Selezione ad alto contenuto di differenziazione e analisi della maturazione di colture cellulari precursori di oligodendrociti derivati da cellule staminali neurali fetali e adulte

Riepilogo

Descriviamo la produzione di colture miste di astrociti e cellule precursori di oligodendrociti derivate da cellule staminali neurali fetali o adulte che si differenziano in oligodendrociti maturi e la modellazione in vitro di stimoli nocivi. L'accoppiamento con una tecnica di screening ad alto contenuto basata su cellule costruisce un sistema di screening dei farmaci affidabile e robusto.

Abstract

L'ostacolo principale nello sviluppo di tecniche di screening farmacologico per valutare l'efficacia delle strategie terapeutiche nelle malattie complesse è trovare un equilibrio tra la semplificazione in vitro e la ricreazione del complesso ambiente in vivo, insieme all'obiettivo principale, condiviso da tutte le strategie di screening, di ottenere dati robusti e affidabili, altamente predittivi per la traduzione in vivo.

Nel campo delle malattie demielinizzanti, la maggior parte delle strategie di screening farmacologico si basa su linee cellulari immortalizzate o colture pure di cellule precursori primarie di oligodendrociti (OPC) isolate da animali appena nati, portando a forti pregiudizi dovuti alla mancanza di differenze legate all'età e di qualsiasi condizione patologica o complessità reale.

Qui mostriamo l'impostazione di un sistema in vitro volto a modellare la fisiologica differenziazione/maturazione delle OPC derivate da cellule staminali neurali (NSC), facilmente manipolabili per imitare le condizioni patologiche tipiche delle malattie demielinizzanti. Inoltre, il metodo include l'isolamento dal cervello fetale e adulto, dando un sistema che si differenzia dinamicamente dagli OPC agli oligodendrociti maturi (OL) in una co-coltura spontanea che include anche gli astrociti. Questo modello assomiglia fisiologicamente al processo di mielinizzazione mediata dall'ormone tiroideo e al processo di riparazione della mielina, consentendo l'aggiunta di interferenti patologici che modellano i meccanismi della malattia. Mostriamo come imitare i due componenti principali delle malattie demielinizzanti (cioè ipossia / ischemia e infiammazione), ricreando il loro effetto sulla mielinizzazione dello sviluppo e sulla riparazione della mielina adulta e prendendo in considerazione tutti i componenti cellulari del sistema in tutto, concentrandoci sulla differenziazione delle OPC.

Questo modello misto spontaneo, abbinato a tecnologie di screening ad alto contenuto cellulari, consente lo sviluppo di un sistema di screening farmacologico robusto e affidabile per strategie terapeutiche volte a combattere i processi patologici coinvolti nella demielinizzazione e nell'indurre la rimielinizzazione.

Introduzione

Nel sistema nervoso centrale (SNC), le cellule che formano la mielina (oligodendrociti, OL) e i loro precursori (cellule precursori degli oligodendrociti, OPC) sono responsabili della mielinizzazione dello sviluppo, un processo che si verifica durante i periodi peri- e post-natale, e del turnover e della riparazione della mielina (rimielinizzazione) in età adulta¹. Queste cellule sono altamente specializzate, interagiscono anatomicamente e funzionalmente con tutte le altre componenti gliali e neuronali, rendendole una parte fondamentale della struttura e della funzione del SNC.

Gli eventi demielinizzanti sono coinvolti in diverse lesioni e malattie del SNC²e agiscono principalmente su OPC e OL attraverso meccanismi multifattoriali, sia durante lo sviluppo che in età adulta. I precursori indifferenziati sono guidati da fattori differenzianti, principalmente l'ormone tiroideo (TH), in un processo sincronizzato³ che porta l'OPC a riconoscere e rispondere a stimoli specifici che inducono proliferazione, migrazione verso l'assone non mielinizzato e differenziazione in OL mature che a loro volta sviluppano la guaina mielinica⁴. Tutti questi processi sono finemente controllati e si verificano in un ambiente complesso.

A causa della natura complessa degli eventi di mielinizzazione, rimielinizzazione e demielinizzazione, c'è un grande bisogno di un metodo in vitro semplificato e affidabile per studiare i meccanismi sottostanti e sviluppare nuove strategie terapeutiche, concentrandosi sul principale attore cellulare: l'OPC⁵.

