch1 und entfernen Sie durch Verschieben der Balken "niedrig" und "hoch" in den Histogrammen alle identifizierten Trümmer oder großformatigen Objekte, die Aggregaten oder Artefakten entsprechen.
12. Überprüfen Sie alle repräsentativen Bilder des Mini-Scans aller experimentellen Bedingungen, um sicherzustellen, dass die ausgewählten Parameter mit allen übereinstimmen.
13. Klicken Sie auf Spots identifizieren für jeden Kanal, der den spezifischen Abstammungsmarkierungen entspricht, und wählen Sie die Ringwerte aus: Breite = 3 und Abstand = 0. Dies ermöglicht die Identifizierung der zytoplasmatischen Fluoreszenz. Je nach Zelldichte können diese Werte angepasst werden. Die Software vermeidet automatisch die Überlappung benachbarter Ringe.
14. Wählen Sie im Workflow Referenzebenen aus, um die Analyse zu erstellen. Die Festlegung der Referenzwerte ermöglicht die automatische Zählung kondensierter Kerne, basierend auf der Kerngröße und der Kernfärbungsintensität, und von spezifischen markerpositiven Zellen, basierend auf der vom Ring identifizierten zytoplasmatischen Fluoreszenz.
15. Klicken Sie zunächst auf Object.Area.Ch1. Wählen Sie in den Mini-Scan-Bildern einen kondensierten Kern aus und verschieben Sie den "LOW" -Balken auf den Histogrammen, um alle Kerne unter dieser Größe als "kondensiert" auszuwählen.
16. Klicken Sie auf Object.AvgIntensity.Ch1. Wählen Sie in den Mini-Scan-Bildern einen kondensierten Kern aus und verschieben Sie den "HIGH" -Balken auf den Histogrammen, um alle Kerne oberhalb dieser Fluoreszenzintensität als "kondensiert" auszuwählen.
17. Klicken Sie auf Object.RingAvgIntensity für jeden Kanal von linienspezifischen Markern. Wählen Sie in Ihren Mini-Scan-Bildern eine positive Zelle aus und verschieben Sie den "HIGH" -Balken auf den Histogrammen, um alle Zellen über dieser Fluoreszenzintensität als "positiv" auszuwählen.
18. Überprüfen Sie alle repräsentativen Bilder des Mini-Scans aller experimentellen Bedingungen, um sicherzustellen, dass die ausgewählten Parameter mit allen übereinstimmen.
19. Wählen Sie im oberen Menü Populationscharakterisierung und dann Event Subpopulationaus.
20. Wählen Sie als Typ-1-Ereignis in der linken Liste ObjectAreaCh1 aus, klicken Sie dann auf die Schaltfläche UND > und wählen Sie schließlich ObjectAvgIntensityCh1. Dies ermöglicht die Identifizierung kondensierter Kerne als Kombination aus geringer Fläche und hoher Intensität.
21. Deaktivieren Sie im selben Fenster alle Scan-Limits.
22. Klicken Sie im oberen Menü auf Zu speichernde Features auswählen, um die Parameter auszuwählen, die in der Analyse beibehalten werden sollen.
23. Wählen Sie Well-Features aus, und wechseln Sie von der linken Liste nach rechts nur die gewünschten Parameter: (a) SelectedObjectCountPErValidField (b) %EventType1ObjectCount (c) %High_RingAvgIntensity (Für jeden Kanal der spezifischen Abstammungsmarkierungen).
    HINWEIS: Diese Analyse liefert als Auslesung die Gesamtzahl der Zellen, den Prozentsatz der kondensierten Kerne und den Prozentsatz der linienspezifischen positiven Zellen für jeden analysierten Marker auf der Gesamtzellzahl. Wenn der Prozentsatz der verschiedenen Linien nur auf lebenden Zellen benötigt wird, ist es möglich, entweder den Wert "High_RingAvgIntensity" für den Kanal beizubehalten (absolute Anzahl der positiven Zellen) und den Prozentsatz der Gesamtzellzahlen nach der Subtraktion des Prozentsatzes der toten Zellen neu zu berechnen.
    1. Alternativ ist es möglich, die toten Zellen aus der Analyse zu entfernen, indem die gleichen Parameter eingestellt werden, die zur Identifizierung kondensierter Kerne (Schritte 11.14–11.15) bei der Kernvalidierung (Schritt 11.11) verwendet werden.
24. Wählen Sie Scan Plate aus dem oberen Hauptmenü und klicken Sie auf das Plattensymbol im Untermenü Scan Setting im oberen Bereich, um das zu analysierende Bohrloch zu identifizieren.
25. Schreiben Sie den Namen des Experiments und die Beschreibung, und sobald alle Einstellungen abgeschlossen sind, drücken Sie das Wiedergabesymbol.

Ergebnisse

Die erste Phase der Kultur kann in der Dauer variieren, abhängig von der Aussaatdichte und davon, ob die Kugeln fetalen oder erwachsenen Ursprungs sind. Darüber hinaus zeigen Oligosphären eine reduzierte Populationsverdopplung im Vergleich zu Neurosphären (Abbildung 1B). Darüber hinaus ist die Produktion von Kugeln aus erwachsenem Gewebe langsamer und es kann 2-3 Wochen dauern, bis Oligosphären erzeugt werden, verglichen mit fötalen, die je nach Aussaatdichte 1-2 Wochen dauern können...

Diskussion

Die Komplexität von Myelinisierungs-/Remyelinisierungsprozessen und demyelinisierenden Ereignissen macht die Entwicklung prädiktiver In-vitro-Systeme extrem herausfordernd. Die am weitesten verbreiteten In-vitro-Wirkstoff-Screening-Systeme sind meist menschliche Zelllinien oder primäre reine OL-Kulturen, wobei zunehmend komplexere Cokulturen oder organotypische Systeme verwendet werden¹⁵. Auch wenn solche Systeme mit High-Content-Technologien gekoppelt sind, bleiben reine OL-Kulturen die Method...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates - untreated	NUNC	267313
B27 supplement (100x)	GIBCO	17504-044
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	GIBCO	PHG0024
BSA	Sigma-Aldrich	A2153
Ciliary Neurotropic Factor (CNTF)	GIBCO	PHC7015
DMEM w/o glucose	GIBCO	A14430-01
DMEM/F12 GlutaMAX	GIBCO	31331-028
DNase	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
EBSS	GIBCO	14155-048
Epidermal Growth Factor (EGF)	GIBCO	PHG6045
HBSS	GIBCO	14170-088
HEPES	GIBCO	15630-056
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884
IFN-γ	Origene	TP721239
IL-17A	Origene	TP723199
IL-1β	Origene	TP723210
IL-6	Origene	TP723240
laminin	GIBCO	23017-051
N-acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A9165
N2 supplement (50x)	GIBCO	17502-048
Non-enzymatic dissociation buffer	GIBCO	13150-016
PBS	GIBCO	70011-036
Penicillin / Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA)	GIBCO	PHG0035
poly-D,L-ornitine	Sigma-Aldrich	P4957
TGF-β1	Origene	TP720760
TNF-α	Origene	TP723451
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752-1G
Trypsin	Sigma-Aldrich	T1426