Affinché un sistema in vitro sia affidabile, è necessario prendere in considerazione una serie di fattori: la complessità dell'ambiente cellulare, le differenze intrinseche cellulari legate all'età, la differenziazione fisiologica mediata da TH, i meccanismi patologici e la robustezza dei dati⁶. In effetti, il bisogno insoddisfatto sul campo è un modello che imita la complessità della condizione in vivo, non raggiunta con successo attraverso l'uso di colture OPC pure isolate. Inoltre, le due componenti principali degli eventi demielinizzanti, infiammazione e ipossia/ischemia (HI), coinvolgono direttamente altre componenti cellulari che possono influenzare indirettamente la fisiologica differenziazione e maturazione delle OPC, aspetto che non può essere studiato in modelli in vitro eccessivamente semplificati.

Partendo da un sistema di cultura altamente predittivo, la sfida successiva e più generale è la produzione di dati robusti e affidabili. In questo contesto, lo screening ad alto contenuto cellulare (HCS) è la tecnica più adatta⁷, poiché il nostro obiettivo è in primo luogo analizzare l'intera cultura in un flusso di lavoro automatico, evitando il pregiudizio di scegliere campi rappresentativi e in secondo luogo ottenere la generazione automatica e simultanea di dati ad alto contenuto basati su imaging⁸.

Dato che la necessità principale è quella di raggiungere il miglior equilibrio tra semplificazione in vitro e complessità che imita in vivo, qui presentiamo un metodo altamente riproducibile per ottenere OPC derivate da cellule staminali neurali (NSC) isolate dal proencefalo fetale e dalla zona sub-ventricolare adulta (SVZ). Questo modello in vitro comprende l'intero processo di differenziazione OPC, dal NSC multipotente all'OL maturo/mielinizzante, in modo fisiologico TH-dipendente. La coltura risultante è un sistema dinamicamente differenziante/maturante che si traduce in una co-coltura spontanea costituita principalmente da OPC e astrociti differenzianti, con una bassa percentuale di neuroni. Questa coltura primaria imita meglio il complesso ambiente in vivo, mentre la sua derivazione di cellule staminali consente di eseguire semplici manipolazioni per ottenere l'arricchimento del lignaggio cellulare desiderato.

Al contrario di altre strategie di screening farmacologico che utilizzano linee cellulari o colture pure di OPC primarie, il metodo qui descritto consente lo studio dell'effetto di interferenti patologici o molecole terapeutiche in un ambiente complesso, senza perdere l'attenzione sul tipo di cellula desiderato. Il flusso di lavoro HCS descritto consente un'analisi della vitalità cellulare e delle specifiche di lignaggio, nonché della morte cellulare specifica del lignaggio e dei parametri morfologici.

Protocollo

Tutti i protocolli sugli animali qui descritti sono stati eseguiti secondo le direttive del Consiglio della Comunità Europea (86/609/CEE) e sono conformi alle linee guida pubblicate nella Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Soluzioni e reagenti

1. Preparare il mezzo standard: DMEM / F12 GlutaMAX 1x; 8 mmol/L HEPES; 100 U/100 μg Penicillina/Streptomicina (1% P/S); 1x B27; 1x N-2.
2. Preparare il mezzo della neurosfera: aggiungere 10 ng/mL di bFGF; 10 ng/mL EGF a media standard.
3. Preparare il mezzo oligosfera/OPC: aggiungere 10 ng/mL bFGF; 10 ng/mL PDGF-AA a media standard.
4. Preparare il mezzo di differenziazione oligodendroctye: aggiungere 50 nM T3; 10 ng/mL CNTF; 1x N-acetil-L-cisteina (NAC) al mezzo standard.
5. Preparare il tampone di dissociazione non enzimatico: aggiungere l'1% P/S al tampone di dissociazione non enzimatico e mantenere il ghiaccio freddo.
6. Preparare la soluzione di saccarosio: HBSS, 0,3 g/mL di saccarosio.
7. Preparare la soluzione di lavaggio BSA: EBSS, 40 mg/mL BSA, 0,02 mL/l HEPES.
8. Preparare il tampone di dissociazione enzimatico: HBSS, 5,4 mg/mL D-glucosio, 15 mmol/L HEPES, 1,33 mg/mL di tripsina, 0,7 mg/mL di ialuronidasi, 80 U/mL DNasi.
9. Preparare la miscela di citochine: TGF-β1, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17 e IFN-γ (20 ng / mL ciascuno).
10. Preparare il veicolo della miscela di citochine: 0,04% dello stock (10% glicerolo / 100 nM glicina / 25 nM Tris, pH 7,3).
11. Preparare il mezzo di privazione di ossigeno-glucosio: mezzo standard utilizzando DMEM senza glucosio. A seconda del rigore della condizione di deprivazione del glucosio desiderata, è possibile rimuovere anche B27 e / o N2 dal mezzo per evitare composti correlati al glucosio (ad esempio, D-galattosio in B27).

2. Dissezione e isolamento NSC

NOTA: Le NSC fetali e adulte sono state isolate dal proencefalo fetale E13.5 o dalla zona sub-ventricolare adulta (SVZ) di 2,5 mesi, seguendo il protocollo Ahlenius e Kokaia⁹ con modifiche.

1. Colture NSC fetali
   NOTA: Prima di iniziare le dissezioni, preparare tubi da 1,5 mL contenenti 150 μL di tampone di dissociazione non enzimatico ciascuno; pulire le piastre di Petri e aggiungere HBSS ghiacciato.
   1. Raccogliere gli embrioni a E13.5 - 14.5 da topi gravidi temporizzati e metterli in una capsula di Petri contenente HBSS freddo.
   2. Decapitare gli embrioni usando una pinza.
   3. Posizionare le teste degli embrioni in una capsula di Petri pulita contenente PBS ghiacciato e rimuovere la pelle dal cranio con una pinza, usando lenti d'ingrandimento o uno stereoscopio.
   4. Una volta che il cervello è visibile e ripulito dalla pelle, spremerlo applicando una pressione ai lati con una pinza.
   5. Rimuovere il cervelletto, tenere solo il proencefalo e rimuovere le meningi con una pinza.
   6. Posizionare il tessuto isolato nel tampone di dissociazione non enzimatico e ripetere le fasi di dissezione con gli altri embrioni. Inserire il tessuto di 2-3 animali in ogni tubo contenente il tampone.
   7. Incubare a 37 °C per 15 minuti agitando continuamente.
   8. Dopo l'incubazione, aggiungere 850 μL di mezzo standard e mescolare mediante pipettaggio fino a quando la sospensione non è priva di grumi.
   9. Se il tessuto non dissociato è ancora visibile, attendere 2 minuti a RT fino a quando non si deposita nella parte inferiore del tubo.
   10. Quando la dissociazione è completa, contare le cellule e placcarle in sospensione ad una densità di 10-50 cellule/μL in un pallone T-25 o T-45 contenente 10-30 ml di mezzo della neurosfera, mantenuto in posizione verticale per evitare l'adesione cellulare.
2. Culture NSC adulte
   1. Sacrificare animali da lussazione cervicale.
   2. Raccogli il cervello di 4-5 topi in un tubo da 50 ml contenente HBSS ghiacciato.
   3. Posiziona il cervello su una superficie sterile fredda. A tale scopo, utilizzare un matraccio T-25 riempito d'acqua e posto a -20 °C durante la notte. Al momento dell'esperimento, coprire il pallone con un foglio di alluminio sterile.
   4. Posizionare il lato ventrale del cervello verso il basso, in direzione rostro-caudale, e rimuovere i bulbi olfattivi usando una lama di rasoio.
   5. Usando una lama di rasoio, tagliare 2-3 fette coronali di 1 mm di spessore, dalla corteccia al chiasma ottico.
   6. Posizionare le fette sulla superficie fredda in posizione ventro-dorsale e identificare il corpo calloso e i due ventricoli laterali.
   7. Utilizzando lenti d'ingrandimento o uno stereoscopio, isolare le pareti dei ventricoli laterali, facendo attenzione a non trasportare pezzi del corpo calloso.
   8. Mettere il tessuto isolato nel tampone di dissociazione enzimatico (5-10 ml) e incubare a 37 °C per 15 minuti.
   9. Mescolare la soluzione, pipettando più volte (almeno 50), e incubare nuovamente a 37 °C per 10 minuti.
   10. Neutralizzare la tripsina aggiungendo 5 ml di terreno di coltura standard e filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 70 μm.
   11. Centrifugare la soluzione filtrata per 5 min a 400 x g.
   12. Sospendere il pellet nella soluzione di saccarosio e centrifugare per 10 minuti a 500 x g.
   13. Risospesare il pellet in soluzione di lavaggio BSA e centrifugare per 7 min a 400 x g.
   14. Risospesso il pellet nel terreno di coltura standard, contare le celle ed eseguire la placcatura come descritto sopra (al punto 2.1.10).

3. Neurosfere primarie

1. Aggiungere i fattori di crescita (bFGF/EGF) ogni 2 giorni.
2. Ogni 4-6 giorni (a seconda della densità cellulare), cambiare metà del mezzo come segue:
   1. Trasferire l'intera sospensione cellulare in un tubo da 15 o 50 ml.
   2. Centrifuga per 5 min a 400 x g.
   3. Rimuovere metà del volume.
   4. Aggiungere la stessa quantità di mezzo fresco, mescolare delicatamente mediante pipettaggio e aggiungere fattori di crescita.

4. Oligosfere

NOTA: La differenziazione degli oligodendrociti viene eseguita seguendo il protocollo Chen¹⁰ con modifiche.

1. Quando le neurosfere raggiungono un diametro di 100-150 μm, sono pronte per essere passate. Per fare ciò, trasferire l'intera sospensione cellulare in un tubo da 15 o 50 ml e centrifugare per 5 minuti a 400 x g.
   1. Valuta rapidamente il diametro scattando foto delle sfere utilizzando un microscopio a luce trasmessa invertita e aprendole tramite il software ImageJ.
   2. Fare clic sul menu Analizza e dalla finestra Strumenti selezionare Barra scala.
   3. Impostare 150 μm come Larghezza in micron e confrontare la barra della scala con le sfere.
2. Rimuovere l'intero volume per inversione e risospesciare il pellet in 180 μL di terreno di coltura standard fresco. Pipetta 50 volte per consentire la disaggregazione delle sfere.
3. Aggiungere 810 μL di terreno di coltura standard fresco, contare le cellule e ripiazionarle come descritto per le neurosfere.
4. Aggiungere bFGF/PDGF-AA 10 ng/mL ogni 2 giorni.
5. Ogni 4-6 giorni (a seconda della densità cellulare), cambiare metà del mezzo come segue:
6. Trasferire l'intera sospensione cellulare in un tubo da 15 o 50 ml.
7. Centrifuga per 5 min a 400 x g.
8. Rimuovere metà del volume.
9. Aggiungere la stessa quantità di mezzo fresco, mescolare delicatamente mediante pipettaggio e aggiungere fattori di crescita.

5. Rivestimento della piastra

1. Rivestimento Poly-D,L-ornitina/laminina: almeno 2 giorni prima della placcatura degli OPC, aggiungere 50 μg/mL di soluzione poli-D,L-ornitina, diluita in PBS, in ciascun pozzetto (40 μL/pozzetto per piastre a 96 pozzetti) e incubare a RT durante la notte.
2. Il giorno seguente, rimuovere il liquido e lavare tre volte con acqua sterile distillata.
3. Lasciare asciugare le piastre a RT durante la notte. Il giorno seguente, aggiungere una soluzione di laminina diluita in PBS (5 μg/mL; 40 μL/pozzetto per piastre a 96 pozzetti) e incubare per 2 ore a 37 °C.

6. Semina cellulare

1. Quando le oligosfere raggiungono un diametro di 100-150 μm, sono pronte per essere dissociate e seminate sulle piastre rivestite di poli-D, L-ornitina/laminina. Per fare ciò, trasferire l'intera sospensione cellulare in un tubo da 15 o 50 ml e centrifugare per 5 minuti a 400 x g (come indicato al punto 4.1)
2. Rimuovere l'intero volume per inversione e risospesciare il pellet in 180 μL di terreno di coltura standard fresco. Pipetta 50 volte per consentire la disaggregazione delle sfere.
3. Aggiungere 810 μL di terreno di coltura standard fresco e contare le cellule.
4. Rimuovere la soluzione di laminina dai pozzetti e placcare le celle a 3.000 celle/cm² di densità (100 μL/pozzetto per piastre a 96 pozzetti).

7. Induzione della differenziazione OPC

1. Dopo 3 giorni, rimuovere l'intero mezzo e aggiungere lo stesso volume di mezzo di differenziazione degli oligodendrociti.
2. Cambiare metà del mezzo ogni 4 giorni e aggiungere una miscela di differenziazione fresca (T3 / CNTF / NAC) ogni 2 giorni.

8. Induzione del blocco di differenziazione mediato dall'infiammazione

1. Dopo la dissociazione della neurosfera e la produzione di oligosfere (sezione 4), aggiungere la miscela di citochine al terreno di coltura e mantenere le oligosfere esposte alle citochine per l'intera fase di formazione delle sfere.
   NOTA: Il volume dipende dal numero di cellule, poiché per le sfere che formano le cellule vengono seminate a 10-50 cellule / μL.
2. Se il mezzo deve essere cambiato, cambiare l'intero volume e aggiungere nuovamente la miscela di citochine.

9. Induzione della morte cellulare di privazione di ossigeno-glucosio

1. A -1 DIV (2 giorni dopo la semina cellulare in piastre multiwell), rimuovere il mezzo e conservarlo in una nuova piastra multiwell.
2. Aggiungere metà del volume (50 μL per piastre a 96 pozzetti) di OGD-medium (gruppo OGD) o fresco (gruppo di controllo). La mezza quantità di volume viene utilizzata per ridurre lo scambio di ossigeno tra il liquido e l'aria.
3. Posizionare le colture del gruppo OGD in una camera di ipossia ermetica satura di 95% N₂ e 5% CO₂. Per ottenere la saturazione della camera, lasciare scorrere la miscela di gas per 6 minuti a 25 l / min prima di chiudere i tubi della camera.
4. Incubare la camera ipossica nell'incubatrice per 3 ore. Anche il gruppo di controllo e le piastre contenenti il mezzo rimosso e conservato al punto 9.1 devono essere lasciati nell'incubatrice.
5. Rimuovere il mezzo senza glucosio (gruppo OGD) o il nuovo mezzo (gruppo di controllo) e aggiungere il mezzo rimosso e conservato al punto 9.1.

10. Immunocitochimica

1. Nel punto temporale desiderato, fissare le cellule con paraformaldeide fredda al 4% per 20 minuti a RT.
2. Lavare due volte con PBS (10 minuti di incubazione per ogni lavaggio a RT).
3. Incubare 1 ora a RT con la soluzione bloccante (PBS Triton 0,3% contenente 1% BSA e 1% asino/capra siero normale).
4. Incubare con miscela di anticorpi primari (Tabella 1), diluito in PBS tritone 0,3%, durante la notte a 4 °C.
5. Lavare due volte con PBS (10 minuti di incubazione per ogni lavaggio a RT).
6. Incubare con anticorpo secondario (Tabella 1) soluzione diluita in PBS tritone 0,3% aggiungendo Hoechst 33258 per 30 minuti a 37 °C.
7. Lavare due volte con PBS (10 minuti di incubazione per ogni lavaggio a RT).

11. Analisi HCS della vitalità cellulare, della composizione del lignaggio e della morte cellulare specifica del lignaggio

NOTA: le immagini rappresentative HCS e il flusso di lavoro sono illustrati nella Figura 2A,B.

1. Selezionare l'algoritmo di analisi compartimentale dal menu principale del software (HCS Studio v 6.6.0) e selezionare Scansione dal menu principale Sviluppa test/piastra di scansione.
2. Nella finestra iDev, selezionare Nuovo, quindi strumento di misurazione generale dell'intensità dal modello Sviluppa test.
3. Fai clic su Crea sul lato destro del menu, selezionando l'obiettivo 10x.
4. Si aprirà il menu Configura acquisizione. In questa finestra, selezionare i seguenti parametri: (a) numero di canali: il primo per la colorazione nucleare di Hoechst (BGRFR_386) e uno per ogni marcatore specifico del lignaggio utilizzato nella reazione (b) selezionare la messa a fuoco del software sul canale 1 e l'intervallo di messa a fuoco automatica come 1 (c) selezionare il modello di piastra dall'elenco.
5. Dal menu di acquisizione, guarda la qualità della colorazione in diversi pozzi e campi diversi e seleziona manualmente il tempo di esposizione selezionando Tempo di esposizione fisso nel menu.
6. Una volta impostati i parametri di acquisizione, selezionare Mini Scansione nella parte superiore del menu e selezionare dieci campi per pozzetto in due pozzetti per condizione sperimentale. Ciò consentirà l'impostazione di tutti i parametri di analisi in un sottoinsieme di campi per l'intera piastra.
7. Al termine della mini scansione, fare clic su Configura parametro di analisi per configurare l'algoritmo dell'analisi.
8. Fare clic su Configura gruppi sul lato destro della finestra e trascinare e rilasciare i pozzetti del miniscan. Fare clic sul pulsante Aggiungi nella sottosezione Gruppi per configurare i diversi gruppi.
9. Segui il flusso di lavoro sul lato sinistro della finestra passo dopo passo per sviluppare l'intero algoritmo. Per prima cosa seleziona Elabora immagine per ogni canale e fai clic su Rimozione sfondo e sul livello desiderato.
10. Per prima cosa identificare e selezionare i nuclei mediante colorazione nucleare. Fare clic su Identifica oggetto primario - Canale 1 per selezionare i nuclei reali ed evitare di analizzare artefatti e detriti. A tale scopo, ingrandire un'immagine rappresentativa della colorazione nucleare e verificare se i nuclei sono ben circondati dal perimetro costruito dal software. È possibile modificare il valore di soglia e applicare algoritmi di segmentazione per identificare meglio i singoli nuclei.
11. Una volta definiti correttamente i nuclei, fare clic sul seguente passaggio: Convalida oggetto primario. Selezionare Object.BorderObject.Ch1 per evitare l'analisi dei nuclei sul bordo di ogni immagine di campo. Selezionare Object.Area.Ch1 e, spostando le barre "bassa" e "alta" sugli istogrammi, rimuovere tutti i detriti o gli oggetti di grandi dimensioni identificati corrispondenti ad aggregati o artefatti.
12. Controlla tutte le immagini rappresentative della mini scansione di tutte le condizioni sperimentali per essere sicuro che i parametri selezionati si adattino a tutte loro.
13. Fare clic su Identifica punti per ciascun canale corrispondente ai marcatori di lignaggio specifici e selezionare i valori dell'anello: Larghezza = 3 e Distanza = 0. Ciò consentirà l'identificazione della fluorescenza citoplasmatica. In base alla densità cellulare, questi valori possono essere adattati. Il software eviterà automaticamente la sovrapposizione tra anelli adiacenti.
14. Selezionare Livelli di riferimento nel flusso di lavoro per compilare l'analisi. L'impostazione dei livelli di riferimento consentirà il conteggio automatico dei nuclei condensati, in base alla dimensione nucleare e all'intensità della colorazione nucleare, e di specifiche cellule marker-positive, in base alla fluorescenza citoplasmatica identificata dall'Anello.
15. Per prima cosa clicca su Object.Area.Ch1. Nelle immagini di mini scansione, selezionare un nucleo condensato e spostare la barra "LOW" sugli istogrammi per selezionare come "condensati" tutti i nuclei sotto questa dimensione.
16. Fare clic su Object.AvgIntensity.Ch1. Nelle immagini di mini scansione, selezionare un nucleo condensato e spostare la barra "HIGH" sugli istogrammi per selezionare come "condensati" tutti i nuclei al di sopra di questa intensità di fluorescenza.
17. Fare clic su Object.RingAvgIntensity per ogni canale di marcatori specifici di lignaggio. Seleziona nelle tue immagini di mini scansione una cella positiva e sposta la barra "HIGH" sugli istogrammi per selezionare come "positive" tutte le cellule al di sopra di questa intensità di fluorescenza.
18. Controlla tutte le immagini rappresentative della mini scansione di tutte le condizioni sperimentali per essere sicuro che i parametri selezionati si adattino a tutte loro.
19. Nel menu in alto, selezionare Caratterizzazione popolazione e selezionare Sottopopolazione evento.
20. Come evento di tipo 1, selezionare ObjectAreaCh1 nell'elenco a sinistra, quindi fare clic sul pulsante AND > e infine selezionare ObjectAvgIntensityCh1. Ciò consentirà l'identificazione di nuclei condensati, come combinazione di area bassa e alta intensità.
21. Nella stessa finestra, deselezionare tutti i limiti di scansione.
22. Fate clic su Seleziona feature da memorizzare nel menu in alto per scegliere i parametri da mantenere nell'analisi.
23. Selezionare Feature pozzo e spostare dall'elenco di sinistra a quello destro solo i parametri desiderati: (a) SelectedObjectCountPErValidField (b) %EventType1ObjectCount (c) %High_RingAvgIntensity (per ogni canale dei marcatori di derivazione specifici).
    NOTA: Questa analisi fornirà come lettura il numero totale di cellule, la percentuale di nuclei condensati e la percentuale di cellule positive specifiche del lignaggio per ciascun marcatore analizzato sul numero totale di cellule. Se la percentuale dei diversi lignaggi è necessaria solo su cellule vive, è possibile mantenere il valore "High_RingAvgIntensity" per il canale (numero assoluto di cellule positive) e ricalcolare la percentuale sul numero totale di cellule dopo la sottrazione della percentuale di cellule morte.
    1. In alternativa, è possibile rimuovere le cellule morte dall'analisi impostando gli stessi parametri utilizzati per identificare i nuclei condensati (passi 11.14–11.15) sulla validazione dei nuclei (passo 11.11).
24. Selezionare Scan Plate dal menu principale in alto e fare clic sul simbolo della piastra nel sottomenu Impostazioni scansione nella sezione superiore per identificare il pozzo da analizzare.
25. Scrivi il nome dell'esperimento e la descrizione e, una volta completate tutte le impostazioni, premi il simbolo di riproduzione.

Risultati

La prima fase della coltura può variare nella durata, a seconda della densità di semina e del fatto che le sfere siano di origine fetale o adulta. Inoltre, le oligosfere mostrano un raddoppio della popolazione ridotto rispetto alle neurosfere (Figura 1B). Inoltre, la produzione di sfere da tessuto adulto è più lenta e possono essere necessarie 2-3 settimane per generare oligosfere rispetto a quelle fetali che possono richiedere 1-2 settimane, a seconda della densità di semina.

Discussione

La natura complessa dei processi di mielinizzazione/rimielinizzazione e degli eventi demielinizzanti rende estremamente impegnativo lo sviluppo di sistemi predittivi in vitro. I sistemi di screening farmacologico in vitro più utilizzati sono per lo più linee cellulari umane o colture PRIMARIE di OL puro, con un uso crescente di co-colture più complesse o sistemi organotipici¹⁵. Anche se tali sistemi sono accoppiati con tecnologie ad alto contenuto, le colture OL pure rimangono il metodo di scel...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates - untreated	NUNC	267313
B27 supplement (100x)	GIBCO	17504-044
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	GIBCO	PHG0024
BSA	Sigma-Aldrich	A2153
Ciliary Neurotropic Factor (CNTF)	GIBCO	PHC7015
DMEM w/o glucose	GIBCO	A14430-01
DMEM/F12 GlutaMAX	GIBCO	31331-028
DNase	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
EBSS	GIBCO	14155-048
Epidermal Growth Factor (EGF)	GIBCO	PHG6045
HBSS	GIBCO	14170-088
HEPES	GIBCO	15630-056
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884
IFN-γ	Origene	TP721239
IL-17A	Origene	TP723199
IL-1β	Origene	TP723210
IL-6	Origene	TP723240
laminin	GIBCO	23017-051
N-acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A9165
N2 supplement (50x)	GIBCO	17502-048
Non-enzymatic dissociation buffer	GIBCO	13150-016
PBS	GIBCO	70011-036
Penicillin / Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA)	GIBCO	PHG0035
poly-D,L-ornitine	Sigma-Aldrich	P4957
TGF-β1	Origene	TP720760
TNF-α	Origene	TP723451
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752-1G
Trypsin	Sigma-Aldrich	T1426